阮 謙，劉應(yīng)華，趙 謙，王 蕾，尹革芬*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 6502012；2.楚雄州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南 楚雄 675000)

牛流行熱(Bovine Ephemeral Fever，BEF)是由牛流行熱病毒(Bovine Ephemeral Fever Virus，BEFV)引起牛機(jī)體內(nèi)部溫度突然升高、呼吸困難、腸胃功能異常、全身無(wú)力、不靈活和行動(dòng)異常的一種傳染疾病。該病傳播速度極快，很多地方的牛群都難避免，并且流行具有一定的周期性。BEF可導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量下降，妊娠奶牛出現(xiàn)流產(chǎn)，會(huì)給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。該病大多發(fā)生在夏、秋蚊子活躍期，雨季或晝夜溫差大容易引起流行[4]。健康牛被蚊蟲(chóng)叮咬后，如果該蚊蟲(chóng)叮咬過(guò)病牛，即會(huì)感染。目前，BEFV被歸入彈狀病毒科，病毒外型為子彈型，核酸為單股負(fù)鏈RNA，有5種結(jié)構(gòu)蛋白，對(duì)脂類物質(zhì)敏感[5-6]。

據(jù)近年來(lái)的相關(guān)報(bào)道，BEF對(duì)牛群的危害日趨嚴(yán)重，所以需要建立一種實(shí)用、敏感且快速便捷的分子檢測(cè)方法，以便做到早確診、早隔離、早治療，最大限度地降低BEF帶來(lái)的損失[7]。為了滿足現(xiàn)今牛場(chǎng)對(duì)BEF的檢測(cè)要求，本研究針對(duì)BEFV的G基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，建立熒光定量PCR檢測(cè)方法，為臨床上BEF的診斷提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集

樣本均采自云南省大理州兩個(gè)規(guī)?；?chǎng)，為疑似BEFV感染的20份新鮮血液樣本，陽(yáng)性對(duì)照為BEF疫苗。

1.1.2 主要儀器

移液器(KA0052521，DRAGON公司)、超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司)、高速冷凍離心機(jī)(75005440，Thermo Fisher Scientific公司)、凝膠成像系統(tǒng)(Tanon-1600，天能科技有限公司)、電泳儀(DYY-7C，北京六一儀器廠)、熒光定量PCR儀(580BR 12007，BIO-RAD公司)、恒溫水浴鍋(HWS12，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.1.3 主要試劑

RNAiso Plus購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司(Cat. No.9109)；DEPC購(gòu)自Sigma公司(Cat. No.V900882)；氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇等由筆者的實(shí)驗(yàn)室提供，均為分析純；熒光定量PCR相關(guān)試劑：反轉(zhuǎn)錄試劑iScriptTMcDNA Synthesis Kit購(gòu)自BIO-RAD公司(Cat. No.170-8891)；熒光染料SsoFastTMEvaGreen? Supermix購(gòu)自BIO-RAD公司(Cat. No.172-5201AP)。

1.1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI GenBank中公布的BEFV基因序列(MN781183.1、KY012742.1)，設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增G基因片段的特異性引物(表1)用于PCR檢測(cè)。設(shè)計(jì)好的引物送昆明碩擎生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 BEFV RNA的提取

在2 mL離心管中加入300 μL處理好的疫苗及樣本，加入1 mL RNAiso Plus(TRIZOL)，用力震蕩，使RNAiso Plus(TRIZOL)與樣本均勻混合，4 ℃靜置10 min；10 min后加入200 μL的氯仿，用力震蕩，4 ℃靜置10 min，12 000 r/min離心15 min；小心吸取上層無(wú)色溶液約500 μL于無(wú)RNAase的1.5 mL新離心管中，加入等量異丙醇，4 ℃靜置10 min，12 000 r/min離心10 min，使RNA沉淀于離心管底部；小心倒去上清，向離心管內(nèi)加1 mL 75%乙醇清洗，7 500 r/min離心5 min；倒去上清，輕甩，用吸水紙吸干離心管壁上的液體，每管加入20 μL DEPC水溶解RNA。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR

