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        液相串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考

        2021-01-27 12:16:22作者莊姜云唐媛媛吳永盛
        廣東飼料 2020年12期
        關(guān)鍵詞:氯霉素容量瓶霉素

        ◆作者:莊姜云 唐媛媛 吳永盛

        ◆單位:湛江市海關(guān)技術(shù)中心食品實(shí)驗(yàn)室

        關(guān)鍵字:飼料;氯霉素;甲砜霉素;氟苯尼考;液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

        氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素屬于氯霉素類抗生素,因?qū)Ω锾m氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有很強(qiáng)的活性,而表現(xiàn)出廣譜的抗菌能力(馮民等,2013)。重的毒副作用,會(huì)引起再生障礙性貧血和灰嬰綜合癥等(李俊鎖等,2002;丁全福等,2001;李佩佩等,2013),因此許多國家和地區(qū)禁止此類藥物用于食品和飼料中。氯霉素(CAP)、甲砜霉素(TAP)和氟苯尼考(FF)屬于酰氨醇類藥物,曾被廣泛地用于動(dòng)物各種傳染性疾病的預(yù)防和治療(肖國軍等,2018)。多國已禁止氯霉素在動(dòng)物疾病防治上的使用,尤其是食品動(dòng)物。2019 年12 月27 日,氯霉素被列入食品動(dòng)物中禁止使用的藥品及其他化合物清單(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250 號(hào))。飼料一般是獸藥添加的主要載體,開展飼料中氯霉素類藥物檢測(cè)是從源頭進(jìn)行控制的有效方法,因此研究飼料中氯霉素類藥物檢測(cè)的方法具有重要意義。

        由于飼料樣品成分復(fù)雜,基質(zhì)干擾物多,液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用法在排除干擾、準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn)定性、定量分析方面更具優(yōu)勢(shì)。本研究以羅非魚飼料為樣品,建立了一種快速、簡(jiǎn)便、步驟簡(jiǎn)單,同時(shí)檢測(cè)飼料中3 種酰胺醇類抗生素含量的LC-MS/MS 法,以便對(duì)食品動(dòng)物用飼料進(jìn)行有效監(jiān)控,從而進(jìn)一步確保動(dòng)物源性食品的安全。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與試劑

        液質(zhì)聯(lián)用儀1290+G6400 系列三重四極桿質(zhì)譜,配ESI 離子源(美國安捷倫公司);Anke TDL-5-A,Anke LXJ-ⅡB 離心機(jī)(中國培英公司);氮吹儀(美國Biotage 公司);渦旋混勻器XH-B(天翎公司)。

        甲醇、乙腈均為色譜級(jí)(美國fisher 公司),乙酸乙酯、正己烷均為分析純(廣州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品),氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考均購買Dr.Ehrenstorfer 公司,純度99.0%以上,氘代氯霉素(d5- 氯霉素),100μg/mL,1mL 購買Bepure,實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T 6682 規(guī)定的二級(jí)用水。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 溶液配制

        標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)備溶液(500mg/kg)分別稱量經(jīng)折算相當(dāng)于12.5 mg(精確到0.1 mg)的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),用甲醇溶解并定容于25mL 容量瓶中。氯霉素(10mg/kg)、甲砜霉素和氟苯尼考(100mg/kg)第一標(biāo)準(zhǔn)中間液,準(zhǔn)確吸取0.5mL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、5mL 甲砜霉素、5mL 氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(500mg/kg)于25mL 容量瓶中,用甲醇稀釋并定容至刻度。氯霉素(1.0mg/kg)、甲砜霉素和氟苯尼考(10.0mg/kg)第二標(biāo)準(zhǔn)中間液,準(zhǔn)確吸取1.0mL 第一標(biāo)準(zhǔn)中間液于10mL 容量瓶中,用甲醇稀釋并定容至刻度,配成第二標(biāo)準(zhǔn)中間液。

        氯霉素(10μg/kg),甲砜霉素和氟苯尼考(100.0μg/kg)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:準(zhǔn)確吸取0.25mL第二標(biāo)準(zhǔn)中間液于25mL 容量瓶中,用甲醇稀釋并定容至刻度。準(zhǔn)確移取上述標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配成氯霉素0,0.1μg/kg,0.2μg/kg,0.5μg/kg,1.0μg/kg,2.0μg/kg,4.0μg/kg;甲砜霉素和氟苯尼考0,1.0μg/kg,2.0μg/kg,5.0μg/kg,10.0μg/kg,20.0μg/kg,40.0μg/kg的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        氘代氯霉素(d5- 氯霉素)內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(4.0mg/kg),準(zhǔn)確吸取1.0ml 氘代氯霉素(d5- 氯霉素)標(biāo)準(zhǔn)溶液于25ml 容量瓶中,用甲醇定容至刻度。氘代氯霉素(d5- 氯霉素)內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶 液(40μg/kg),準(zhǔn) 確 吸 取0.25mL 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于25mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度。

