王 瑾 王加強 邱 洪 楊麗萍 李 佳 譚 翔

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，四川省人民醫(yī)院檢驗科，成都 610072)

免疫球蛋白A腎病(immunoglobulin A nephropathy，IgAN)是一種自身免疫疾病，由IgA1異常糖基化形成半乳糖缺陷型IgA1并被正常IgG和IgA1作用誘發(fā)，形成的免疫復(fù)合物積累會引起諸如補體激活、氧化應(yīng)激、炎癥級聯(lián)以及細胞凋亡等一系列反應(yīng)[1，2]。該病在亞洲太平洋區(qū)域的發(fā)生率較高，且發(fā)展成終末期腎病的風(fēng)險也高于其他地區(qū)[3，4]?，F(xiàn)今對IgAN病理機制的研究尚未明確，通過加深對其發(fā)病機制的理解，對于開發(fā)新的特效治療藥物具有重要意義。miRNA是一類小分子非編碼RNA，具有通過結(jié)合目標(biāo)mRNA 3′UTR區(qū)域沉默基因的能力[5]。miRNA參與多種腎病的病理生理過程，也有文獻報道了miRNA對IgAN的調(diào)控作用[6，7]。在包括IgAN在內(nèi)的諸多文獻中報道了miR-223對腎臟疾病的緩解作用，然而其具體機制尚不明確[8-10]。本研究通過建立IgAN的HK2細胞和大鼠模型，并以miR-223 mimics或agomir處理，探究miR-223在IgAN中的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞來源 人腎小管上皮細胞HK2和人腎小管系膜細胞HMC購自中科院上海細胞庫。

1.1.2實驗動物 40只SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量220～250 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，于室溫、40%相對濕度的環(huán)境條件下喂養(yǎng)14 d，期間晝夜12 h交替，水和飼料正常供給。

1.1.3主要試劑 DMEM細胞培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；牛血清白蛋白、脂多糖購自美國Sigma公司；尿蛋白、尿素氮(urea nitrogen，BUN)、血清肌酸酐(serum creatinine，SCr)、IL-1β、IL-18檢測試劑盒購自南京建成生物工程有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒SsoFastTMEva-Green?Supermix購自美國Bio-Rad公司；熒光素酶報告系統(tǒng)購自美國Promega公司；TRIzol試劑、RIPA試劑、BCA蛋白定量試劑盒、HE染色試劑、TUNEL細胞凋亡試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；pcDNA 3.1-NLRP3載體、miR-223 mimics & agomir、mimics NC、siRNA-NLRP3、siRNA-mate體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑盒購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域3(NOD-like receptor pyrin domain containing three，NLRP3)、接頭蛋白凋亡相關(guān)點狀蛋白(apoptosis-associated speck-like protein，ASC)、胱天蛋白酶1(Caspase-1)一抗以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自英國Abcam公司；所用引物由上海生工生物公司合成。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及處理方法 HK2和HMC細胞在37℃、5%CO2的環(huán)境條件下培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的DMEM細胞培養(yǎng)液。HMC細胞經(jīng)復(fù)蘇培養(yǎng)后，加入6孔板，1×106個/孔，繼續(xù)培養(yǎng)于含0.5%胎牛血清和0.5 mg/ml從IgAN患者或健康志愿者血清中提取純化聚合的IgA(polymeric IgA，pIgA)的DMEM細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)液并凍存于-80℃冰箱備用。

1.2.2細胞模型建立及分組處理 細胞分為空白對照(Control)組、pIgA組、miR-223 mimics組和miR-223 mimics+pc-NLRP3組，除Control組常規(guī)培養(yǎng)外，其余各組均培養(yǎng)于1.2.1中所制備的IgA-HMC培養(yǎng)液，按照Lipofectamine 2000試劑提供的操作說明，miR-223 mimics組轉(zhuǎn)染miR-223 mimics，miR-223 mimics+pc-NLRP3組共轉(zhuǎn)染miR-223 mimics和pc-NLRP3，轉(zhuǎn)染24 h后，低溫離心收集細胞，-80℃冰箱凍存。

