劉冬峰 林紹生 陳 巍 朱祝軍 宋 洋 郭秀珠 李發(fā)勇

(1浙江省亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325005；2江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 句容 212400，3 浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 臨安 311300)

裂果是柚果實(shí)發(fā)育過(guò)程中重要的生理病害，主要分外裂和內(nèi)裂兩種類型[1]。外裂是從果頂開(kāi)始沿果實(shí)縱向由外向內(nèi)開(kāi)裂，開(kāi)裂果實(shí)裂口較大，喪失商品性；內(nèi)裂是果實(shí)囊瓣在腹線處開(kāi)裂，主要是種子敗育后果皮、囊瓣、中心柱生長(zhǎng)不協(xié)調(diào)導(dǎo)致，內(nèi)裂果實(shí)外觀表現(xiàn)正常，但易枯水?；痆2-3]。前人關(guān)于多種果實(shí)的研究表明，裂果與果肉、果皮中的代謝物含量變化密切相關(guān)。隨著果實(shí)發(fā)育，果肉中可溶性糖、有機(jī)酸等物質(zhì)含量增加，果肉薄壁細(xì)胞滲透勢(shì)降低、吸水能力增強(qiáng)[4-6]，而果皮中不溶性果膠逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄怨z使果皮韌性降低[7-8]，果肉、果皮生長(zhǎng)不協(xié)調(diào)導(dǎo)致裂果[9-11]。

異花授粉是減輕柚裂果的有效措施，其作用機(jī)制可能與花粉直感效應(yīng)有關(guān)[12-13]。異花授粉后，由于花粉直感現(xiàn)象，雜交當(dāng)代果實(shí)在生長(zhǎng)發(fā)育和品質(zhì)形成過(guò)程中發(fā)生明顯變異[14-16]。柑橘果實(shí)形狀、果皮厚度、種子數(shù)量及可溶性糖、有機(jī)酸、揮發(fā)性物質(zhì)等內(nèi)在品質(zhì)性狀均表現(xiàn)明顯的花粉直感效應(yīng)[17-19]。種子是花粉直感效應(yīng)的重要載體，前人研究認(rèn)為父本花粉可通過(guò)種子影響果實(shí)組織從而引起果實(shí)性狀變異，種子合成的內(nèi)源激素、多胺等物質(zhì)可調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和果實(shí)發(fā)育過(guò)程，起到提高庫(kù)容、促進(jìn)果實(shí)生長(zhǎng)的作用[20]。柚異花授粉后產(chǎn)生大量飽滿種子，有研究認(rèn)為大量種子排列在中心柱周圍，能夠緩沖汁胞發(fā)育產(chǎn)生的膨壓，起到保護(hù)中心柱的物理性作用，從而減輕果實(shí)內(nèi)裂[21]。但柚異花授粉果實(shí)種子數(shù)較多，導(dǎo)致商品性下降，而種子產(chǎn)生的內(nèi)源物質(zhì)對(duì)中心柱和汁胞發(fā)育的影響，以及汁胞代謝變化與果實(shí)內(nèi)裂的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。本研究分析了早香柚果實(shí)種子數(shù)與內(nèi)裂的關(guān)系，利用氣相色 譜 -質(zhì) 譜 技 術(shù) ( gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)測(cè)定早香柚無(wú)籽內(nèi)裂果實(shí)和多籽不內(nèi)裂果實(shí)汁胞代謝組，從代謝組水平分析異花授粉對(duì)柚果實(shí)汁胞代謝產(chǎn)物的影響，以期為研究柚內(nèi)裂發(fā)生機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)在浙江省永嘉縣碧蓮鎮(zhèn)早香柚中心產(chǎn)區(qū)開(kāi)展，樹(shù)齡25年，處于穩(wěn)定結(jié)果期?；ǚ蹃?lái)自當(dāng)?shù)胤N植的琯溪蜜柚，采集大蕾期花朵的花藥，利用白熾燈烘烤干燥的方法收集花粉。開(kāi)花期，選取8 株正常早香柚結(jié)果樹(shù)，其中4 株進(jìn)行異花授粉，另外4 株疏花后直接套袋作為對(duì)照。第二次生理落果后去除套袋，之后田間常規(guī)管理。根據(jù)前期研究結(jié)果，早香柚未授粉果實(shí)裂瓣在盛花后105 d 及其后1 個(gè)月內(nèi)發(fā)生并結(jié)束[22]，即8月中下旬至9月上旬為早香柚果實(shí)內(nèi)裂發(fā)生期。因此于早香柚內(nèi)裂起始期(8月20日)采集自花授粉的無(wú)籽內(nèi)裂果實(shí)和異花授粉的多籽不內(nèi)裂果實(shí)，采用GC-MS 方法檢測(cè)代謝產(chǎn)物，每個(gè)處理測(cè)定8 個(gè)樣本，分析兩組樣本的代謝產(chǎn)物差異。果實(shí)成熟后，采集自花授粉和異花授粉果實(shí)各100 個(gè)，自花授粉的無(wú)籽果實(shí)橫切后統(tǒng)計(jì)果實(shí)裂瓣數(shù)，剝?nèi)‘惢ㄊ诜酃麑?shí)的飽滿種子，統(tǒng)計(jì)異花授粉果實(shí)種子數(shù)，并分析其與果實(shí)內(nèi)裂的關(guān)系。

