（青島大學(xué)附屬醫(yī)院 肝病中心，山東 青島 266000）

膽管癌（cholangiocarcinoma，CCA）是一種起源于膽道上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，根據(jù)其解剖起源位置可分為肝內(nèi)CCA、肝門(mén)部CCA和遠(yuǎn)端CCA[1]。手術(shù)切除仍然是CCA唯一可能治愈的方法。由于缺乏早期診斷的生物標(biāo)志物，只有1/3的患者有機(jī)會(huì)手術(shù)，大多數(shù)患者通常被診斷時(shí)已接近晚期[2]，且術(shù)后2年內(nèi)CCA患者復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的幾率仍較高[3]。此外，據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)CCA的發(fā)病率和病死率正逐年上升[4-5]。

DNA甲基化是一種核心的表觀(guān)遺傳修飾，在細(xì)胞過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，如基因組調(diào)控、機(jī)體發(fā)育和疾病發(fā)生[6]。近年來(lái)DNA甲基化模式的失調(diào)越來(lái)越被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的起始和晚期的一個(gè)重要基因事件[7]。大量的研究已經(jīng)證明抑癌基因的高甲基化和癌基因的全局低甲基化在癌癥的發(fā)生和進(jìn)展中，包括在CCA中起著至關(guān)重要的作用[8]。Chen等[9]發(fā)現(xiàn)，O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）啟動(dòng)子高度甲基化，MGMT表達(dá)水平與CCA總生存率和組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)。此外，GATA-5、ANGPTL4和DLEC1的異常甲基化已被證實(shí)參與CCA的發(fā)生和發(fā)展[10-12]。盡管在CCA中發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)具有特異性的低甲基化或高甲基化基因，但是基于這些基因的甲基化譜和相關(guān)通路的綜合網(wǎng)絡(luò)研究還不夠深入。基因圖譜和下一代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成為癌癥研究不可或缺的工具，其可以檢測(cè)癌癥相關(guān)的遺傳和表觀(guān)遺傳變化，如突變、拷貝數(shù)變化以及更廣泛的基因組區(qū)域DNA甲基化變化[13-14]。這些數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析可以為CCA的研究提供有價(jià)值的信息。Kong等[15]基于CCA的下一代測(cè)序數(shù)據(jù)識(shí)別出三種差異表達(dá)基因（DEGs），分別是UCA1、miR-122和CLIC1，對(duì)這些失調(diào)基因的分析表明，它們可以通過(guò)調(diào)控miR-122/CLIC1和激活ERK/MAPK信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)CCA的進(jìn)展。因此，差異甲基化有助于評(píng)估膽管癌的發(fā)生和預(yù)后，并可能作為CCA生物標(biāo)志物。本研究旨在通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)CCA甲基化數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，挖掘與CCA生存相關(guān)的甲基化基因，尋找潛在的CCA治療靶點(diǎn)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 方法

1.1 數(shù)據(jù)檢索與分析

在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載CCA全基因組甲基化level3數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及相應(yīng)的臨床信息。33例CCA樣本和8例正常樣本甲基化數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)被納入研究。CCA樣本臨床信息主要包括生存信息、年齡、性別和TNM分期等。同時(shí)，在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載32例CCA甲基化數(shù)據(jù)（GSE32879），作為生物標(biāo)志物的外部驗(yàn)證數(shù)據(jù)集。

1.2 構(gòu)建甲基化基因生物標(biāo)志物

在CCA樣本和正常樣本中進(jìn)行差異甲基化基因（differential methylation genes，DMGs）篩選，甲基化值（Beta value）＞0.1、差異倍數(shù)在2倍以上（|Fold Change|≥2）并且校正后的P值（FDR）≤0.05認(rèn)定為DMGs。此外，|Fold Change|≥2、FDR＜0.05，并且FPKM（每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的fragments）＞1，則認(rèn)定為差異表達(dá)基因（differential expression genes，DEGs）。從這些數(shù)據(jù)集中鑒定出多個(gè)DMGs和DEGs后，篩選DMGs和DEGs的共有基因。通過(guò)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析篩選出與生存相關(guān)的DMGs作為CCA預(yù)后標(biāo)志物，建立模型，該模型能夠根據(jù)如下表達(dá)評(píng)估預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)：

其中，N為判斷預(yù)后的DNA甲基化基因數(shù)量；Meth代表DNA甲基化值；Coef為單因素Cox回歸系數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

