王 瑾 王加強 邱 洪 楊麗萍 李 佳 譚 翔
(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院,四川省人民醫(yī)院檢驗科,成都 610072)
免疫球蛋白A腎病(immunoglobulin A nephropathy,IgAN)是一種自身免疫疾病,由IgA1異常糖基化形成半乳糖缺陷型IgA1并被正常IgG和IgA1作用誘發(fā),形成的免疫復(fù)合物積累會引起諸如補體激活、氧化應(yīng)激、炎癥級聯(lián)以及細胞凋亡等一系列反應(yīng)[1,2]。該病在亞洲太平洋區(qū)域的發(fā)生率較高,且發(fā)展成終末期腎病的風(fēng)險也高于其他地區(qū)[3,4]?,F(xiàn)今對IgAN病理機制的研究尚未明確,通過加深對其發(fā)病機制的理解,對于開發(fā)新的特效治療藥物具有重要意義。miRNA是一類小分子非編碼RNA,具有通過結(jié)合目標(biāo)mRNA 3′UTR區(qū)域沉默基因的能力[5]。miRNA參與多種腎病的病理生理過程,也有文獻報道了miRNA對IgAN的調(diào)控作用[6,7]。在包括IgAN在內(nèi)的諸多文獻中報道了miR-223對腎臟疾病的緩解作用,然而其具體機制尚不明確[8-10]。本研究通過建立IgAN的HK2細胞和大鼠模型,并以miR-223 mimics或agomir處理,探究miR-223在IgAN中的作用機制。
1.1材料
1.1.1細胞來源 人腎小管上皮細胞HK2和人腎小管系膜細胞HMC購自中科院上海細胞庫。
1.1.2實驗動物 40只SPF級SD雄性大鼠,體質(zhì)量220~250 g,購自上海斯萊克實驗動物有限公司,于室溫、40%相對濕度的環(huán)境條件下喂養(yǎng)14 d,期間晝夜12 h交替,水和飼料正常供給。
1.1.3主要試劑 DMEM細胞培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司;Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司;牛血清白蛋白、脂多糖購自美國Sigma公司;尿蛋白、尿素氮(urea nitrogen,BUN)、血清肌酸酐(serum creatinine,SCr)、IL-1β、IL-18檢測試劑盒購自南京建成生物工程有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒SsoFastTMEva-Green?Supermix購自美國Bio-Rad公司;熒光素酶報告系統(tǒng)購自美國Promega公司;TRIzol試劑、RIPA試劑、BCA蛋白定量試劑盒、HE染色試劑、TUNEL細胞凋亡試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所;pcDNA 3.1-NLRP3載體、miR-223 mimics & agomir、mimics NC、siRNA-NLRP3、siRNA-mate體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑盒購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域3(NOD-like receptor pyrin domain containing three,NLRP3)、接頭蛋白凋亡相關(guān)點狀蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)、胱天蛋白酶1(Caspase-1)一抗以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自英國Abcam公司;所用引物由上海生工生物公司合成。
1.2方法
1.2.1細胞培養(yǎng)及處理方法 HK2和HMC細胞在37℃、5%CO2的環(huán)境條件下培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的DMEM細胞培養(yǎng)液。HMC細胞經(jīng)復(fù)蘇培養(yǎng)后,加入6孔板,1×106個/孔,繼續(xù)培養(yǎng)于含0.5%胎牛血清和0.5 mg/ml從IgAN患者或健康志愿者血清中提取純化聚合的IgA(polymeric IgA,pIgA)的DMEM細胞培養(yǎng)液,培養(yǎng)48 h后,收集培養(yǎng)液并凍存于-80℃冰箱備用。
1.2.2細胞模型建立及分組處理 細胞分為空白對照(Control)組、pIgA組、miR-223 mimics組和miR-223 mimics+pc-NLRP3組,除Control組常規(guī)培養(yǎng)外,其余各組均培養(yǎng)于1.2.1中所制備的IgA-HMC培養(yǎng)液,按照Lipofectamine 2000試劑提供的操作說明,miR-223 mimics組轉(zhuǎn)染miR-223 mimics,miR-223 mimics+pc-NLRP3組共轉(zhuǎn)染miR-223 mimics和pc-NLRP3,轉(zhuǎn)染24 h后,低溫離心收集細胞,-80℃冰箱凍存。