1.2 樣本制備

代謝組樣品制備參照Lisec 等[23]的方法，稱取液氮研磨的果肉粉末30 mg 于1.2 mL 預(yù)冷甲醇中，渦旋10 s。加入60 μL 核糖醇(0.2 g·L-1)作為內(nèi)標(biāo)，渦旋10 s，70℃超聲提取30 min。11 000×g離心10 min，取1 mL 上清液于離心管中，加入0.75 mL 氯仿(-20℃預(yù)冷)和1.5 mL 蒸餾水(4℃預(yù)冷)，渦旋30 s，3 000 ×g離心15 min。取上清液400 μL 于離心管中，氮?dú)獯蹈?。加?0 μL 15 g·L-1甲氧基吡啶溶液，室溫反應(yīng)16 h，然后加入50 μL N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氯乙酰胺(含1%三甲基氯硅烷)，室溫反應(yīng)60 min，再于10 000×g條件下離心10 min。最后取90 μL 上清液進(jìn)樣，檢測(cè)設(shè)備為Agilent 7890A/5975C 氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent 公司)，色譜柱為HP-5 MS 毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

1.3 GC/MS 分析

氣相色譜條件:分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1.0 μL，分流比10 ∶1。進(jìn)樣口溫度280℃，離子源溫度250℃，接口溫度150℃。程序升溫，起始溫度40℃，保持6 min，以10℃·min-1升至300℃，保持6 min。載氣為氦氣，載氣流速1.0 mL·min-1。質(zhì)譜條件:電噴霧電離(ESI)源，電子能量為70 eV，全方式掃描，四級(jí)桿掃描范圍m/z 35～780。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將原始GC/MS 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成CDF 格式(Net Channel Definition Format)，利用XCMS 程序(www.bioconductor.org/)進(jìn)行峰識(shí)別、峰過(guò)濾、峰對(duì)齊，通過(guò)手動(dòng)提取任意質(zhì)量色譜峰進(jìn)行驗(yàn)證并確定XCMS 參數(shù)，除默認(rèn)參數(shù)外還進(jìn)行了如下調(diào)整:xcmsSet (fwhm=3，snthresh=3，mzdiff=0.5，step=0.1，steps=2，max=300)，retcor [method = obiwarp，plottype = c(deviation)]，bandwidth=2，minfrac=0.3。利用總和標(biāo)準(zhǔn)比(www.metaboanalyst.ca)方法對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。對(duì)獲得的保留時(shí)間(retention time)、質(zhì)核比(m/z)、峰強(qiáng)(intensity)等信息的數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行代謝物注釋，注釋所用數(shù)據(jù)庫(kù)為NIST 商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)(NIST 2008)和Golm Metabolome Database(GMD)，大量物質(zhì)由于信號(hào)低或沒(méi)有數(shù)據(jù)庫(kù)收錄沒(méi)被注釋到。利用Simca-P 11.0 軟件進(jìn)行主成分分析( principal component analysis，PCA)和偏最小二乘方-判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)，根據(jù)PLS-DA 變量對(duì)分組貢獻(xiàn)值(variable importance in the projection，VIP)大小(閾值＞1)和組間變化的顯著性(P＜0.05)篩選顯著差異代謝物，并進(jìn)行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)化合物和代謝途徑注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 早香柚果實(shí)種子數(shù)與內(nèi)裂的關(guān)系

