梁滿中,王 鋒,殷小林,肖翡翠,張聰枝,高琴梅,劉偉浩,胡舒暢,陳良碧

(湖南師范大學生命科學學院作物不育資源創(chuàng)新與利用湖南省重點實驗室,中國湖南長沙410081)

水稻是我國主要的糧食作物,我國三分之二以上的人口以水稻為主食。在過去的40多年里,水稻雜種優(yōu)勢利用為我國的糧食安全作出了重要貢獻。水稻是自花授粉作物,其穎花多且小,無法通過人工去雄的方法生產(chǎn)雜交種。水稻利用雜種優(yōu)勢唯一可行的途徑就是利用雄性不育系做母本與恢復(fù)系雜交生產(chǎn)雜交種。利用雄性不育系可以省去繁雜的人工去雄程序,提高雜交制種的效率和雜交種子的產(chǎn)量。雄性不育(male sterility)是指植物在有性繁殖過程中雄蕊發(fā)育不正常,不能產(chǎn)生正?？捎幕ǚ?正常情況下不能自交受精結(jié)實；而雌蕊發(fā)育正常,能接受正常可育花粉并受精結(jié)實；雄性不育現(xiàn)象在植物中普遍存在,自1763年德國植物學家約瑟夫戈特利布克(Joseph Gottlieb Kolreute)[1]首次觀察并報道植物雄性不育的現(xiàn)象起,已有610多種植物被報道了雄性不育現(xiàn)象[2]。

1964年袁隆平在勝利秈中發(fā)現(xiàn)雄性不育株[3],自此開啟了我國水稻雜種優(yōu)勢利用的序幕。在水稻雜種優(yōu)勢利用中,利用雄性不育系技術(shù)的關(guān)鍵是不育系種子的批量繁殖。在我國水稻雜種優(yōu)勢利用中,實用的雄性不育的遺傳類型按其繁殖方式有細胞質(zhì)雄性不育系兩用核不育系和隱性核不育系三種主要類型。細胞質(zhì)雄性不育系需要選育與該不育系核基因相同的保持系來繁殖不育系種子,雜種優(yōu)勢利用需要選育基因純合的不育系、保持系和恢復(fù)系3個系統(tǒng),通常稱為“三系法”雜交水稻。兩用核不育系在花粉發(fā)育的敏感期,一定的光溫條件下花粉表現(xiàn)為雄性不育,可以進行雜交制種；而在另一光溫條件下不育系花粉則為可育,可以自交繁殖種子。環(huán)境敏感型不育系可以一系兩用,在雜種優(yōu)勢利用只需要不育系和恢復(fù)系,所以通常稱為“兩系法”雜交水稻。隱性核不育系的育性表現(xiàn)為不育性穩(wěn)定,花粉育性不受光溫影響而發(fā)生育性轉(zhuǎn)換,無法像“兩用核不育系”一樣自交繁殖不育系種子。在品種資源中無法找到保持雄性不育性的資源選育保持系,不能實現(xiàn)不育系種子生產(chǎn)。但是利用現(xiàn)代生物技術(shù)的智能不育技術(shù)[4]可以實現(xiàn)隱性核不育系的繁殖,即“第三代”雜交水稻[5]。我國水稻雄性不育系在水稻雜種優(yōu)勢利用中經(jīng)歷了“三系法”“兩系法”和“第三代”雜交水稻的發(fā)展歷程,本文綜述了我國雜交水稻主要應(yīng)用的雄性不育系在水稻雜種優(yōu)勢利用中的發(fā)展歷程和研究進展,展望了水稻雄性不育系在水稻雜種優(yōu)勢利用的發(fā)展前景,以期為我國雜交水稻的創(chuàng)新發(fā)展提供參考。

1 細胞質(zhì)雄性不育系的利用

最早報道細胞質(zhì)雄性不育系(cytoplasmic male sterility,CMS)的是日本的Weearatne和Sampath,其在日本粳稻“藤坂5號”(Fujisaka 5)與中國紅芒野生稻雜交后代發(fā)現(xiàn)雄性不育株,然后用“藤坂5號”做輪回親本回交轉(zhuǎn)育選育成“藤坂5號”細胞質(zhì)雄性不育系,由于沒有找到恢復(fù)系,未能應(yīng)用于水稻雜種優(yōu)勢利用。1966年日本Shinjyo和O’mura用印度秈稻欽蘇拉包羅Ⅱ(Chinsurah BoroⅡ)做母本與中國臺北粳稻臺中65(Taichung 65)雜交,然后用后代群體中發(fā)現(xiàn)的雄性不育株與“臺中65”連續(xù)回交,選育成“臺中65A”不育系,實現(xiàn)了不育系的繁殖?！芭_中65A”不育系育成后,找到了恢復(fù)系,實現(xiàn)了“三系”配套。但由于選用的粳稻恢復(fù)系與不育系“臺中65A”親緣關(guān)系近,雜種優(yōu)勢不強,且又是高稈品種,未能應(yīng)用于生產(chǎn)[6]。1970年袁隆平的助手李必湖在海南三亞普通野生稻中發(fā)現(xiàn)了自然突變的雄性不育株“野敗”,利用長江中下游稻區(qū)的許多秈稻品種都能保持“野敗”的雄性不育性,實現(xiàn)不育系的繁殖。國內(nèi)育種工作者從東南亞和國際水稻研究所的種質(zhì)資源中篩選出具有較強恢復(fù)能力材料,由此實現(xiàn)了水稻雜種優(yōu)勢利用的“三系”配套[6]。由于選育的不育系與恢復(fù)系親緣關(guān)系較遠,所以選育的雜交組合(南優(yōu)2號、汕優(yōu)2號)表現(xiàn)出很強的雜種優(yōu)勢,“三系”雜交水稻在我國很快就大面積推廣應(yīng)用,為我國的糧食安全做出了巨大的貢獻。