1.2.3動物模型的建立及分組 大鼠隨機分為Control組、IgAN組、miR-223 agomir組和si-NLRP3組, 除Control組所有成分使用等體積溶劑代替以外,其余各組采用如下方式造模:①每天以400 mg/kg的牛血清白蛋白進行灌胃處理,持續(xù)6周;②第6周和第8周采用尾靜脈注射的方式給予0.05 mg脂多糖;③采用皮下注射的方式每周給予0.1 ml四氯化碳和0.5 ml蓖麻油混合液,持續(xù)9周。10周后觀察大鼠造模是否成功,參照標(biāo)準(zhǔn)為肉眼可見的血尿,或顯微鏡下觀察可見血尿且尿中紅細胞30%以上發(fā)生變形。造模成功后miR-223 agomir組采用尾靜脈注射給予miR-223 agomir, si-NLRP3組按照siRNA-mate體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作,尾靜脈注射給予si-NLRP3,Control組和IgAN組尾靜脈注射等體積的生理鹽水作為參照,1次/d,持續(xù)3 d。
1.2.4RT-PCR檢測基因表達 PBS緩沖液漂洗細胞,TRIzol試劑盒提取各組細胞中的總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后,根據(jù)SsoFastTMEva-Green?Supermix試劑盒提供的循環(huán)條件進行PCR擴增,2-ΔΔCt法計算各組基因表達水平。
1.2.5雙熒光素酶報告基因檢測靶向作用 分別構(gòu)建NLRP3 3′UTR Lenti-reporter-luciferase野生型(WT)和突變型(MUT)載體,并分別將所構(gòu)建的載體和pRL-CMV載體共轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞,并設(shè)為NLRP3 WT組和NLRP3 MUT組,同時分別使用mimics NC或miR-223 mimics轉(zhuǎn)染兩組細胞,48 h后通過熒光素酶報告檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。
1.2.6Western blot檢測蛋白表達 通過RIPA裂解液提取各組細胞或組織中的總蛋白,BCA法定量,以10% SDS-PAGE電泳分離各組蛋白,電泳結(jié)束后將蛋白通過半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移至PVDF膜,并通過5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,棄去殘余液體,一抗在4℃條件下孵育過夜,TBST緩沖液清洗后,二抗孵育2 h,再通過ECL顯色液顯影,凝膠成像儀掃描并通過灰度值進行相對定量。
1.2.7血、尿生化指標(biāo)檢測 最后1次給藥之后,收集24 h內(nèi)的尿液并攪拌均勻,尿蛋白檢測專用試劑盒檢測24 h尿蛋白量。采用脫頸法處死各組大鼠,采集心尖血樣并根據(jù)SCr和BUN檢測試劑盒說明書檢測SCr和BUN濃度。
1.2.8HE染色檢測腎組織病理改變 取大鼠腎組織,4%多聚甲醛固定24 h,流水沖洗,以70%、80%、90%、95%、100%的乙醇梯度脫水30 min,二甲苯透明處理,石蠟包埋后切2 μm薄片,HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織病理改變。
1.2.9TUNEL染色檢測腎組織細胞凋亡 以1.2.8的方法對腎組織石蠟包埋切片,采用TUNEL細胞凋亡試劑盒對組織進行染色,光學(xué)顯微鏡下觀察凋亡細胞,每張切片選擇6個視野,統(tǒng)計凋亡細胞數(shù)占細胞總數(shù)的百分比,即為細胞凋亡率。
1.2.10ELISA檢測血清炎癥細胞因子 按照1.2.7所述方法采血,根據(jù)ELISA試劑盒操作說明書檢測血清中IL-1β和IL-18濃度。
2.1IgAN患者及HK2細胞中miR-223和NLRP3表達水平 相較于健康對照組,IgAN患者組中miR-223表達水平降低(P<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1A)。與Control組HK2細胞相比,pIgA組中miR-223表達水平降低,NLRP3表達水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,圖1B)。
圖1 RT-PCR檢測臨床樣本和HK2細胞中miR-223和NLRP3表達水平Fig.1 RT-PCR for detecting miR-223 and NLRP3 expre-ssions in clinical sample and HK2 cellsNote:A.miR-223 expression in clinical sample,n=10;B.miR-223 and NLRP3 expressions in HK2 cells,n=6.*.P<0.05 vs IgAN patients;**.P<0.01 vs Control group.