        1.2.2 液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜條件

        1.2.2.1 色譜條件

        色譜柱Agilent Eclipse XDBC18 柱,4.6 ×150mm, 粒 度5μm;進(jìn) 樣 量5.0μL;柱 溫30℃;流速:600μL/mL;流動(dòng)相:溶劑A 為純水,溶劑B 為甲醇,主要液相流動(dòng)梯度洗脫見表1。

        1.2.2.2 質(zhì)譜條件

        離子化方式:ESI, 負(fù)離子檢測(cè);監(jiān)測(cè)方式:MRM;GAS Flow:7L/min;GAS Temp325℃;Nebulize45 L/min;鞘氣溫度350℃;鞘氣流速10 L/min,定量為內(nèi)標(biāo)法,主要質(zhì)譜參數(shù)見表2。

        1.2.3 樣品前處理

        稱取粉碎后的樣品2g(精確至0.01 g)至50mL 離心管中,加入內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液100μL,加入5mL 乙酸乙脂,震蕩15min,超聲提取15min,4500r/min 離心1 0min,移取5mL 上清液于玻璃試管中。再加入5mL 乙酸乙脂提取,震蕩15min,超聲提取15min,4500r/min 離心10min,合并上清液于玻璃試管中。在45℃下氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)?.0mL 甲醇水溶液(3∶7)溶解,震蕩1min,加入4mL 正己烷脫色脫脂,4500r/min 離心5min,移取下清液于1.5mL 塑料離心管中,在10000r/min 下離心5 min,取清液經(jīng)0.22μm 濾膜過濾后上機(jī)測(cè)定。

        表1 液相流動(dòng)相梯度洗脫

        表2 質(zhì)譜參數(shù)

        2 結(jié)果與討論

        2.1 方法的線性關(guān)系

        拿羅非魚飼料作為基質(zhì)配制系列的混合標(biāo)準(zhǔn)溶度,氯霉素的溶度范圍為0、0.1μg/kg、0.2 μg/kg 、0.5 μg/kg 、1.0 μg/kg 、2.0μg/kg、4.0μg/kg,甲砜霉素和氟苯尼考的溶度范圍為0、1.0μg/kg、2.0 μg/kg、5.0μg/kg、10.0μg/kg、20.0μg/kg、40.0μg/kg,其中CAP-D5 的溶度為4.0mg/kg,以溶度為橫坐標(biāo),以響應(yīng)值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,其線性關(guān)系好,相關(guān)系數(shù)>0.999,結(jié)果見表3。

        2.2 方法的回收率和精密度

        選擇一份羅非魚飼料樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn),樣品分別添加氯霉素0.1μg/kg、0.2μg/kg和0.5μg/kg,甲砜霉素和氟苯尼考1.0μg/kg、2.0μg/kg、5.0μg/kg 的混合標(biāo)準(zhǔn)液各6 份搖勻、靜置20 min 后按1.2.3 方法處理并進(jìn)行分析,計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表4,可以看出,各個(gè)水平的回收率范圍為94.8%~121.2%,RSD 為3.9%~9.4%,方法的準(zhǔn)確度與精密度均滿足對(duì)飼料中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的方法檢測(cè)要求。

        2.3 前處理的優(yōu)化

        現(xiàn)行國標(biāo)方法中要固相萃取凈化、提取凈化步驟多,消耗時(shí)間長(zhǎng),所以本方法用乙酸乙酯提取,全轉(zhuǎn)移,正己烷脫色脫脂,目標(biāo)物回收率好,精密度高,步驟簡(jiǎn)單,操作方便,節(jié)約成本,適合大批量的飼料檢測(cè)。

        2.4 流動(dòng)相的選擇

        以0.1%甲酸水- 甲醇,乙腈- 水,0.1%甲酸水- 乙腈,甲醇- 水來做為流動(dòng)相比較,流動(dòng)相甲醇- 水的響應(yīng)值比較高,氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考分離效果好,靈敏度高。

        表3 3 種化合物的線性回歸方程、線性關(guān)系和線性范圍(n=6)

        表4 3 種化合物的加標(biāo)回收率和精密度

        3 結(jié)論

        本文建立飼料中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法,該方法優(yōu)化儀器條件和前處理的凈化步驟,該前處理快速、簡(jiǎn)便、節(jié)約成本。具有回收率好、精密度和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),該方法完全適合現(xiàn)行的檢測(cè)要求。

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