1.2.3動物模型的建立及分組 大鼠隨機分為Control組、IgAN組、miR-223 agomir組和si-NLRP3組， 除Control組所有成分使用等體積溶劑代替以外，其余各組采用如下方式造模：①每天以400 mg/kg的牛血清白蛋白進行灌胃處理，持續(xù)6周；②第6周和第8周采用尾靜脈注射的方式給予0.05 mg脂多糖；③采用皮下注射的方式每周給予0.1 ml四氯化碳和0.5 ml蓖麻油混合液，持續(xù)9周。10周后觀察大鼠造模是否成功，參照標(biāo)準(zhǔn)為肉眼可見的血尿，或顯微鏡下觀察可見血尿且尿中紅細胞30%以上發(fā)生變形。造模成功后miR-223 agomir組采用尾靜脈注射給予miR-223 agomir， si-NLRP3組按照siRNA-mate體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作，尾靜脈注射給予si-NLRP3，Control組和IgAN組尾靜脈注射等體積的生理鹽水作為參照，1次/d，持續(xù)3 d。

1.2.4RT-PCR檢測基因表達 PBS緩沖液漂洗細胞，TRIzol試劑盒提取各組細胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，根據(jù)SsoFastTMEva-Green?Supermix試劑盒提供的循環(huán)條件進行PCR擴增，2-ΔΔCt法計算各組基因表達水平。

1.2.5雙熒光素酶報告基因檢測靶向作用 分別構(gòu)建NLRP3 3′UTR Lenti-reporter-luciferase野生型(WT)和突變型(MUT)載體，并分別將所構(gòu)建的載體和pRL-CMV載體共轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞，并設(shè)為NLRP3 WT組和NLRP3 MUT組，同時分別使用mimics NC或miR-223 mimics轉(zhuǎn)染兩組細胞，48 h后通過熒光素酶報告檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

1.2.6Western blot檢測蛋白表達 通過RIPA裂解液提取各組細胞或組織中的總蛋白，BCA法定量，以10% SDS-PAGE電泳分離各組蛋白，電泳結(jié)束后將蛋白通過半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并通過5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，棄去殘余液體，一抗在4℃條件下孵育過夜，TBST緩沖液清洗后，二抗孵育2 h，再通過ECL顯色液顯影，凝膠成像儀掃描并通過灰度值進行相對定量。

1.2.7血、尿生化指標(biāo)檢測 最后1次給藥之后，收集24 h內(nèi)的尿液并攪拌均勻，尿蛋白檢測專用試劑盒檢測24 h尿蛋白量。采用脫頸法處死各組大鼠，采集心尖血樣并根據(jù)SCr和BUN檢測試劑盒說明書檢測SCr和BUN濃度。

1.2.8HE染色檢測腎組織病理改變 取大鼠腎組織，4%多聚甲醛固定24 h，流水沖洗，以70%、80%、90%、95%、100%的乙醇梯度脫水30 min，二甲苯透明處理，石蠟包埋后切2 μm薄片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織病理改變。

1.2.9TUNEL染色檢測腎組織細胞凋亡 以1.2.8的方法對腎組織石蠟包埋切片，采用TUNEL細胞凋亡試劑盒對組織進行染色，光學(xué)顯微鏡下觀察凋亡細胞，每張切片選擇6個視野，統(tǒng)計凋亡細胞數(shù)占細胞總數(shù)的百分比，即為細胞凋亡率。

1.2.10ELISA檢測血清炎癥細胞因子 按照1.2.7所述方法采血，根據(jù)ELISA試劑盒操作說明書檢測血清中IL-1β和IL-18濃度。

2 結(jié)果

2.1IgAN患者及HK2細胞中miR-223和NLRP3表達水平 相較于健康對照組，IgAN患者組中miR-223表達水平降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1A)。與Control組HK2細胞相比，pIgA組中miR-223表達水平降低，NLRP3表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖1B)。

圖1 RT-PCR檢測臨床樣本和HK2細胞中miR-223和NLRP3表達水平Fig.1 RT-PCR for detecting miR-223 and NLRP3 expre-ssions in clinical sample and HK2 cellsNote:A.miR-223 expression in clinical sample，n=10;B.miR-223 and NLRP3 expressions in HK2 cells，n=6.*.P<0.05 vs IgAN patients;**.P<0.01 vs Control group.

2.2miR-223靶向作用于NLRP3 如圖2所示，與NLRP3 WT+mimics NC相比，NLRP3 WT+miR-223 mimics熒光素酶活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；NLRP3 MUT+mimics NC和NLRP3 MUT+miR-223 mimics差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 熒光素酶報告實驗檢測miR-223和NLRP3靶向作用關(guān)系Fig.2 Luciferase report assay for detecting relationship between miR-223 and NLRP3Note:n=3，**.P<0.01 vs mimics NC group.

