楊興華，張靜，林靜，李兵，王小娟，孫俊偉

(1.山東省煙臺(tái)市業(yè)達(dá)醫(yī)院口腔科, 煙臺(tái) 264006；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，泰安 271000；3.滕州市中心人民醫(yī)院口腔科，滕州 277500)

1 引 言

家蠶絲很早就被就用于臨床醫(yī)學(xué)及其研究領(lǐng)域，被用作手術(shù)縫合線已有100余年的歷史[1]。家蠶絲由絲膠和絲素構(gòu)成，絲素蛋白是蠶絲主要成份。根據(jù)不同使用目的，絲素可被加工成膜狀、多孔狀、膠體狀等。目前常用的絲素蛋白 (silk fibroin，SF )溶解劑有9.3 mol/L LiBr、氯化鈣三元溶解體系(摩爾比為CaCl2∶C2H5OH∶H2O=1∶2∶8)等[2-3]。絲素制備孔隙的方法主要有冷凍法、冷凍干燥法(凍干法)、鹽析法、發(fā)泡法、有機(jī)溶劑揮發(fā)法等，其中凍干法操作簡(jiǎn)單，獲得的支架穩(wěn)定，是常用的方法[4]。支架的孔徑、孔隙率和孔壁的厚度可以通過(guò)調(diào)節(jié)溫度、濃度、制孔劑來(lái)實(shí)現(xiàn)[5]。SF支架的應(yīng)用受壓縮強(qiáng)度低，缺乏細(xì)胞生長(zhǎng)分化因子等因素限制，需與高分子有機(jī)物、殼聚糖等材料復(fù)合以改善其性能[6]。

牙本質(zhì)為多孔結(jié)構(gòu)，通過(guò)對(duì)牙本質(zhì)脫鈣處理，使脫鈣牙本質(zhì)基質(zhì)(decalcified dentin matrix，DDM)具有誘導(dǎo)成骨的能力，其含有大量有助于細(xì)胞生長(zhǎng)的蛋白和細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化、趨化、增殖，是天然的細(xì)胞外成骨誘導(dǎo)基質(zhì)材料[7]。DDM顆粒的大小對(duì)成骨也有影響，研究發(fā)現(xiàn)200～1 000 μm的直徑粒度更利于新骨形成，其殘留的鈣、磷離子可為成骨提供原材料[8-9]。因此，DDM作為臨床的骨增量材料常應(yīng)用于口腔種植。通過(guò)對(duì)比DDM和Bio-Oss兩種材料發(fā)現(xiàn)，牙種植區(qū)新骨生成量DDM具有與Bio-Oss同樣的臨床效果，可替代Bio-Oss使用[10]。DDM可以取自體阻生牙或者埋伏牙、異體的健康牙齒，經(jīng)過(guò)冷凍降低其免疫性，具有廣泛的應(yīng)用前景。

聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)作為載體可延長(zhǎng)藥物半衰期。利用PEG6000與SF交聯(lián)，可增加材料的壓縮強(qiáng)度、拉伸強(qiáng)度和柔韌性[11]。

利用SF多孔、可吸收、通透性、可塑性和生物相容性好及DDM的成骨誘導(dǎo)性強(qiáng)、壓縮強(qiáng)度高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，本研究構(gòu)建了DDM-SF可吸收多孔支架，并研究其對(duì)牙周干細(xì)胞的生長(zhǎng)和成骨誘導(dǎo)的影響，以期將來(lái)應(yīng)用于牙周、種植骨量不足的臨床治療。

2 材料和方法

2.1 儀器及材料

細(xì)胞計(jì)數(shù)劑Kit-8，yiyuan，上海；LiBr，20022726，國(guó)藥集團(tuán)；紅外線光譜儀，Tensor II；掃描電鏡，MDI Jade 5.0；BCA試劑盒，Solarbio；ALP一抗( 108337 abcam)、BMP-2一抗( 14933 abcam)、RUNX2一抗(ab23981 Abcam)、I型膠原一抗(abcam)；SD 雄性大鼠，山東大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2.2 方法

