周建國，劉如月，韓 楓，劉一亮

（1.商丘市第一人民醫(yī)院骨一科，河南商丘476000；2.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院手足顯微外科，湖南衡陽421002）

骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）作為一類多功能干細胞，具有分化成多種細胞的潛能，如心肌細胞、成骨細胞、脂細胞等［1］。因而BMSCs能作為同種異體移植的種子細胞，參與多種細胞以及器官損傷等疾病的治療［2］。但BMSCs的臨床應(yīng)用面臨較多困難，例如BMSCs異體移植后存活率較低等。針對存活率較低的原因，目前認為可能是由于宿主補體系統(tǒng)識別并攻擊BMSCs所致［4］。研究表明，補體系統(tǒng)的活化主要通過激活補體C3來實現(xiàn)，而膜補體調(diào)節(jié)蛋白如CD46、CD35以及CD55對活化物質(zhì)C3b的分解起調(diào)節(jié)作用［5］。micorRNAs是一類由18～24個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA小分子，能夠通過與靶基因信使RNA互補序列結(jié)合抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，在轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控中起重要作用［6］。有研究顯示，抑制miR-616-3p表達能通過上調(diào)補體調(diào)節(jié)蛋白CD46促進人慢性髓原白血病細胞K562抵抗補體依賴的細胞毒效應(yīng)［5］。因此，miR-616-3p可能通過調(diào)控CD46表達參與補體系統(tǒng)對BMSCs的攻擊作用，但目前尚無相關(guān)研究。本研究通過構(gòu)建miR-616-3p低表達的rBMSCs，探討在大鼠異體血清（allogeneic rat serum,ARS）干預(yù)后，miR-616-3p低表達對rBMSCs存活的影響，并闡明miR-616-3p對ARS攻擊rBMSCs作用產(chǎn)生影響的分子機制。

1 資料與方法

1.1 rBMSCs的分離及鑒定

SPF級健康雄性 Sprague Dawley（SD）大鼠 5只，鼠齡4-6周，體重（200.80±20.53）g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2014-0010。用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠，碘伏消毒后，從骨盆上離斷取下股骨。將股骨置于碘伏內(nèi)浸泡5 min后，剔除股骨周圍軟組織，剪斷股骨。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液從截斷處緩慢沖洗骨髓腔，收集沖下的骨髓細胞并制成細胞懸液。細胞懸液通過100 μm濾網(wǎng)過濾，1000×g離心5 min后，用PBS重懸細胞，800×g離心5 min，離心3次。將得到的rBMSCs細胞懸液于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。隨后每2 d換1次培養(yǎng)液，當細胞融合率達到80%后進行傳代培養(yǎng)。取第3代rBMSCs細胞上流式細胞儀檢測rBMSCs表面分子標志物CD29、CD44、CD45、CD34、CD90的表達水平。采用成骨誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)第3代rBMSCs成骨分化21 d，再使用茜素紅和堿性磷酸酶染色觀察rBMSCs成骨分化情況。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染

將rBMSCs細胞以1×105個/ml的密度接種于6孔板中，待細胞生長至60%時進行轉(zhuǎn)染。將預(yù)先備好的Lipofectamine 2000與miR-616-3p抑制劑或陰性對照（含有一段無意義的對照序列）試劑混合液加入rBMSCs細胞培養(yǎng)板中，分為rBMSCs空白對照組（blank），陰性對照組（NC，轉(zhuǎn)染陰性對照序列）和miR-616-3p抑制劑組（抑制劑組，轉(zhuǎn)染miR-616-3p抑制劑）。然后在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 血清制備以及與rBMSCs共培養(yǎng)

取大鼠頸靜脈血5 ml，4℃靜置1 h后低溫1 000×g離心20 min，取上層血清保存至冷凍備用。按后續(xù)實驗要求進行分組：①對照組（Control），rBMSCs不經(jīng)任何處理；②ARS干預(yù)組（ARS），采用10%的ARS與rBMSCs共孵育；③NC+ARS組：采用10%的ARS與轉(zhuǎn)染NC后的rBMSCs共孵育；④抑制劑+ARS組：采用10%的ARS與轉(zhuǎn)染miR-616-3p抑制劑后的rBMSCs共孵育。共培養(yǎng)條件為37℃下共孵育2 h。