參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒(iScriptTMcDNA Synthesis Kit)的說(shuō)明書，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。熒光定量PCR反應(yīng)體系如下：SsoFastTMEvaGreen Supermix(2×)10 μL，上游引物(10 μM)0.8 μL，下游引物(10 μM)0.8 μL，cDNA 1.5 μL，無(wú)RNase水6.9 μL，反應(yīng)總體系為20 μL。熒光定量PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，50 ℃～ 60 ℃梯度退火20 s；循環(huán)35次；收集溶解曲線65 ℃升高到95 ℃，每5 s升高0.5 ℃。

1.2.3 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以BEF疫苗為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收純化后克隆于pMD18-T載體。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切及測(cè)序鑒定。將構(gòu)建成功的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒按10倍梯度稀釋(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7)，用不同稀釋度的樣本作為擴(kuò)增模板；以X軸為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的起始模板量，以Y軸為熒光定量PCR獲得的循環(huán)數(shù)，繪制BEFV的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 臨床樣本的檢測(cè)

用建立的熒光定量PCR檢測(cè)規(guī)?；?chǎng)送檢的臨床癥狀疑似牛流行熱感染的20份牛新鮮血液樣本，以了解該病在云南省牛場(chǎng)的感染情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段的擴(kuò)增鑒定

提取BEF疫苗中的疫苗毒株RNA，用所設(shè)計(jì)的特異性引物反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)優(yōu)化過(guò)的反應(yīng)體系及引物的退火溫度，擴(kuò)增所得目的片段與預(yù)期擴(kuò)增片段大小308 bp相符，圖1是電泳結(jié)果。

2.2 構(gòu)建BEFV 熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線

BEFV溶解曲線峰值均單一，在陰性對(duì)照中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)特異性擴(kuò)增，可知引物特異性良好；分析顯示：R2＞0.99，0.9≤E≤1.1，35個(gè)循環(huán)內(nèi)既沒(méi)有擴(kuò)增非特異性產(chǎn)物，也沒(méi)有產(chǎn)生引物二聚體，說(shuō)明構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線成功。陽(yáng)性質(zhì)粒擴(kuò)增后提取濃度為162 ng/μL，目的片段長(zhǎng)度為308 bp，經(jīng)計(jì)算得到質(zhì)?？截惲繛?.91×10-10，證明所建立的熒光定量PCR方法可進(jìn)行絕對(duì)定量分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

2.3 臨床樣本檢測(cè)

利用建立的熒光定量PCR方法檢測(cè)了大理州2家規(guī)?；?chǎng)送檢的20份疑似牛流行熱感染的血液樣本，檢測(cè)顯示陽(yáng)性樣本15份，證明建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法可用于臨床試驗(yàn)以及BEFV流行病學(xué)調(diào)查等。部分樣本檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。

3 討論

牛流行熱是牛(主要為奶牛)的一種急性、熱性、病毒性傳染病，在我國(guó)曾有幾次波及20個(gè)以上省、直轄市和自治區(qū)的大流行。該病危害奶牛的健康，導(dǎo)致產(chǎn)奶量減少，還會(huì)導(dǎo)致牛不能正常走動(dòng)，從而損失經(jīng)濟(jì)價(jià)值，牛群一旦感染會(huì)快速大范圍發(fā)病，造成巨大損失[8-9]。疾病的診斷要早和快，防治該病的前提條件是能否對(duì)該病建立快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)。我國(guó)目前對(duì)該病的各種檢測(cè)方法研究不足，且操作麻煩，既耗費(fèi)時(shí)間又浪費(fèi)精力。因此，建立一種快速準(zhǔn)確且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的實(shí)驗(yàn)室診斷方法尤為迫切[10]。

本文通過(guò)反應(yīng)條件優(yōu)化、特異性檢測(cè)和靈敏度檢測(cè)，成功建立了BEFV 熒光定量PCR檢測(cè)方法。應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法對(duì)云南部分地區(qū)送檢病料進(jìn)行檢測(cè)分析，20份樣本中陽(yáng)性樣本有15份，陽(yáng)性率達(dá)75%，說(shuō)明當(dāng)前牛流行熱在牛場(chǎng)廣泛流行，我們應(yīng)對(duì)該病給予一定的關(guān)注。本次試驗(yàn)建立的牛流行熱檢測(cè)方法可以為該病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)提供技術(shù)支持和參考。