根據(jù)細胞質(zhì)來源不同,細胞質(zhì)雄性不育系可分為野敗型、岡型、D型、印尼水田谷型、矮敗型、K型、紅蓮型、包臺型和滇型等；根據(jù)花粉敗育發(fā)生的時間不同,其可分為孢子體不育和配子體不育。野敗型、岡型、D型、印尼水田谷型、矮敗型、K型花粉敗育發(fā)生在花粉母細胞形成至減數(shù)分裂期,屬孢子體不育。紅蓮型、包臺型和滇型等花粉敗育發(fā)生在二核或三核花粉期,為配子體不育。野敗型細胞質(zhì)雄性不育系是水稻雜種優(yōu)勢利用中應(yīng)用最早、應(yīng)用面積最大的細胞質(zhì)雄性不育類型[6]。

1.1 野敗型細胞質(zhì)雄性不育系

1970年11月,袁隆平的助手李必湖在海南南紅農(nóng)場的普通野生稻群中發(fā)現(xiàn)一株花藥瘦小、淡黃色、不開裂、花粉育性表現(xiàn)為典敗的雄性不育株,命名為“野敗”。長江流域早秈品種和“野敗”雜交,后代能保持“野敗”雄性不育特性。袁隆平利用“二九南1號”與“野敗”連續(xù)回交選育出“二九南1A”,顏龍安用“珍汕97”轉(zhuǎn)育出“珍汕97A”,實現(xiàn)了野敗型雄性不育系的大量繁殖。隨后,育種工作者育成了威20A、金23A、博A、龍?zhí)仄諥、川香29A、天豐A、粵豐A等在生產(chǎn)中大面積推廣應(yīng)用的不育系?！罢渖?7A”是我國雜交水稻歷史上應(yīng)用面積最大的不育系[7]。

“野敗”細胞質(zhì)雄性不育系屬孢子體雄性不育,花粉敗育發(fā)生在花粉母細胞形成期,通常不能形成花粉粒,即“無花粉型”敗育。湖南師范學院生物系[8]通過對南廣占系C35171、南陸矮系D31134、68-899系等“無花粉型”不育株進行觀察,發(fā)現(xiàn)有造孢細胞分裂異常、花粉母細胞減數(shù)分裂異常、四分體以后退化3種敗育方式。湖南師范學院生物系[9]對“野敗”二九南1號和湘早矮等不育系進行觀察,發(fā)現(xiàn)絨氈層細胞與花粉粒一起退化消失。潘坤清等[10]觀察野敗型不育系珍珠矮不育系(BC6F1)等發(fā)現(xiàn)在花粉發(fā)育的單核后期,中間層細胞液泡化導(dǎo)致絨氈層破壞消失。此時敗育的花粉已形成一個典型的花粉形態(tài),因此稱為“典敗型”花粉敗育。野敗型細胞質(zhì)雄不育系不育性穩(wěn)定,如金23A、豐源A在自然高溫條件下,不會出現(xiàn)育性波動[11～12]。

野敗型細胞質(zhì)雄性不育基因為線粒體基因WA352,它由3個線粒體開放閱讀框 orf284、orf-224、orf288和1個短SUO組成。該基因編碼的蛋白質(zhì)WA-352在花粉母細胞期的花藥絨氈層中大量累積,并與核基因編碼的線粒體蛋白質(zhì)COX11發(fā)生相互作用,抑制COX11在過氧化物代謝中的功能,觸發(fā)絨氈層過早程序性細胞死亡,導(dǎo)致隨后的花粉敗育[13]。

野敗型細胞質(zhì)雄性不育系選育成功后,水稻育種工作者利用我國主要稻區(qū)的水稻品種進行了大量測配,沒有發(fā)現(xiàn)強恢復(fù)能力的品種資源。1973年廣西農(nóng)學院的張先程率先在東南亞和國際水稻研究所的品種資源中發(fā)現(xiàn)了“泰引1號”和“IR24”具有強恢復(fù)能力和強雜種優(yōu)勢的種質(zhì),隨后全國水稻育種工作者通過廣泛測交又篩選出“IR661”“古154”等具有強恢復(fù)能力和強雜種優(yōu)勢的種質(zhì)資源。袁隆平利用“二九南1A”、顏龍安用“珍汕97A”分別與“IR24”測配,成功選育“南優(yōu)2號”和“汕優(yōu)2號”。謝華安用IR30(♀)與圭630(♂)雜交,選育出強恢復(fù)系明恢63,用明恢63與“珍汕97A”選育成的汕優(yōu)63是我國應(yīng)用范圍廣泛、應(yīng)用面積最大和推廣時間最長的雜交水稻品種[7]。