2.2.1SF溶液的制備 將適量桑蠶絲置于0.02 mol/L碳酸鈉溶液中，100℃煮1 h，脫膠、沖洗、晾干；絲素放入1 L LiBr(摩爾濃度9.3 M)溶液中，60℃水浴溶解、流水透析48 h，蒸餾水透析24 h，檢測(cè)SF初始濃度，并將其稀釋或濃縮至工作濃度[12]。

2.2.2DDM顆粒的制作 正畸拔除離體牙拔髓后進(jìn)行脫鈣、沖洗、脫脂、清洗、晾干處理，冷凍后碾成100～500 μm的顆粒保存。

2.2.3支架制備及性能測(cè)定 將100～500 μm的6%SF顆粒與DDM以體積比7:3混合、濕潤(rùn)，加入試件模具，消滅空腔后滴加(6%SF+1%PEG6000)溶液至液平，-20℃真空冷凍干燥，置于80%冷乙醇浸泡12 h；經(jīng)去離子水沖洗、凍干、消毒后備用。制備分別用于細(xì)胞培養(yǎng)和壓縮強(qiáng)度測(cè)試的膜狀和柱狀(直徑1 cm，高2 cm)復(fù)合支架。支架孔徑采用電鏡下標(biāo)尺測(cè)量10個(gè)不同位點(diǎn)的孔徑平均值。采用萬(wàn)用電子力學(xué)壓縮機(jī)壓斷各組材料試件時(shí)的壓力平均值測(cè)定其壓縮強(qiáng)度，并對(duì)材料進(jìn)行特性光譜檢測(cè)，X-ray diffraction(XRD)和BET比表面積檢測(cè)。

2.2.4人牙周膜干細(xì)胞(human periodontal ligament stem cells，HPDLSC)的分離與培養(yǎng) 采用正畸減數(shù)拔牙的年輕患者離體牙齒，1 h內(nèi)在含雙抗的瓶中轉(zhuǎn)移至試驗(yàn)室無(wú)菌臺(tái)內(nèi)。PBS沖洗3遍后，刮取離體牙中下部牙周膜，沖洗、剪碎，置于培養(yǎng)皿內(nèi)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)[13]，待原代培養(yǎng)的細(xì)胞鋪滿80%皿底時(shí)，消化、吹打、傳代。取第二代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面抗原CD11b、CD29、CD44、CD45、CD90等的流式檢測(cè)及成脂、成骨分化誘導(dǎo)、成神經(jīng)元樣細(xì)胞等干細(xì)胞的特性鑒定。

2.2.5細(xì)胞毒性檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)組為30%DDM(v/v)的DDM-SF支架,對(duì)照組為SF支架。無(wú)菌條件下，將膜狀支架覆蓋96孔板底部，第二代HPDLSC以5×105個(gè)/mL的密度，每孔20 μL接種于材料上。24 h后PBS清洗每孔，加入含10%cck-8的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，孵育2 h在酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基的吸光度(optical absorbance，OA)值，連續(xù)7 d。

2.2.6支架對(duì)細(xì)胞影響檢測(cè) 第二代HPDLSC以1×106個(gè)/mL接種到含DDM體積比為10%、30%、50%的三組DDM-SF支架上培養(yǎng)，在7、21、35 d時(shí)，采用研磨法提取細(xì)胞的蛋白，WB測(cè)細(xì)胞ALP、RUNX2、COL-1、BMP-2變化。掃描電鏡(SEM)觀察細(xì)胞與支架。30%DDM-SF支架復(fù)合細(xì)胞后植入大鼠皮下顱骨表面，分別于2、4、12、24周取出，固定，脫鈣、脫水、包埋、切片、HE染色。

3 結(jié)果

3.1 性能指標(biāo)