2.3miR-223降低HK2細胞NLRP3表達水平 與Control組HK2細胞相比，pIgA組miR-223表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與pIgA組相比，miR-223 mimics組miR-223表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3A)。與Control組HK2細胞相比，pIgA組中NLRP3蛋白水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與pIgA組相比，miR-223 mimics組NLRP表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與miR-223 mimics組相比，miR-223 mimics+pc-NLRP3組NLRP3蛋白水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3B)。

圖3 RT-PCR和Western blot檢測HK2細胞中miR-223對NLRP3表達的影響Fig.3 RT-PCR and Western blot for detecting effect of miR-223 on NLRP3 expression in HK2 cell

2.4miR-223降低HK2細胞中ASC和Caspase-1蛋白水平 如圖4所示，與Control組HK2細胞相比，pIgA組中ASC和Caspase-1蛋白水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與pIgA組細胞相比，miR-223 mimics組中ASC和Caspase-1蛋白水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與miR-223 mimics組細胞相比，miR-223 mimics+pc-NLRP3組中ASC和Caspase-1蛋白水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖4 Western blot檢測miR-223對HK2細胞中ASC和Caspase-1蛋白水平的影響Fig.4 Western blot for detecting effect of miR-223 on ASC and Caspase-1 protein levels in HK2 cellsNote:n=6，**.P<0.01 vs Control group;##.P<0.01 vs pIgA group;&&.P<0.01 vs miR-223 mimics group.1.Control;2.pIgA;3.miR-223 mimics;4.miR-223 mimics+pc-NLRP3.

2.5miR-223降低IgAN大鼠尿蛋白、Scr、BUN濃度 如圖5所示，與Control組相比，IgAN組中尿蛋白、Scr和BUN濃度顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與IgAN組相比，miR-223 agomir組和si-NLRP3組中各指標(biāo)濃度顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖5 miR-223對IgAN大鼠尿蛋白、SCr和BUN濃度的影響Fig.5 Effect of miR-223 on concentrations of proteinuria,SCr and BUN in IgAN ratsNote:n=10，**.P<0.01 vs Control group;##.P<0.01 vs IgAN group.

2.6miR-223減輕IgAN大鼠腎組織病理變化 如圖6所示，Control組大鼠腎組織形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，小管排列整齊，IgAN組中出現(xiàn)腎小球體積增大，系膜增生，球囊黏連，腎小管上皮細胞空泡樣變等病理性改變；經(jīng)miR-223或si-NLRP3處理后，腎組織中的病理性改變明顯減輕。

圖6 HE染色檢測miR-223對IgAN大鼠腎組織病理變化的影響(×400)Fig.6 HE staining for observing effect of miR-223 on pathological changes of renal tissue in IgAN rats(×400)

2.7miR-223降低IgAN大鼠腎組織細胞凋亡 如圖7所示，與Control組大鼠腎組織相比，IgAN組中細胞凋亡水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與IgAN組大鼠腎組織相比，miR-223 agomir組和si-NLRP3組中細胞凋亡水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖7 TUNEL染色檢測miR-223對IgAN大鼠腎組織細胞凋亡的影響(×400)Fig.7 TUNEL staining for observing effect of miR-223 on cell apoptosis of renal tissues in IgAN rats(×400)

2.8miR-223降低IgAN大鼠血清中IL-1β和IL-18濃度 如圖8所示，與Control組相比，IgAN組血清中IL-1β和IL-18濃度顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與IgAN組相比，miR-223 agomir和si-NLRP3組血清中IL-1β和IL-18濃度顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖8 ELISA檢測miR-223對IgAN大鼠IL-1β和IL-18表達的影響Fig.8 ELISA assay for measuring effect of miR-223 on IL-1β and IL-18 expressions in IgAN ratsNote:n=10，**.P<0.01 vs Control group；##.P<0.01 vs IgAN group.

2.9miR-223降低IgAN大鼠體內(nèi)NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白水平 如圖9所示，與Control組相比，IgAN組腎組織NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與IgAN組相比，miR-223 agomir和si-NLRP3組腎組織NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖9 Western blot檢測miR-223對IgAN大鼠NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白水平的影響Fig.9 Western blot for detecting effect of miR-223 on NLRP3,ASC,Caspase-1 protein levels in IgAN ratsNote:n=10，**.P<0.01 versus Control group;##.P<0.01 vs IgAN group.1.Control;2.pIgA;3.miR-223 mimics;4.si-NLRP3.