果實(shí)成熟期，調(diào)查種子數(shù)與果實(shí)內(nèi)裂的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)自花授粉的無(wú)籽果實(shí)全部?jī)?nèi)裂，異花授粉果實(shí)內(nèi)裂率與種子數(shù)量有關(guān)。異花授粉果實(shí)種子數(shù)介于11 ～115粒之間，平均種子數(shù)為55 粒/果，種子數(shù)少于30 粒時(shí)內(nèi)裂率為100%，高于80 粒時(shí)中心柱充實(shí)、不內(nèi)裂，大部分異花授粉果實(shí)的種子數(shù)介于30 ～80 粒之間，所占比例為72.0%，其中內(nèi)裂率為51.4%(圖1)。早香柚自花授粉果實(shí)的裂瓣數(shù)多為2、3 瓣，占內(nèi)裂果實(shí)的57.2%，其次為1、4 瓣，裂瓣數(shù)超過(guò)5 瓣的果實(shí)較少(圖2)，且裂瓣多處于對(duì)稱位置，說(shuō)明果實(shí)橫向生長(zhǎng)拉力是果實(shí)中心柱開(kāi)裂的直接原因。

2.2 GC-MS 數(shù)據(jù)多元變量分析

圖1 早香柚異花授粉果實(shí)種子數(shù)與內(nèi)裂的關(guān)系Fig.1 The relationship between seed numbers and fruit inner-cracking in cross-pollinated Zaoxiang pomelo

圖2 早香柚自花授粉果實(shí)裂瓣數(shù)Fig.2 The number of cracked-segments in self-pollinated Zaoxiang pomelo

利用Simca-P 11.0 軟件對(duì)所有樣本采用PCA 進(jìn)行無(wú)監(jiān)督的數(shù)據(jù)分析，樣品分型前首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單位方差縮放(unit variance scaling，UV)，以獲得更加可靠直觀的效果。如PCA 得分圖(圖3-a)所示，所有樣本均處于95%置信區(qū)間內(nèi)，說(shuō)明模型可用于數(shù)據(jù)分析。為篩選組間差異代謝物，用PLS-DA 進(jìn)行有監(jiān)督的數(shù)據(jù)分析，并對(duì)模型的質(zhì)量用交叉驗(yàn)證法進(jìn)行檢驗(yàn)，交叉驗(yàn)證后得到的R2X(模型可解釋的變量)和Q2(模型的可預(yù)測(cè)度)對(duì)模型有效性進(jìn)行評(píng)判。如PLS-DA 得分圖(圖3-b)所示，PLS-DA 模型可以很好地解釋兩組樣本間的差異。對(duì)PLS-DA 模型進(jìn)行置換檢驗(yàn)(permutation test)驗(yàn)證模型是否過(guò)度擬合，得到PLS-DA 置換檢驗(yàn)圖，100 次驗(yàn)證結(jié)果顯示，R2 在Y 軸上的截距為0.343，Q2 在Y 軸上的截距為-0.289(圖4)。從各組的模型預(yù)測(cè)參數(shù)的R2X、R2Y、Q2Y 來(lái)看，上述評(píng)估模型是有效、可靠的，可用于差異變量篩選。

2.3 早香柚果實(shí)內(nèi)裂起始期代謝產(chǎn)物的鑒定

圖3 PCA 得分圖和PLS-DA 得分圖Fig.3 PCA score plot and PLS-DA score plot

圖4 PLS-DA 模型的置換檢驗(yàn)圖Fig.4 PLS-DA permutation test graph

根據(jù)保留時(shí)間、質(zhì)核比和峰強(qiáng)矩陣進(jìn)行代謝產(chǎn)物注釋，共鑒定到66 種代謝物，包括10 種氨基酸、29 種有機(jī)酸、17 種糖類物質(zhì)、8 種含氮化合物和2種其他物質(zhì)(表1)。在檢測(cè)到的333 個(gè)目標(biāo)化合物中，大量物質(zhì)由于信號(hào)低或數(shù)據(jù)庫(kù)未收錄而沒(méi)有注釋到。采用PLS-DA 模型第一主成分的VIP 值(閾值＞1)結(jié)合S-plot 和t 檢驗(yàn)的P值(P＜0.05)尋找差異代謝物。