脫膠溶解后的SF溶液為淡黃色，且具有一定的粘度。制備的SF溶液初始濃度約3%～6%(m/v)；制備的支架為白色、有韌性的多孔材料。在凍干條件下，測(cè)得DDM-SF支架孔徑及壓縮強(qiáng)度見(jiàn)表1，可知SF材料支架加入牙本質(zhì)后的壓縮強(qiáng)度隨牙本質(zhì)比例的增加逐漸增大，且同等條件下DDM-SF的孔徑要小于SF的孔徑，材料孔徑隨著濃度的增加而縮小。

按成組設(shè)計(jì)多個(gè)樣本比較的秩和檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis法)，樣本壓縮強(qiáng)度經(jīng)秩和檢驗(yàn),得P=0.0148。P<0.05，各組壓縮強(qiáng)度有差異。

表1 DDM-SF復(fù)合支架的孔徑、壓縮強(qiáng)度

3.2 DDM-SF支架紅外光譜檢測(cè)

SF特征峰在3 500 cm-1譜峰為酰胺中NH伸縮振動(dòng)和—OH伸縮振動(dòng)，見(jiàn)圖1(a)。DDM特征波長(zhǎng)1 033 cm-1為磷酸根，1 385 cm-1為碳酸根，3 442.20 cm-1、1 631.92 cm-1含有氮?dú)滏I,見(jiàn)圖1(b)。PEG特征峰在3 500 cm-1為O—H鍵，2 885.6 cm-1、1 468 cm-1為O—CH2鍵，見(jiàn)圖1(c)。在DDM-SF支架1 631 cm-1處譜峰為酰胺鍵中—CN伸縮振動(dòng)和—NH面內(nèi)變形振動(dòng)，氮?dú)滏I—CO—NH活潑，C—O鍵伸縮振動(dòng)，有共價(jià)鍵形成，見(jiàn)圖1(d)。

圖1 DDM-SF復(fù)合支架的紅外光譜

3.3 XRD及BET檢測(cè)

SF支架結(jié)晶度非常低,在22°和40°附近有兩個(gè)衍射包。DDM-SF支架結(jié)晶度比較好，而且存在尖銳的無(wú)機(jī)鹽衍射峰，具有三維有序結(jié)構(gòu)，堆積緊密,但晶體的對(duì)稱性低。經(jīng)BET檢測(cè)，材料的孔隙率達(dá)98%，材料的孔隙直徑10～160 nm，見(jiàn)圖2。

圖2 BET檢測(cè)結(jié)果

3.4 HPDLSC的細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定

使用第二代干細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD29、CD44、CD90結(jié)果呈陽(yáng)性，見(jiàn)圖3Ⅰ(a)—(c)；CD11b、CD45呈陰性，見(jiàn)圖3Ⅰ(d)—(e)。貼壁培養(yǎng)的牙周膜組織塊在第3 d左右開(kāi)始爬出成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，以組織塊為中心向四周放射狀生長(zhǎng)，鋪滿70%～80%底壁時(shí)，消化傳代。傳代后細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形、短棒形。HPDLSC成骨誘導(dǎo)后光鏡下見(jiàn)鈣化結(jié)節(jié)；茜素紅染色為陽(yáng)性；成脂誘導(dǎo)光鏡下胞漿內(nèi)可見(jiàn)脂滴樣物；油紅O染色呈粟狀紅色；成神經(jīng)元誘導(dǎo)可形成成神經(jīng)元樣細(xì)胞；NSE免疫熒光染色呈陽(yáng)性見(jiàn)圖3Ⅱ(a)—(i)。

圖3 HPDLSC“干”性鑒定

3.5 兩組支架對(duì)細(xì)胞的活性影響

HPDLSC接種于絲素支架后，cck-8法( 450 nm OA值，n=6)測(cè)定細(xì)胞活性 ,SF、DDM-SF材料組曲線開(kāi)始漸漸降低，然后提升緩慢，說(shuō)明支架初期對(duì)細(xì)胞有抑制作用，1周左右細(xì)胞恢復(fù)至正常增殖狀態(tài)。對(duì)兩組材料OA值進(jìn)行F檢驗(yàn)，P=0.0042，P<0.05具有顯著差異，說(shuō)明含DDM的支架更易促進(jìn)細(xì)胞增殖，見(jiàn)圖4。