野敗型細胞質(zhì)雄性不育系育性恢復(fù)基因Rf4編碼一個線粒體定位的PPR蛋白,通過抑制WA-352轉(zhuǎn)錄來發(fā)揮作用。RF4可降解雙順反子rpl5-WA352和單順反子WA352轉(zhuǎn)錄本。育性恢復(fù)的雜交稻中恢復(fù)基因Rf4能使WA352轉(zhuǎn)錄本的豐度降低到約20%,從而使野敗型細胞質(zhì)雄性不育育性恢復(fù)正常[13]。

1.2 紅蓮型細胞質(zhì)雄性不育系

紅蓮型細胞質(zhì)不育系(CMS-HL)是武漢大學朱英國等利用海南紅芒野生稻與早秈品種蓮塘早雜交獲得的不育株與有保持能力的品種回交,選育的一類細胞質(zhì)雄性不育系。生產(chǎn)上應(yīng)用的紅蓮型不育系主要有粵泰A、叢廣41A、竹秈A和珞紅4A等。全基因組高通量測序結(jié)果發(fā)現(xiàn),珞紅3A和珞紅4A的第7號染色體上有一段長達408 481 bp的片段缺失,該缺失片段包含了OsNRAMP1和OsNRAMP5[14]。王天抗等[15]在鎘重度污染土壤中種植珞紅3A和珞紅4A,開花期用黃華占(籽粒鎘高積累)等品種授粉,收獲珞紅3A和珞紅4A雜交種,雜交種籽粒的鎘含量低于0.1 mg/kg,表明珞紅3A和珞紅4A是鎘低積累的品種資源[15]。珞紅3A和珞紅4A種質(zhì)資源的應(yīng)用將為低鎘雜交水稻的選育帶來新的技術(shù)突破。

紅蓮型細胞質(zhì)不育系屬配子體不育,花藥黃色,瘦癟,不開裂。武漢大學遺傳研究室[16]對紅芒野生稻和蓮塘早雜交選育的紅蓮型不育系進行觀察,發(fā)現(xiàn)花粉敗育主要發(fā)生在單核晚期至二核早期,敗育花粉經(jīng)I2-KI染色后呈中空圓形,稱為“圓敗型”敗育。徐樹華[17]在紅蓮-華矮15不育系中發(fā)現(xiàn),絨氈層細胞出現(xiàn)塊狀畸形增生,把鄰近花粉母細胞推向藥室中央,導(dǎo)致花粉母細胞解體。紅蓮型不育系花粉育性會受溫度影響,如粵泰A在育性敏感期遇高溫花粉可育度增加[11～12]。

紅蓮型胞質(zhì)雄性不育基因orfH79編碼一個細胞毒素肽,與細胞核編碼的線粒體mtETC復(fù)合體Ⅲ的P61亞基相互作用,干擾復(fù)合體Ⅲ的活性,使ATP和NADH生成減少,導(dǎo)致雄性不育[18～19]。

紅蓮型細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系與野敗型細胞質(zhì)的恢復(fù)基因源不同,其恢復(fù)基因有Rf5、Rf6,均編碼線粒體PPR蛋白。RF5與GRP162、RFC3互作形成復(fù)合體,加工atp6-orfH79 mRNA,完成育性恢復(fù)[20],而RF6與HXK6互作,形成新的蛋白質(zhì)復(fù)合體[21]。二者育性恢復(fù)通路相互獨立。

1.3 滇型細胞質(zhì)雄性不育系

1965年云南大學李友錚發(fā)現(xiàn)了云南秈稻與粳稻臺北8號的天然雜交不育株,用粳稻紅帽纓回交,1969年轉(zhuǎn)育成滇一型紅帽纓雄性不育系[22]。生產(chǎn)上推廣應(yīng)用的滇型不育系主要有滇榆1號A、黎榆1號A、滇尋1號A、甬粳2號A、甬粳3號A和甬粳67A等。育種工作者利用滇型不育系選育了一批適合云南高原特色的雜交粳稻,如榆雜29、尋雜36和滇雜32,這些雜交粳稻對稻瘟病抗性較強。寧波市農(nóng)業(yè)科學院用甬粳系列不育系以“粳不秈恢”模式選育出甬優(yōu)7850、甬優(yōu)1540和甬優(yōu)2640等粳秈交亞種間超級雜交稻[7]。