1.4 qRT-PCR檢測miR-616-3p的表達水平

使用TRIzol試劑盒提取各組rBMSCs總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用SYBR綠色熒光實時定量PCR試劑盒進行定量PCR檢測，內(nèi)參基因為U6。所用引物 miR-616-3p-F：5′-ACACTCCAGCTGGGAGTCATTGGAGGGTT T-3′；miR-616-3p-R：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′； U6-F： 5′-CTCGCTTCGGCA GCA CA-3′； U6-R： 5′-AACGCTT CACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)程序：95℃，5 min；95℃，15 s；60℃，10 s；72℃，20 s；40個循環(huán)；65℃，5 Sec；95℃，50 Sec。采用 2-ΔΔCT法計算 RNA相對表達量。

1.5 Western Blot檢測CD46和cleaved Caspase-3蛋白的表達水平

取收集各組rBMSCs細胞，加入RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度后高溫變性。SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉室溫封閉處理1h后，加入一抗cleaved Caspse-3（1∶500）、CD46（1∶1 000）和GAPDH（1：1 000）低溫孵育過夜，辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗goat anti rabbit IgG（1∶10 000）37℃孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，定影后進行拍照。結(jié)果用Image J軟件進行灰度值的計算。

1.6 MTT檢測細胞增殖

收集各組rBMSCs細胞，加入0.25%胰酶消化成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度5×103/ml，每孔100 μl細胞懸液接種于96孔板，37℃培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μl MTT（0.5 mg/ml）試劑并置于37℃孵箱中孵育4 h。使用酶標儀在490 nm波長處測定各孔的吸光度（OD）值，計算細胞增殖活性。

1.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡和補體攻擊復(fù)合物（MAC）水平

收集各組rBMSCs細胞，加入0.25%胰酶消化成單細胞懸液，以2×104個/孔細胞接種于6孔板中。然后1000×g，4℃離心5min處理細胞后棄上清，加入1mL預(yù)冷的PBS洗滌2次后，加入200 μl Binding Buffer重懸細胞，然后分別加入10 μl Annexin VFITC和10 μl碘化丙啶（PI），混勻后4℃避光孵育30 min。立刻進入流式細胞儀檢測細胞凋亡率。取重懸后的rBMSCs細胞后，加入FITC標記的兔抗鼠C5b-9在37℃孵育30 min后，立刻進入流式細胞儀檢測MAC沉積情況。

1.8 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測靶向關(guān)系

利用Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將293T 細胞與 pGL3-CD46 3′-UTR WT/Mut質(zhì)粒、miR-161-3p mimics/陰性對照共轉(zhuǎn)染48 h。根據(jù)雙熒光素酶報告系統(tǒng)試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。兩組以上組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rBMSCs的鑒定

如圖1顯示，第3代rBMSCs細胞表面CD29、CD44和CD90呈陽性表達，陽性表達率分別為（90.74±3.18）% 、（91.82±2.91%） 和 （84.86±4.29）%；而CD34、CD45呈陰性表達，表達率僅為（3.12±1.12）%和（4.52±1.31）%。對第3代 rBMSCs細胞進行成骨誘導(dǎo)21 d后，茜素紅染色結(jié)果顯示rBMSCs出現(xiàn)大量橘紅色鈣結(jié)節(jié)，礦化能力增強；堿性磷酸酶染色結(jié)果顯示rBMSCs細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量藍黑色沉淀，如圖2所示。表明分離培養(yǎng)的細胞為rBMSCs。

圖1 流式細胞術(shù)檢測rBMSCs表面標志物的表達

圖2 rBMSCs成骨誘導(dǎo)分化21 d后染色觀察（×200） 2a:茜素紅染色 2b:堿性磷酸酶染色

2.2 ARS干預(yù)誘導(dǎo)rBMSCs中miR-616-3p表達

與空白和NC組比較，抑制劑組rBMSCs中miR-616-3p的表達水平顯著降低（P＜0.05）；與對照組比較，ARS組和NC+ARS組rBMSCs中miR-616-3p的表達水平顯著升高（P＜0.05）；與NC+ARS組比較，抑制劑+ARS組rBMSCs中miR-616-3p的表達水平顯著降低（P＜0.05），如圖3所示。