在甲基化數(shù)據(jù)中，風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)平均值作為臨界值將CCA患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組與低風(fēng)險(xiǎn)組，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線(xiàn)來(lái)預(yù)測(cè)總生存率，并使用Logrank檢驗(yàn)分析高、低風(fēng)險(xiǎn)組生存曲線(xiàn)是否存在差異，F(xiàn)DR≤0.05為存在差異，值越小差異越顯著。然后使用時(shí)間依賴(lài)性ROC曲線(xiàn)來(lái)評(píng)估該模型的預(yù)測(cè)能力。本研究將鑒定的生物標(biāo)志物與其他臨床參數(shù)共同納入多因素Cox回歸分析來(lái)評(píng)估其獨(dú)立預(yù)后價(jià)值。

1.4 DNA甲基化生物標(biāo)志物基因功能注釋

通過(guò)基因本體 （gene ontology，GO）功能注釋分析所選標(biāo)志物基因的功能，以進(jìn)一步了解標(biāo)志物基因的預(yù)測(cè)能力，設(shè)定閾值P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 樣本情況

33例CCA樣本包括男性患者14例，女性患者19例。I、II、III、IV期患者分別有18例、9例、1例、5例。具體臨床資料見(jiàn)表1。

表1 CCA樣本（n=33）的患者資料統(tǒng)計(jì)

2.2 鑒定CCA預(yù)后相關(guān)甲基化基因

通過(guò)差異基因篩選，共篩選到DMGs 600個(gè)，篩選DEGs 6 876個(gè)。DMGs與DEGs的交集基因一共94個(gè)（圖1A～C）。通過(guò)單因素與多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析鑒定出FZD10和SOX92個(gè)與患者總生存時(shí)間有顯著相關(guān)性的甲基化基因（圖1D）。

2.3 甲基化基因預(yù)測(cè)能力驗(yàn)證

每例CCA患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分如下：

每例患者得到一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，以中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分作為臨界值，將患者分為低風(fēng)險(xiǎn)組（n=17）和高風(fēng)險(xiǎn)組（n=16）。Kaplan-Meier生存分析顯示，低風(fēng)險(xiǎn)組患者總生存期明顯高于高風(fēng)險(xiǎn)組（2.07年vs0.92年，圖2A）。由2個(gè)甲基化基因構(gòu)建的FZD10和SOX9組合生物標(biāo)志物其AUC值為0.90，預(yù)測(cè)能力較高，且其預(yù)測(cè)效果比TNM分期或年齡更好（圖2B）。經(jīng)GEO數(shù)據(jù)驗(yàn)證，此組合甲基化生物標(biāo)志物同樣有較高的預(yù)測(cè)能力，可以明顯觀(guān)察到低風(fēng)險(xiǎn)組比高風(fēng)險(xiǎn)組有較高的生存期（圖2C），AUC值為0.79（圖2D）。

將FZD10和SOX9組合甲基化基因生物標(biāo)志物和其他臨床特征（性別、年齡、TNM分期等）進(jìn)行多因素Cox回歸分析，結(jié)果表明，組合甲基化基因生物標(biāo)志物是獨(dú)立的CCA預(yù)后因子（高風(fēng)險(xiǎn)組vs低風(fēng)險(xiǎn)組，HR3.53，95%CI1.74～13.40，P=0.01），見(jiàn)表2。

2.4 甲基化生物標(biāo)志物基因功能分析

GO功能注釋顯示，與CCA預(yù)后相關(guān)的FZD10和SOX9基因顯著富集在轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)控、腫瘤蛋白多糖調(diào)節(jié)、干細(xì)胞的調(diào)控等方面，見(jiàn)圖3。