1.4 BT細胞質(zhì)雄性不育系

1966年日本的琉球大學新城長友在印度秈稻欽蘇拉包羅Ⅱ (Chinsurah BoroⅡ)(♀)/臺中65(Taichung 65)(♂)秈粳雜交后代發(fā)現(xiàn)雄性不育株,用該不育株與“臺中65”(粳稻)連續(xù)回交,選育成細胞質(zhì)雄性不育系“臺中65A”。BT型細胞質(zhì)雄不育系的命名來源于其雜交組合親本BoroⅡ/Taichung 65的首字母。1972年BT型不育系引入我國,1975年我國用臺中65A(♀)/黎明(♂)選育出粳稻BT型不育系黎明A[22]。BT型不育系是我國雜交粳稻應(yīng)用最廣的細胞質(zhì)雄性不育類型。生產(chǎn)上推廣應(yīng)用的不育系主要有遼5216A、遼30A、武運粳7號A、雙九A等[6]。

BT型不育系屬配子體不育,花藥呈淡黃色,瘦小,不開裂,花粉敗育的時期發(fā)生在二核晚期或三核期,花粉粒呈圓形,有淀粉積累,對I2-KI液有染色,稱為“染敗”。中山大學遺傳組[23]發(fā)現(xiàn)BT型不育系大部分花粉外部形態(tài)與保持系無明顯差異,只是極少數(shù)花粉在雙核期和三核期生殖核和核仁變小,有些則在三核期營養(yǎng)核退化,核仁變小、核膜消失,形成小粒花粉。

BT型細胞質(zhì)不育系的不育基因orf79的基因序列與紅蓮型胞質(zhì)雄性不育(CMS-HL)基因orfH-79高度相似,基因編碼差異只有5個堿基。BT型水稻中,異常的線粒體開放閱讀框orf79與加倍的atp6基因共轉(zhuǎn)錄,編碼一個細胞毒素肽,這種有毒多肽在小孢子中特異積累,導(dǎo)致配子體的雄性不育[24]。

BT型細胞質(zhì)不育育性恢復(fù)基因Rf1a和Rf1b,位于典型的Rf-1位點,是多基因簇的成員,編碼三角狀五肽重復(fù)蛋白。RF1A和RF1B都定位在線粒體上,它們分別通過內(nèi)切和降解B-atp6/orf79 mRNA的方式,阻止毒肽的形成,恢復(fù)育性。在裂解mRNA方面,Rf1a上位于Rf1b,而且RF1A除了能裂解B-atp6/orf79 mRNA外,還能促進atp6 mRNAs 的編輯[24～25]。

1.5 D1型細胞質(zhì)雄性不育類型

D1型細胞質(zhì)雄性不育系是江西宜春市農(nóng)科所以東鄉(xiāng)野生稻的優(yōu)異質(zhì)源,采用野栽交和核置換的方法選育成的孢子體無花粉型不育系,其花藥退化,敗育徹底。育成的不育系有國際油占A、油占1A、測64-7A等[26]。

D1型細胞質(zhì)雄性不育系的花粉敗育發(fā)生在小孢子母細胞減數(shù)分裂期,此時絨氈層極度空泡化并異常膨大,其降解延遲。D1型細胞質(zhì)雄性不育系的不育基因orf182是一個嵌合的線粒體基因,其轉(zhuǎn)錄翻譯的蛋白質(zhì)ORF182能夠促進ROS的積累及ATP的還原[27]。

由于恢保關(guān)系與其他細胞質(zhì)雄性不育系不同,恢復(fù)系難以選育,該型不育系在生產(chǎn)上應(yīng)用較少。

1.6 其他細胞質(zhì)雄性不育類型

印尼水田谷型細胞質(zhì)雄性不育系來源于湖南雜交水稻研究中心張慧廉在印度尼西亞水田谷6號中發(fā)現(xiàn)的不育株。其用珍汕97B/IR665雜交選育的定型株系與印水珍鼎(糯)A雜交轉(zhuǎn)育成印水型細胞質(zhì)雄性不育系Ⅱ-32A[6]。Ⅱ-32A是目前我國配組組合最多的不育系,選配的雜交組合Ⅱ優(yōu)838是長江中上游稻區(qū)中秈遲熟組對照品種[7],推廣面積大,推廣的時間較長。印尼水田谷型不育系還有優(yōu)1A、中9A和T98A等品種。

岡型細胞質(zhì)雄性不育系是四川農(nóng)業(yè)大學于1965年用西非晚稻良種岡比亞卡(Gambiaka kokum)做母本與矮腳南特雜交后代不育株回交轉(zhuǎn)育的一類不育系[7],主要有岡二九矮7號A、岡46A、萬6A。

D型細胞質(zhì)雄性不育系來源于四川農(nóng)業(yè)大學水稻研究所1972年從“Dissi D52/37/矮腳南特”的F7發(fā)現(xiàn)的不育株。育種工作者用意大利B、汕-1和297回交轉(zhuǎn)育成了D珍汕97A和D297A等一批D型細胞質(zhì)不育系[6]。D型不育系主要有D62A、宜香1A、川香28A等。選育的雜交稻D優(yōu)63推廣應(yīng)用面積較大,宜香優(yōu)2115(宜香1A/R2115)是目前長江中上游稻區(qū)推廣面積最大的優(yōu)質(zhì)雜交稻。