2.3 抑制miR-616-3p表達對ARS干預(yù)的rBMSCs細胞增殖的影響

與對照組比較，ARS組和NC+ARS組rBMSCs中細胞增殖活性顯著降低（P＜0.05）；與NC+ARS組比較，抑制劑+ARS組rBMSCs中細胞增殖活性顯著升高（P＜0.05），如圖4所示。

圖3 各組rBMSCs中miR-616-3p的表達水平 1a:轉(zhuǎn)染后rBMSCs中miR-616-3p表達水平 1b:被ARS處理的轉(zhuǎn)染后rBMSCs中miR-616-3p表達水平 與對照組或空白組比較，*P＜0.05；與NC+ARS組比較，#P＜0.05

圖4 各組rBMSCs細胞的增殖活性比較 與對照組比較，*P＜0.05；與NC+ARS組比較，#P＜0.05

2.4 抑制miR-616-3p表達對ARS干預(yù)的rBMSCs凋亡的影響

與對照組比較，ARS組和NC+ARS組rBMSCs凋亡率顯著提高（P＜0.05），凋亡蛋白cleaved Caspase-3的表達水平明顯增加（P＜0.05）；與NC+ARS組比較，抑制劑+ARS組rBMSCs凋亡率顯著降低（P＜0.05），cleaved Caspase-3的表達水平明顯下降（P＜0.05），如圖5所示。

2.5 抑制miR-616-3p表達對ARS干預(yù)的rBMSCs MAC沉積的影響

與對照組比較，ARS組和NC+ARS組rBMSCs中MAC沉積顯著增高（P＜0.05）；與NC+ARS組比較，抑制劑+ARS組rBMSCs中MAC沉積則顯著降低（P＜0.05），如圖6所示。

2.6 抑制miR-616-3p促進rBMSCs中CD46蛋白的表達

與空白組和NC組比較，抑制劑組rBMSCs中CD46蛋白的表達水平顯著升高（P＜0.05）；與對照組比較，ARS組和NC+ARS組rBMSCs中CD46蛋白的表達水平顯著降低（P＜0.05）；與NC+ARS組比較，抑制劑+ARS組rBMSCs中CD46蛋白的表達水平顯著升高（P＜0.05），如圖7所示。

2.7 CD46是miR-616-3p靶基因

通過TargetScan7.1生物信息軟件預(yù)測結(jié)果顯示，CD46 3’-UTR存在與miR-616-3p結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示，與NC mimics組比較，miR-616-3p mimics轉(zhuǎn)染293T細胞后，pGL3-CD46 3′-UTR WT的報告基因活性明顯下降（P＜0.05），而 pGL3-CD46 3′-UTR Mut的報告基因活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），如圖8所示。

圖5 各組rBMSCs凋亡水平比較 5a:流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡5b:Western blot檢測cleaved Caspase-3表達水平 與對照組比較，*P＜0.05；與NC+ARS組比較，#P＜0.05圖6 各組rBMSCs中MAC沉積水平比較 與對照組比較，*P＜0.05；與NC+ARS組比較，#P＜0.05圖7 各組rBMSCs中CD46蛋白表達水平 7a:轉(zhuǎn)染后rBMSCs中CD46蛋白表達水平 7b:被ARS處理的轉(zhuǎn)染后rBMSCs中CD46蛋白表達水平 與對照組或空白組比較，*P＜0.05；與NC+ARS組比較，#P＜0.05

圖8 CD46與miR-616-3p靶向調(diào)控關(guān)系 與NC mimics組比較，*P＜0.05

3 討論

研究表明，BMSCs具有較強的增殖能力和較低的免疫特性，是組織工程種子細胞的最佳來源［7］。在特定條件下，BMSCs可以分化為骨細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、脂肪細胞等［8］。BMSCs不僅能分泌多種神經(jīng)生長因子，而且能促進局部血管生成和血管重塑［9］。然而，補體系統(tǒng)、腫瘤等潛在因素會影響B(tài)MSCs的增殖和分化，如何緩解或避免這些潛在的因素，還需要更加深入的探索。