2.2miR-223靶向作用于NLRP3 如圖2所示,與NLRP3 WT+mimics NC相比,NLRP3 WT+miR-223 mimics熒光素酶活性顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);NLRP3 MUT+mimics NC和NLRP3 MUT+miR-223 mimics差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
圖2 熒光素酶報告實驗檢測miR-223和NLRP3靶向作用關(guān)系Fig.2 Luciferase report assay for detecting relationship between miR-223 and NLRP3Note:n=3,**.P<0.01 vs mimics NC group.
2.3miR-223降低HK2細胞NLRP3表達水平 與Control組HK2細胞相比,pIgA組miR-223表達水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與pIgA組相比,miR-223 mimics組miR-223表達水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,圖3A)。與Control組HK2細胞相比,pIgA組中NLRP3蛋白水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與pIgA組相比,miR-223 mimics組NLRP表達水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與miR-223 mimics組相比,miR-223 mimics+pc-NLRP3組NLRP3蛋白水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,圖3B)。
圖3 RT-PCR和Western blot檢測HK2細胞中miR-223對NLRP3表達的影響Fig.3 RT-PCR and Western blot for detecting effect of miR-223 on NLRP3 expression in HK2 cell
2.4miR-223降低HK2細胞中ASC和Caspase-1蛋白水平 如圖4所示,與Control組HK2細胞相比,pIgA組中ASC和Caspase-1蛋白水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與pIgA組細胞相比,miR-223 mimics組中ASC和Caspase-1蛋白水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與miR-223 mimics組細胞相比,miR-223 mimics+pc-NLRP3組中ASC和Caspase-1蛋白水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
圖4 Western blot檢測miR-223對HK2細胞中ASC和Caspase-1蛋白水平的影響Fig.4 Western blot for detecting effect of miR-223 on ASC and Caspase-1 protein levels in HK2 cellsNote:n=6,**.P<0.01 vs Control group;##.P<0.01 vs pIgA group;&&.P<0.01 vs miR-223 mimics group.1.Control;2.pIgA;3.miR-223 mimics;4.miR-223 mimics+pc-NLRP3.
2.5miR-223降低IgAN大鼠尿蛋白、Scr、BUN濃度 如圖5所示,與Control組相比,IgAN組中尿蛋白、Scr和BUN濃度顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與IgAN組相比,miR-223 agomir組和si-NLRP3組中各指標(biāo)濃度顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
圖5 miR-223對IgAN大鼠尿蛋白、SCr和BUN濃度的影響Fig.5 Effect of miR-223 on concentrations of proteinuria,SCr and BUN in IgAN ratsNote:n=10,**.P<0.01 vs Control group;##.P<0.01 vs IgAN group.