K型細胞質(zhì)雄性不育系是四川省農(nóng)業(yè)科學院水稻高粱研究所在1986年用云南粳稻品種K52做母本的復(fù)合雜交K/盧紅早1號、珍新粘2號的F2分離群體發(fā)現(xiàn)的不育株與豐龍早/青二矮、盧紅早1號83N5-80等回交轉(zhuǎn)育成的K青A等一系列不育系[6]。推廣應(yīng)用的不育系主要有K17A和K22A。

矮敗型細胞質(zhì)雄性不育類型是安徽省農(nóng)業(yè)科學院將江西矮桿野生稻中發(fā)現(xiàn)的雄性不育株用協(xié)珍1號轉(zhuǎn)育成的一類不育系[6]。應(yīng)用于生產(chǎn)的矮敗型不育系主要有協(xié)青早A。

上述的印尼水田谷型、岡型、D型、K型和矮敗型5種細胞質(zhì)雄性不育類型的遺傳特性均為孢子體不育,花藥干癟、瘦小,呈水漬乳白色,不開裂,花粉敗育的發(fā)生在花粉母細胞形成至減數(shù)粉裂期,表現(xiàn)為無花粉或典敗花粉粒。其恢保關(guān)系與野敗型細胞質(zhì)雄性不育系類似。水稻線粒體和葉綠體基因遺傳多態(tài)性的分析表明,岡型、D型、印尼水田谷型、矮敗型、K型細胞質(zhì)的線粒體、葉綠體DNA序列與野敗型完全一致。而紅蓮型、包臺型和滇型細胞質(zhì)彼此間不相同,來源于不同的細胞質(zhì)[28～29]。

2 兩用核不育系的利用

1973年湖北石明松在粳稻農(nóng)墾58中發(fā)現(xiàn)了雄性不育株,1981年兩系法雜交水稻利用的設(shè)想被正式提出[30]。20世紀80年代,研究人員開展了對農(nóng)墾58不育突變株的育性轉(zhuǎn)換規(guī)律的研究,1985年正式將農(nóng)墾58不育材料命名為“湖北光周期敏感核雄性不育水稻”,即“湖北光敏核不育水稻”。1987年在“863”計劃雜交水稻專題組會議上,袁隆平提議用英文字母S(sterile的字首)作為該類不育系的標志,即在不育系名字末尾加上S,區(qū)別三系雜交稻不育系的符號A。農(nóng)墾58不育材料被命名為農(nóng)墾58S[30～33]。由于只有不育系和恢復(fù)系兩系,雙親配組自由,不受恢保關(guān)系制約；不需要保持系,避免三系雜交水稻不育細胞質(zhì)的負效應(yīng)和單一細胞質(zhì)可能帶來的潛在危險。袁隆平正式提出了我國雜交水稻從“三系”到“兩系”的發(fā)展戰(zhàn)略[34]。

2.1 光敏核不育系

農(nóng)墾58S在長日高溫下不育,可進行雜交制種,在短日低溫下可育,可自交繁殖。由農(nóng)墾58S轉(zhuǎn)育的光敏核不育系主要有培矮64S、新安S、G-1S、SE21S、7001S、華 201S、N5088S 等。培矮 64S是我國應(yīng)用面積最大的兩用核不育系,目前,通過省級和國家審定的雜交稻組合有30多個,其中兩優(yōu)培九是我國第一個超級雜交稻組合。

光敏核不育系的育性轉(zhuǎn)換受光長和溫度控制,石明松[28]用光敏核不育系農(nóng)墾58S進行分期播種,發(fā)現(xiàn)單株結(jié)實率與日照長度具有高度相關(guān)性(r=0.906 7)。但在長日低溫下(24℃)農(nóng)墾58S轉(zhuǎn)為可育,而培矮64S等許多從農(nóng)墾58S轉(zhuǎn)育來的不育系育性主要表現(xiàn)為感溫性,育性感光性不強,有的甚至沒有感光性[35～37]。

光敏不育系農(nóng)墾58S不育性遺傳行為復(fù)雜,有一對基因、二對基因等遺傳模式[38]?？刂乒饷艉瞬挥曰蚴莗ms1和pms3。pms1編碼一個長鏈非編碼RNA,LDMAR(long-day-specific malefertility-associated RNA),并在長日條件下高表達。PMS1T能夠被microRNA2118識別并介導(dǎo)剪切產(chǎn)生21 nt的phasiRNAs。農(nóng)墾58S pms1剪切位點下游的SNP位點的突變,提高了microRNA2118的剪切效率,使得phasiRNAs大量積累,導(dǎo)致長日條件下雄性不育[39]。pms3基因同樣編碼一個含有1 236個堿基的lncRNA,農(nóng)墾58S中該基因一個單堿基突變,使得啟動子區(qū)域甲基化水平升高,導(dǎo)致長日條件下LDMAR轉(zhuǎn)錄水平降低,使正處于發(fā)育的花藥提前程序化死亡[40]。