3 討論

IgAN的病理機制至今仍有許多不明確的問題，目前的治療手段僅能緩解病情。研究表明，IgAN的病理機制與NLRP3炎癥小體密切相關(guān)。Tsai等[11]研究表明，IgA免疫復(fù)合物可激活NLRP3炎癥小體，活化的NLRP3炎癥小體可進一步活化T細胞，并激活線粒體活性氧的產(chǎn)生。有研究報道m(xù)iR-223在骨髓細胞中可靶向作用于NLRP3的3′UTR區(qū)抑制NLRP3炎癥小體激活，然而miR-223是否可以通過靶向抑制NLRP3減輕IgAN癥狀尚未見報道[12]。為了驗證這一推測，本研究首先檢測了臨床樣本中miR-223表達水平變化情況，發(fā)現(xiàn)IgAN患者體內(nèi)的miR-223表達水平顯著降低，提示miR-223具有調(diào)控IgAN的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)過IgA-HMC培養(yǎng)液培養(yǎng)的HK2細胞中miR-223表達水平降低，NLRP3表達水平升高，且miR-223過表達可顯著降低NLRP3蛋白表達。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，通過上調(diào)miR-223表達或沉默NLRP3表達均可顯著降低由IgAN引起的血、尿生化指標(biāo)升高，減輕病理改變和腎組織細胞凋亡，表明miR-223可通過調(diào)控NLRP3蛋白表達減輕IgAN引起的腎臟損傷。此外，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，miR-223與NLRP3存在靶向作用關(guān)系。上述實驗結(jié)果表明，miR-223可靶向抑制NLRP3蛋白表達，從而減輕IgAN引起的腎臟損傷。

炎癥小體是一種高分子量的多蛋白復(fù)合體，可激活下游的Caspase-1前體裂解形成活化型Caspase-1，這一過程對蛋白酶解具有重要作用[13]。Caspase-1可進一步裂解IL-1β和IL-18的前體，形成成熟的IL-1β和IL-18，其中IL-1β與IgAN發(fā)病過程中免疫介質(zhì)在腎小球內(nèi)系膜中的調(diào)節(jié)有關(guān)，IL-18則直接通過多種機制參與免疫性或非免疫性腎臟組織損傷[14，15]。炎癥小體的形成是由NOD樣受體家族成員引起的，其中NLRP3為最常見的一種NOD樣受體成員，可被大范圍的外源性和內(nèi)源性的信號分子激活。NLRP3被信號分子激活后，將解除NACHT和LRRs結(jié)構(gòu)域的相互作用，ASC是炎癥小體中的接頭蛋白，NLRP3與ASC結(jié)合后，可募集Caspase-1的前體并使其裂解活化[16-18]。為了進一步探究miR-223在IgAN中對NLRP3炎癥小體的影響，本研究檢測了IL-1β、IL-18及其炎癥小體相關(guān)蛋白水平等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)在IgAN大鼠血清中IL-1β和IL-18濃度升高，而上調(diào)miR-223表達或沉默NLRP3表達均可顯著降低IL-1β和IL-18濃度。同時，本研究發(fā)現(xiàn)在IgAN模型細胞中，炎癥小體蛋白ASC和Caspase-1蛋白水平上調(diào)，miR-223過表達可降低模型細胞中ASC和Caspase-1的蛋白水平，通過提高NLRP3的蛋白表達可拮抗miR-223的作用。而在IgAN大鼠腎組織中，NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白水平上調(diào)，通過提高miR-223表達或沉默NLRP3表達均可降低IgAN大鼠腎組織中NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白水平。以上結(jié)果表明miR-223通過靶向抑制NLRP3蛋白水平阻礙NLRP3炎癥小體的激活，從而在IgAN中發(fā)揮腎臟保護作用。

綜上所述，miR-223可通過靶向作用于NLRP3降低NLRP3蛋白水平，阻礙NLRP3炎癥小體激活，從而抑制炎癥細胞因子IL-1β和IL-18產(chǎn)生，減輕由IgAN引起的腎組織病理性損傷，降低細胞凋亡。本研究首次探明了miR-223在IgA腎病中對NLRP3炎癥小體的作用及機制，為IgAN治療提供了有潛力的靶向治療思路。