2.4 異花授粉對(duì)早香柚果實(shí)代謝產(chǎn)物的影響

由表2 可知，果實(shí)內(nèi)裂起始期，在異花授粉果實(shí)中鑒定到12 種顯著差異的代謝產(chǎn)物，包括7 種有機(jī)酸(奎寧酸、琥珀酸、檸康酸等)、3 種含氮化合物(2-咪唑烷酮-4-羧酸、2-硫代巴比妥酸和2-羥基吡啶)和2種糖類物質(zhì)(阿拉伯糖和山梨醇)，其中阿拉伯糖和2-咪唑烷酮-4-羧酸含量顯著上升，奎寧酸、山梨醇等10種代謝物含量顯著下降。

表1 早香柚果實(shí)內(nèi)裂起始期代謝產(chǎn)物鑒定結(jié)果Table 1 Identified metabolites from Zaoxiang pomelo during initiation period of inner-cracking

表1(續(xù))

表2 早香柚異花授粉果實(shí)中顯著差異代謝物Table 2 Matebolites with significant difference in cross-pollinated Zaoxiang pomelo

2.5 異花授粉對(duì)早香柚果實(shí)代謝途徑的影響

從外觀上看，種子有無(wú)及多少是早香柚果實(shí)內(nèi)裂的重要影響因素。代謝物含量分析結(jié)果表明，異花授粉后果實(shí)中多個(gè)代謝途徑發(fā)生變化(圖5)。在鑒定到的10 種氨基酸中，9 種為呈味氨基酸[24]，包括5 種甜味氨基酸、3 種酸味氨基酸和1 種苦味氨基酸，其中甜味和苦味氨基酸的含量均有所增加，3 種酸味氨基酸中天冬氨酸和天冬酰胺含量增加、谷氨酸含量降低。在鑒定到的29 種有機(jī)酸物質(zhì)中，4 種有機(jī)酸參與莽草酸途徑及其下游次生代謝過(guò)程，4 種有機(jī)酸富集在三羧酸循環(huán)代謝通路上，其他大部分有機(jī)酸，包括還原糖氧化生成的糖酸、長(zhǎng)鏈脂肪酸等含量有所增加。異花授粉后果實(shí)糖代謝也發(fā)生變化，蔗糖、果糖和葡萄糖3種主要糖分的含量下降，阿拉伯糖、甘露糖、蔗果三糖、核糖等含量有所增加。此外，在有籽果實(shí)中還發(fā)現(xiàn)腐胺、乙醇胺、碳二亞胺、咪唑衍生物、吡咯啉衍生物等含氮化合物含量增加。

圖5 異花授粉對(duì)早香柚果實(shí)代謝通路的影響Fig.5 The changes of main metabolic pathways in cross-pollinated Zaoxiang pomelo

3 討論

有些文旦系列柚類品種具有自交不親和、單性結(jié)實(shí)能力強(qiáng)的特性，所結(jié)的無(wú)籽果實(shí)存在較為嚴(yán)重的果實(shí)外裂或內(nèi)裂問(wèn)題。前期研究發(fā)現(xiàn)早香柚自花授粉的無(wú)籽果實(shí)幾乎全部?jī)?nèi)裂，而異花授粉的有籽果實(shí)內(nèi)裂指數(shù)顯著下降[22]，但受花期天氣及人工授粉技術(shù)的影響，授粉受精不良、果實(shí)種子數(shù)較少的果實(shí)內(nèi)裂現(xiàn)象仍然比較嚴(yán)重。本研究發(fā)現(xiàn)，早香柚果實(shí)內(nèi)裂與種子有無(wú)及多少密切相關(guān)，低于30 粒時(shí)內(nèi)裂率為100%，超過(guò)80 粒時(shí)果實(shí)中心柱充實(shí)、不內(nèi)裂，大部分異花授粉果實(shí)的種子數(shù)介于30 ～80 粒之間，其中內(nèi)裂果實(shí)占51.4%。