2.2 溫敏核不育系

1987年7月湖南省安江農(nóng)業(yè)學校鄧華鳳在早秈品系超40/H285//6209-3中發(fā)現(xiàn)了天然不育材料,經(jīng)過自交繁殖選育成溫敏核不育系安農(nóng)S-1[41]。隨后楊仁崔在IR54輻射誘變的群體中發(fā)現(xiàn)不育株,選育成溫敏核不育系5460S。楊遠柱在不同生態(tài)類型材料抗羅早//4342/0248復(fù)合雜交的F2群體中發(fā)現(xiàn)不育株,并于1998年培育出不育起點溫度最低、育性最穩(wěn)定、種子生產(chǎn)最安全的溫敏核不育系株1S[6]。

安農(nóng)S-1在28℃下的花粉敗育主要發(fā)生在單核花粉期,大部分花粉母細胞不能正常進行減數(shù)分裂,最終產(chǎn)生碎裂的小孢子,形成“典敗型”敗育,但在32.4℃下花粉母細胞解體,形成“無花粉型”敗育[42]。安農(nóng)S-1不育與絨氈層發(fā)育異常有關(guān)。電鏡觀察顯示安農(nóng)S-1不育期花藥絨氈層上的烏氏體排列密集,且上面沉積很多物質(zhì)[43]。

溫敏核不育系安農(nóng)S-1和株1S為單基因隱性遺傳,雜交轉(zhuǎn)育不育系快。育種工作者利用雜交轉(zhuǎn)育方法選育了許多溫敏核不育系,目前生產(chǎn)上應(yīng)用的兩用不育系75%左右是溫敏核不育系。溫敏核不育系在生產(chǎn)上應(yīng)用面積較大的有Y58S、株 1S、廣占 63S、C815S、810S、陸 18S、香 125S、1892S、廣湘 24S、準 S、田豐 S、隆科 638S 和晶4155S等。株1S突破了長江中下游雜交早稻組合選育的技術(shù)難題,其中株兩優(yōu)819被農(nóng)業(yè)部評為我國首個超級雜交早稻品種。Y58S選配了Y兩優(yōu)900等8個超級雜交稻組合,以隆科638S和晶4155S選配的晶兩優(yōu)華占、晶兩優(yōu)534和隆兩優(yōu)華占目前成為我國雜交稻中的主栽品種[7]。

溫敏核不育育性轉(zhuǎn)換主要受溫度影響,育性轉(zhuǎn)換的敏感期為花粉母細胞形成至減數(shù)分裂期[35～36]。利用溫敏核不育系制種時遇上“盛夏低溫”容易使不育系育性發(fā)生反復(fù),導(dǎo)致雜種制種失敗，造成難以估量的損失。因此選育臨界溫度雙低(即引起水稻生殖障礙的生理不育臨界溫度和誘導(dǎo)育性轉(zhuǎn)換的不育臨界溫度均低)溫敏核不育水稻是降低兩系雜交水稻應(yīng)用風險的有效途徑[44]。

不同的溫敏核不育系育性的轉(zhuǎn)換溫度及對低溫持續(xù)時間的敏感性存在較大差異,因此選擇溫度穩(wěn)定的特殊生態(tài)條件才能進行自交繁殖和雜交制種[45]。溫敏核不育系的繁殖主要利用低溫冷水串灌和海南冬季自然低溫進行繁殖。低溫冷水串灌繁殖不育系的技術(shù)存在冷水資源缺乏的問題,海南冬季繁殖低溫具有不穩(wěn)定性,這均可影響不育系的繁殖產(chǎn)量等。利用低緯度、高海拔地區(qū)自然低溫條件進行溫敏核不育系的繁殖解決了溫敏核不育系繁殖產(chǎn)量低而不穩(wěn)定的技術(shù)難題[46～48]。云南保山等地已成為溫敏核不育系種子繁殖的主要基地。

生產(chǎn)大面積應(yīng)用的溫敏不育系如株1S、香125S、陸 18S、810S、廣占 63S、Y58S、C815S、1892S和廣湘24S等的不育性都是TMS5基因突變引發(fā),TMS5編碼核糖核酸酶RNase ZS1,RNase ZS1能剪切并降解3個泛素核糖體L40融合蛋白基因UbL40mRNA?；ǚ郯l(fā)育敏感期高溫使得花藥中UbL40mRNA水平上升,在tms5突變體中,RNase ZS1功能缺失,導(dǎo)致UbL40mRNA過度積累,使花粉發(fā)育受阻,花粉敗育。而野生型中高溫積累過量的UbL40mRNA能被RNase ZS1裂解,花藥發(fā)育正常,花粉育性可育[49]。溫敏不育基因TMS10編碼一個亮氨酸受體激酶,高溫條件下TMS10激酶活性在水稻花藥絨氈層的降解過程中起重要作用[50]。目前溫敏雄性不育基因TMS10并未在生產(chǎn)上利用。