圖4 兩組材料OA數(shù)值曲線圖

3.6 SF、DDM-SF支架形態(tài)及細(xì)胞的生長(zhǎng)情況

制備供細(xì)胞培養(yǎng)用的SF膜形支架和尺寸約1 cm×2 cm的柱形支架。SF支架的HE染色顯示各孔相通，孔呈圓形，且HE染色干細(xì)胞與支架結(jié)合緊密。SEM掃描顯示干細(xì)胞與6%的SF支架、DDM-SF復(fù)合支架結(jié)合緊密,細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞突觸舒展充分，見(jiàn)圖5。

圖5 支架形態(tài)及SEM掃描支架表面細(xì)胞

3.7 Westernblot結(jié)果

作為成骨分化早期成骨指標(biāo)，RUNX2、BMP-2等蛋白表達(dá)隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)。ALP、Col-1等蛋白有較早表達(dá)，可能與細(xì)胞和材料有關(guān)，ALP在第三周時(shí)表達(dá)最為充分。10%的DDM含量對(duì)成骨細(xì)胞影響較弱，30%、50%影響明顯，說(shuō)明支架的DDM含量對(duì)成骨蛋白表達(dá)有影響，見(jiàn)圖6。

圖6 DDM-SF支架表面HPDLSC Westernblot檢測(cè)結(jié)果

3.8 體內(nèi)復(fù)合支架切片

HE染色顯示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，支架組織逐漸被吸收。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的吸收時(shí)間基本一致，實(shí)驗(yàn)組第4周時(shí)細(xì)胞開(kāi)始在牙本質(zhì)表面形成吸收凹陷，到24周時(shí)DDM大部分被吸收，呈凹陷狀，細(xì)胞深入到牙本質(zhì)內(nèi)部的凹陷類骨質(zhì)形成，而對(duì)照組細(xì)胞增殖緩慢，材料吸收緩慢，24周時(shí)仍無(wú)硬組織形成，見(jiàn)圖7。

圖7 SF、DDM-SF植入體內(nèi)不同時(shí)間段HE染色結(jié)果

4 討論

本研究證實(shí)在冷凍干燥條件下1%PEG+6%SF與30%DDM(v/v)脫鈣牙本質(zhì)基質(zhì)制作的絲素蛋白脫鈣牙本質(zhì)復(fù)合支架(DDM-SF)成孔良好，且具有良好的成骨誘導(dǎo)性和抗壓縮強(qiáng)度。本研究測(cè)得DDM-SF支架試件的壓縮強(qiáng)度為87.33 MPa，足以維持一定生理外形。通過(guò)測(cè)量孔徑，SEM微觀下檢測(cè)證實(shí)，DDM-SF致孔率適中，孔徑為100 μm左右。DDM在復(fù)合支架中不僅增強(qiáng)壓縮強(qiáng)度，還起到細(xì)胞誘導(dǎo)因子的作用。培養(yǎng)在DDM-SF支架上的HPDLSC代謝旺盛，30%DDM體積比構(gòu)建的支架細(xì)胞合成的成骨指標(biāo)COL-1、BMP-2、RUNX2濃度最佳。DDM-SF具有的多孔、生物活性、抗壓、可吸收等性能，在組織工程骨和口腔種植骨量不足治療方面具有廣闊前景。隨著新技術(shù)如靜電紡絲技術(shù)、3D打印技術(shù)、納米技術(shù)的出現(xiàn)，在后續(xù)材料制作研究中考慮采用以上技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)制作均勻孔徑的可控性和材料的抗菌性。此外，考慮將新材料與SF進(jìn)行復(fù)合，如與石墨烯材料的復(fù)合[14]，以增強(qiáng)材料的拉伸強(qiáng)度，或嫁接生長(zhǎng)調(diào)控因子等。隨著技術(shù)發(fā)展，后續(xù)將對(duì)DDM-SF支架的制作工藝進(jìn)一步優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)對(duì)其吸收速度和強(qiáng)度的調(diào)控。