補體系統(tǒng)在自身免疫性疾病的病原發(fā)生中起著復(fù)雜的作用［10］。補體系統(tǒng)由三個不同的級聯(lián)組成：經(jīng)典的、替代的和凝集素補體途徑。所有這些級聯(lián)都集中在C3轉(zhuǎn)化酶的形成上傳播補體級聯(lián)。有報道稱，補體系統(tǒng)C3中心成分的缺失顯著降低了移植物抗宿主?。℅VHD）相關(guān)的死亡率和發(fā)病率，C3調(diào)節(jié)小鼠GVHD中Th1/Th17的極化率［11］，表明補體系統(tǒng)的缺失有助于抗GVHD相關(guān)的損傷。BMSCs與自體血清孵育后有細胞損傷，并且檢測到補體激活誘導(dǎo)的補體膜攻擊復(fù)合物（MAC）的形成［12］，提示補體可以識別自體BMSCs并攻擊它。本研究發(fā)現(xiàn)，異體血清能抑制rBMSCs細胞增殖，促進細胞凋亡和MAC沉積。說明補體系統(tǒng)對骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖凋亡有明顯作用，并且該作用與補體激活后產(chǎn)生的膜攻擊復(fù)合物MAC的沉積相關(guān)。

補體激活主要由補體調(diào)節(jié)蛋白調(diào)控，膜補體調(diào)節(jié)蛋白在不同細胞群中廣泛表達，是維持補體級聯(lián)穩(wěn)態(tài)的蛋白質(zhì)［13］。膜補體調(diào)節(jié)蛋白CD46通過充當因子I（FI）介導(dǎo)的C3b裂解的輔因子蛋白來調(diào)節(jié)C3的活化。研究發(fā)現(xiàn)重組的免疫特性分子CD46能降低補體激活引起的血清溶血以及殺菌活性，提示CD46對補體激活具有負調(diào)節(jié)作用。進一步觀察到重組的免疫特性I因子（FI）顯著降低了CD46對補體系統(tǒng)的抑制作用，這很可能是由于血清中天然免疫特性FI的抗體阻斷所致。CD46能夠與FI直接相互作用，形成CD46-FI復(fù)合物，進而調(diào)控補體活性［14］。CD46作為一種膜結(jié)合的輔因子，通過其控制補體激活的能力，在保護宿主細胞免受補體攻擊中發(fā)揮作用，但上游分子調(diào)控機制尚不清楚。

miRNAs能通過抑制靶基因的翻譯參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄后表達水平［15］。miRNAs參與了許多病理生理過程，如細胞生長、器官發(fā)生、侵襲、遷移和凋亡［16］。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-616-3p靶向組織因子途徑抑制物2（tissue factor pathway inhibitor 2,TFPI2）調(diào)控胎盤組織細胞的生長和遷移［17］。而且，miR-616-3p還能通過調(diào)控CD46的表達影響人慢性髓原白血病細胞K562對補體系統(tǒng)的抵抗［5］。說明miR-616-3p參與了補體系統(tǒng)對細胞的攻擊作用。本研究發(fā)現(xiàn)，異體血清能下調(diào)膜補體調(diào)節(jié)蛋白CD46，并且上調(diào)miR-616-3p的表達，說明miR-616-3p和CD46參與了異體血清對rBMSCs細胞攻擊作用。該結(jié)果驗證了CD46對補體系統(tǒng)的調(diào)控作用，而且還發(fā)現(xiàn)了CD46的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控因子miR-616-3p，進一步探討miR-616-3p對CD46以及補體系統(tǒng)的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制miR-616-3p能顯著上調(diào)CD46的表達水平，并且能明顯減弱異體血清對rBMSCs的攻擊作用。另外，雙熒光素酶結(jié)果顯示，miR-616-3p與CD46靶向結(jié)合。因此，miR-616-3p可能通過靶向調(diào)控CD46表達影響異體血清對rBMSCs細胞的攻擊作用。

綜上所述，抑制miR-616-3p表達可能通過靶向上調(diào)CD46表達，進而抑制補體系統(tǒng)對BMSCs細胞的攻擊作用。