2.3 短光敏核不育系

短光敏核不育系育性轉(zhuǎn)換與光敏核不育類型相反,在短日條件下表現(xiàn)為雄性不育,長日條件下轉(zhuǎn)為可育。1987年高一枝[51]發(fā)現(xiàn)短光敏不育水稻D38S。該不育系不育的臨界光照長度為13.25 h,對光周期誘導(dǎo)敏感的時期為二次枝梗穗原基分化至花粉母細胞減數(shù)分裂期[52]。

張大兵[53]報道了短日不育材料csa突變體。CSA(carbon starved anther)不育基因編碼一個R2-R3型的MYB轉(zhuǎn)錄因子,它能夠直接調(diào)節(jié)花藥中單糖轉(zhuǎn)運蛋白基因MST8(monosaccharide transporter 8）的轉(zhuǎn)錄。油菜素內(nèi)酯信號因子OsBZR1可以直接結(jié)合到CSA的啟動子上,從而促進其表達,使花藥和種子中的糖分含量顯著提高。

短光敏核不育系只能在短日條件下進行雜交制種,雜交制種基地和季節(jié)選擇存在一定的限制,目前沒有選育出實用的不育系,未在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。

2.4 低溫敏不育系

低溫敏核不育系的育性轉(zhuǎn)換與溫敏核不育系相反,在低溫條件下表現(xiàn)為雄性不育,高溫條件下轉(zhuǎn)為可育。1988年陽華秋[54]在優(yōu)質(zhì)晚秈品種3714群體中發(fā)現(xiàn)一自然突變不育株秈型短日低溫核不育系(低溫敏核不育系)。低溫不育系go543S育性主要受溫度控制,育性轉(zhuǎn)換的不育臨界溫度值為29.5℃,對溫度敏感的部位是幼穗,敏感時期為花粉母細胞形成至減數(shù)分裂期[55]。

2.5 濕敏核不育系

濕敏核不育系育性則表現(xiàn)為對環(huán)境濕度敏感。漆小泉等[56]報道了一個新的突變體hms1,其在45%、55%、60%和75%濕度下的結(jié)實率分別為0、7.3%、21.9%和72.2%,而野生型的結(jié)實率約為80%；其在濕度高于80%的環(huán)境中則育性表現(xiàn)為完全可育。

濕敏核不育基因OsOSC12/OsPTS1編碼的三萜合酶能夠催化產(chǎn)生一種二環(huán)三萜化合物“禾谷絨氈醇”,亞麻酸與棕櫚酸或硬脂酸的混合物能有效地降低脂肪酸的含量,防止變異花粉粒過度脫水,該基因功能缺失導(dǎo)致花粉包被中棕櫚酸和亞麻酸的含量明顯降低,并且完全缺少硬脂酸,使花粉粒得不到有效保護而迅速失水,最終不育[56～58]。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展,利用基因編輯技術(shù)(CRISPR-Cas9)可以快速創(chuàng)制新的光溫敏核不育材料,如利用溫敏核不育基因TMS5(ptgms2-1)、短光敏核不育基因CSA等育性相關(guān)基因進行編輯創(chuàng)制新的光溫敏核不育材料[59～63]。目前,基因編輯的不育系并沒有在生產(chǎn)上利用,主要原因是育性轉(zhuǎn)換的臨界溫度大多偏高,育性穩(wěn)定性有待改善,另一個原因是轉(zhuǎn)基因政策等因素的限制。

3 隱性核不育系的利用

隱性核雄性不育系的不育性受隱性核基因控制,不受光溫等環(huán)境影響,表現(xiàn)為終身不育。目前,在水稻中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量隱性核雄性不育材料?！盁o花粉型”隱性核不育株cyp704B2的不育基因cyp704b2主要在絨氈層中表達,其編碼的蛋白質(zhì)屬于細胞色素P450家族,在脂肪酸代謝中起重要作用。該基因功能缺失后絨氈層發(fā)育缺陷,烏氏體相對可育株變少,導(dǎo)致小孢子缺乏足夠的孢粉素,花粉囊和花粉外壁發(fā)育受阻,最終花粉敗育[64]。OsNP1編碼葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶,在絨氈層和氣孔中特異表達,影響絨氈層退化和花粉外壁形成。其功能缺失后絨氈層同樣不能形成成熟的烏氏體,導(dǎo)致水稻無花粉型敗育[65]。

脂質(zhì)代謝在雄性育性發(fā)育中起關(guān)鍵作用,其相關(guān)基因缺陷通常會引發(fā)隱性雄性不育[66]。此外,小孢子母細胞發(fā)育相關(guān)基因MSP1、絨氈層發(fā)育相關(guān)基因TDR、UDT1以及花粉囊壁蠟質(zhì)形成相關(guān)基因Wda、DPW等功能缺失后都能導(dǎo)致水稻雄性不育[67～73]。