有研究認(rèn)為裂果與果肉、果皮生長(zhǎng)不協(xié)調(diào)有關(guān)[9]。柚果實(shí)發(fā)育過(guò)程中果肉和果皮生長(zhǎng)不同步進(jìn)行，前期以果皮發(fā)育為主，玉環(huán)柚在7月中旬果皮厚度達(dá)到最大，此時(shí)果肉僅占總體積的3%～5%，之后果肉發(fā)育加快，果皮被壓縮變薄，9月下旬果實(shí)縱向生長(zhǎng)基本停止，而橫徑繼續(xù)擴(kuò)大導(dǎo)致中心柱開(kāi)裂[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，早香柚自花授粉果實(shí)裂瓣數(shù)多為2、3 瓣，且裂瓣多處于對(duì)稱位置，表明果實(shí)縱向生長(zhǎng)緩慢后果實(shí)橫向生長(zhǎng)拉力是果實(shí)中心柱開(kāi)裂的直接原因，而在異花授粉果實(shí)中，大量飽滿種子排列在中心柱周圍，可緩沖果實(shí)橫向生長(zhǎng)拉力，使果實(shí)內(nèi)裂率降低，這是種子在減輕果實(shí)內(nèi)裂上發(fā)揮的物理性作用。

在代謝水平上，異花授粉后種子產(chǎn)生的激素、多胺等內(nèi)源物質(zhì)可調(diào)控果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。沙田柚異花授粉后果實(shí)中生長(zhǎng)促進(jìn)類激素和多胺含量顯著增加[25-26]，本研究利用GC-MS 非靶向代謝組方法未檢測(cè)到內(nèi)源激素，但發(fā)現(xiàn)異花授粉果實(shí)中腐胺含量增加。大量研究表明，多胺可促進(jìn)幼果細(xì)胞分裂，與果實(shí)膨大密切相關(guān)[27]。本研究結(jié)果表明，早香柚異花授粉后果實(shí)內(nèi)裂率降低，除種子起到保護(hù)中心柱的物理性作用外，可能還與多胺促進(jìn)細(xì)胞分裂使中心柱發(fā)育充實(shí)有關(guān)。

前人研究表明，異花授粉后果實(shí)中可溶性糖、有機(jī)酸、油脂、蛋白、維生素、揮發(fā)性物質(zhì)以及木質(zhì)素等物質(zhì)的含量及組分發(fā)生變化，直接影響果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)[19，28-29]。本研究中，早香柚異花授粉后汁胞中可溶性糖、有機(jī)酸和氨基酸含量均發(fā)生變化，這些物質(zhì)含量的變化不僅直接影響果實(shí)風(fēng)味，還能作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)參與果肉汁胞發(fā)育，這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量變化可能與果實(shí)膨大和內(nèi)裂有關(guān)。除初級(jí)代謝外，異花授粉產(chǎn)生的大量種子中還含有多種次生代謝物質(zhì)，包括類檸檬苦素、生物堿、酚酸、類黃酮等[30-31]，這些生物活性物質(zhì)的合成大多與莽草酸代謝途徑有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，早香柚異花授粉后果實(shí)中莽草酸、芥子酸、奎寧酸和苯甲酸含量降低，表明異花授粉后果實(shí)中莽草酸途徑及其下游的次生代謝發(fā)生變化，但這些代謝變化與果實(shí)內(nèi)裂及果實(shí)品質(zhì)形成的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，早香柚果實(shí)內(nèi)裂與種子有無(wú)及多少密切相關(guān)；果實(shí)縱向生長(zhǎng)緩慢后，果實(shí)橫向生長(zhǎng)拉力是中心柱開(kāi)裂的直接原因；異花授粉后，種子不僅具有保護(hù)中心柱的物理作用，還可通過(guò)激素、多胺等內(nèi)源物質(zhì)調(diào)控汁胞可溶性糖、有機(jī)酸、氨基酸以及莽草酸途徑及其下游次生代謝過(guò)程，使果實(shí)在外觀和風(fēng)味性狀上表現(xiàn)明顯的花粉直感效應(yīng)，其中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量變化可能與果實(shí)膨大和內(nèi)裂有關(guān)。本研究為異花授粉在柚生產(chǎn)中的合理應(yīng)用以及進(jìn)一步研究柚果實(shí)內(nèi)裂調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。