3 討論

膽管癌（CCA）是由膽管細(xì)胞引起的一種致命的惡性腫瘤。大多數(shù)CCA患者在診斷時(shí)由于缺乏典型癥狀和檢測(cè)指標(biāo)而進(jìn)展為晚期CCA或其他轉(zhuǎn)移性疾病，患者往往預(yù)后較差[16-17]。因此，鑒定新的CCA分子生物標(biāo)志物并研究其潛在機(jī)制非常必要。DNA甲基化是一種核心的表觀(guān)遺傳修飾，在細(xì)胞過(guò)程中起關(guān)鍵作用，通常發(fā)生在鳥(niǎo)嘌呤核苷酸之前的胞嘧啶上[18]。由于許多轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)富含CpG島，因此可能會(huì)增強(qiáng)對(duì)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的結(jié)合[19]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，異常的DNA甲基化與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。Gao等[20]通過(guò)建立肺腺癌患者預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，研究表明關(guān)鍵基因位點(diǎn)異常甲基化與預(yù)后較差有關(guān)。此外，F(xiàn)an等[21]通過(guò)研究GEO數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)了可作為肝癌生物標(biāo)志物的異常甲基化基因。更多的證據(jù)表明，表觀(guān)遺傳修飾尤其是DNA甲基化在CCA中具有重要的生物學(xué)功能，如CCA患者血清中OPCML和HOXD9的甲基化水平存在顯著差異，這兩個(gè)基因可用于膽管癌與其他膽道疾病的鑒別診斷[22]。Wang等[16]發(fā)現(xiàn)，DANCR可以與EZH2結(jié)合，調(diào)節(jié)FBP1啟動(dòng)子的組蛋白甲基化，從而調(diào)節(jié)CCA細(xì)胞的增殖和遷移。但是，以往的研究主要集中在DNA甲基化異常的特定基因或單個(gè)基因的分析。在CCA中同時(shí)涉及基因表達(dá)和甲基化的聯(lián)合分析可能會(huì)產(chǎn)生更準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。因此，我們基于基因表達(dá)和基因甲基化數(shù)據(jù)進(jìn)行了綜合生物信息學(xué)分析，以篩選CCA新的組合生物標(biāo)志物，為今后的研究提供依據(jù)。

圖1 CCA預(yù)后相關(guān)的差異基因篩選

圖2 FZD10和SOX9組合甲基化基因生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)CCA預(yù)后

本研究通過(guò)差異基因分析，共鑒定出600個(gè)差異甲基化基因與6 876個(gè)差異表達(dá)基因，進(jìn)而得到了94個(gè)交集基因。然后通過(guò)單因素與多因素Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)FZD10和SOX9這兩個(gè)與CCA生存相關(guān)的差異甲基化基因，并構(gòu)建組合生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)模型。此組合生物標(biāo)志物可以將CCA患者分為生存時(shí)間顯著不同的高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，表明具有較強(qiáng)的預(yù)測(cè)能力。通過(guò)多因素Cox回歸分析，證實(shí)甲基化基因標(biāo)志物的風(fēng)險(xiǎn)得分與總生存期保持獨(dú)立相關(guān)，不受其他臨床因素的影響。ROC曲線(xiàn)的AUC值是0.90，進(jìn)一步證明了FZD10和SOX9組合甲基化基因標(biāo)志物是一個(gè)具有較高精度的新預(yù)后標(biāo)志物。

本研究通過(guò)GO功能注釋分析了作為生物標(biāo)志物的甲基化基因，其功能主要集中在轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)控、腫瘤蛋白多糖調(diào)節(jié)、干細(xì)胞調(diào)控等方面。SOX9屬于SOX轉(zhuǎn)錄因子家族[23]，在胚胎發(fā)育過(guò)程中，它廣泛表達(dá)于多個(gè)器官。SOX9的表達(dá)是肝細(xì)胞最特異、最早的標(biāo)志物，決定了肝內(nèi)膽管形態(tài)發(fā)生的時(shí)間。在正常成人肝臟中，SOX9表達(dá)于門(mén)脈周?chē)〉母蝺?nèi)管道和大膽管內(nèi)的膽道周?chē)袤w[24]。有研究發(fā)現(xiàn)，SOX9通過(guò)抑制miR-130a來(lái)增加宮頸癌細(xì)胞的化療耐藥[25]。FZD10是卷曲蛋白基因家族成員之一，編碼Wnt通路分子的細(xì)胞表面受體[26]。FZD10在滑膜肉瘤[27]、原發(fā)性結(jié)腸癌[28]、宮頸癌[29]中高度上調(diào)。有研究發(fā)現(xiàn)FZD10能促進(jìn)WNT-β-catenin-TCF信號(hào)通路和Rac1-JNK通路的激活[30]。FZD10甲基化可能是膽管癌發(fā)生的早期事件，這值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析并鑒定出甲基化調(diào)控的差異表達(dá)基因，構(gòu)建了一個(gè)包含SOX9和FZD10的組合生物標(biāo)志物模型，對(duì)CCA預(yù)后有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值。本研究可能為CCA的治療提供了新的靶點(diǎn)。

表2 FZD10和SOX9組合生物標(biāo)志物與CCA患者生存關(guān)系的單因素分析和多因素Cox回歸分析

圖3 甲基化基因生物標(biāo)志物GO功能分析