隱性核不育類型利用的最大難度是不育系種子的繁殖,因為這類不育系找不到對應(yīng)的保持系,花粉發(fā)育期的光溫等生態(tài)環(huán)境條件也不能使不育系育性發(fā)生轉(zhuǎn)換。美國杜邦先鋒公司[74～75]利用玉米隱性核不育突變材料,將隱性核不育對應(yīng)的野生型基因、花粉致死(敗育)基因和紅色熒光篩選基因構(gòu)建一個連鎖的元件轉(zhuǎn)入隱性核雄性不育突變體中,創(chuàng)制了一個隱性核雄性不育突變體的保持系。利用該保持系自交繁殖或者與隱性核不育系授粉實現(xiàn)隱性核雄性不育繁殖的種子生產(chǎn)技術(shù),其繁殖的不育系和配制的雜交組合不含遺傳轉(zhuǎn)化元件,屬非轉(zhuǎn)基因品種,有效地回避了植物轉(zhuǎn)基因的政策限制。2010年鄧興旺等[76]用水稻隱性核不育突變體ms26/ms26(武運粳7號)轉(zhuǎn)化3個緊密連鎖的基因,即野生型雄性可育基因Ms26、花粉失活基因(Zm-aa1)和標記篩選基因(DsRed2),率先在水稻中實現(xiàn)了隱性核不育系的批量繁殖。2016年唐曉燕等[65]用EMS誘變黃華占獲得了Os-NP1突變的隱性核不育突變體Osnp1,然后用野生型基因OsNP1、Zm-aa1、DsRed2構(gòu)建了Osnp1可穩(wěn)定遺傳的保持系圳18B。其繁殖的不育系圳18A通過了廣東省種子管理站組織的專家鑒定,選配的組合圳18A/雅恢2115、圳18A/R278分別在四川、廣東完成了區(qū)試。李莉等[77]利用CRISPRCas9技術(shù)以9311為背景獲得CYP703A3功能缺陷的隱性核不育株系931103a3；然后將RF1b上的線粒體信號肽序列融合到紅蓮型細胞質(zhì)不育基因orfH79上,構(gòu)建了新的花粉致死基因；在此基礎(chǔ)上創(chuàng)建了新的“第三代”雜交水稻保持系9311-3B,并用其不育系9311-3A選育了多個強優(yōu)勢組合。該體系創(chuàng)造性地利用細胞質(zhì)雄性不育基因,擴大了花粉致死基因的選擇范圍,也提示了其他細胞質(zhì)雄性不育基因在“第三代”雜交水稻的應(yīng)用潛力。

前述的“第三代”雜交水稻保持系的標記基因DsRed2是一個源于珊瑚的紅色熒光蛋白基因,需要通過熒光分選機器將不育系種子和保持系種子分選開來,存在一定的漏選風險。2021年唐曉燕等[78]通過沉默水稻胚乳特異表達葡萄糖焦磷酸化酶基因,構(gòu)建了新的隱性核不育系繁殖技術(shù)體系。該體系繁殖生產(chǎn)的雄性不育種子具有正常的胚乳,但保持系種子受胚乳特異表達葡萄糖焦磷酸化酶基因沉默的影響,胚乳萎縮,重量變輕,通過重力風選機可分選出不育系種子。相較于熒光分選,這種分選方法分選準確度、效率有明顯提高,且成本也顯著降低。

4 展望

在水稻雜種優(yōu)勢的利用中,大量應(yīng)用于生產(chǎn)的雄性不育系主要有細胞質(zhì)雄性不育系、兩用核不育系和隱型核不育系。我國的雜交水稻利用經(jīng)歷了“三系法”“兩系法”和“第三代”雜交水稻的發(fā)展歷程。“三系法”和“兩系法”雜交水稻的成功應(yīng)用,為我國糧食安全和經(jīng)濟發(fā)展作出了重大貢獻,“兩系法”雜交水稻推動了我國水稻生產(chǎn)的超高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、綠色和輕簡化的發(fā)展,它克服了“三系法”雜交水稻不育系細胞質(zhì)單一和恢保關(guān)系限制雜交配組資源限制的難題。但“兩系法”雜交水稻不育系育性易受光溫等環(huán)境因素影響,如溫度變化可使不育系育性轉(zhuǎn)換,因而存在雜交制種失敗的風險。隨著智能不育技術(shù)的發(fā)展,利用隱性核不育系的“第三代”雜交水稻在作物雜種優(yōu)勢利用的優(yōu)點在于它既克服了細胞質(zhì)雄性不育系受恢保關(guān)系限制而在雜種優(yōu)勢利用時資源利用受限的難題,也避免了光溫敏核不育類型育性受光溫調(diào)控,尤其是溫度變化無常給雜交制種和不育系繁殖帶來的風險。水稻雄性不育系在雜種優(yōu)勢利用中關(guān)鍵是要解決不育系種子的繁殖技術(shù)和不育系育性穩(wěn)定性,隱性核不育系的不育性穩(wěn)定,雜交配組自由,利用其選育的“第三代”雜交水稻將為我國水稻雜種優(yōu)勢利用提供新時代的核心競爭力。