2.6miR-223減輕IgAN大鼠腎組織病理變化 如圖6所示,Control組大鼠腎組織形態(tài)正常,結(jié)構(gòu)完整,小管排列整齊,IgAN組中出現(xiàn)腎小球體積增大,系膜增生,球囊黏連,腎小管上皮細胞空泡樣變等病理性改變;經(jīng)miR-223或si-NLRP3處理后,腎組織中的病理性改變明顯減輕。
圖6 HE染色檢測miR-223對IgAN大鼠腎組織病理變化的影響(×400)Fig.6 HE staining for observing effect of miR-223 on pathological changes of renal tissue in IgAN rats(×400)
2.7miR-223降低IgAN大鼠腎組織細胞凋亡 如圖7所示,與Control組大鼠腎組織相比,IgAN組中細胞凋亡水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與IgAN組大鼠腎組織相比,miR-223 agomir組和si-NLRP3組中細胞凋亡水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
圖7 TUNEL染色檢測miR-223對IgAN大鼠腎組織細胞凋亡的影響(×400)Fig.7 TUNEL staining for observing effect of miR-223 on cell apoptosis of renal tissues in IgAN rats(×400)
2.8miR-223降低IgAN大鼠血清中IL-1β和IL-18濃度 如圖8所示,與Control組相比,IgAN組血清中IL-1β和IL-18濃度顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與IgAN組相比,miR-223 agomir和si-NLRP3組血清中IL-1β和IL-18濃度顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
圖8 ELISA檢測miR-223對IgAN大鼠IL-1β和IL-18表達的影響Fig.8 ELISA assay for measuring effect of miR-223 on IL-1β and IL-18 expressions in IgAN ratsNote:n=10,**.P<0.01 vs Control group;##.P<0.01 vs IgAN group.
2.9miR-223降低IgAN大鼠體內(nèi)NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白水平 如圖9所示,與Control組相比,IgAN組腎組織NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與IgAN組相比,miR-223 agomir和si-NLRP3組腎組織NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
圖9 Western blot檢測miR-223對IgAN大鼠NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白水平的影響Fig.9 Western blot for detecting effect of miR-223 on NLRP3,ASC,Caspase-1 protein levels in IgAN ratsNote:n=10,**.P<0.01 versus Control group;##.P<0.01 vs IgAN group.1.Control;2.pIgA;3.miR-223 mimics;4.si-NLRP3.
IgAN的病理機制至今仍有許多不明確的問題,目前的治療手段僅能緩解病情。研究表明,IgAN的病理機制與NLRP3炎癥小體密切相關(guān)。Tsai等[11]研究表明,IgA免疫復(fù)合物可激活NLRP3炎癥小體,活化的NLRP3炎癥小體可進一步活化T細胞,并激活線粒體活性氧的產(chǎn)生。有研究報道m(xù)iR-223在骨髓細胞中可靶向作用于NLRP3的3′UTR區(qū)抑制NLRP3炎癥小體激活,然而miR-223是否可以通過靶向抑制NLRP3減輕IgAN癥狀尚未見報道[12]。為了驗證這一推測,本研究首先檢測了臨床樣本中miR-223表達水平變化情況,發(fā)現(xiàn)IgAN患者體內(nèi)的miR-223表達水平顯著降低,提示miR-223具有調(diào)控IgAN的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)過IgA-HMC培養(yǎng)液培養(yǎng)的HK2細胞中miR-223表達水平降低,NLRP3表達水平升高,且miR-223過表達可顯著降低NLRP3蛋白表達。同時,本研究發(fā)現(xiàn),通過上調(diào)miR-223表達或沉默NLRP3表達均可顯著降低由IgAN引起的血、尿生化指標(biāo)升高,減輕病理改變和腎組織細胞凋亡,表明miR-223可通過調(diào)控NLRP3蛋白表達減輕IgAN引起的腎臟損傷。此外,雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示,miR-223與NLRP3存在靶向作用關(guān)系。上述實驗結(jié)果表明,miR-223可靶向抑制NLRP3蛋白表達,從而減輕IgAN引起的腎臟損傷。
炎癥小體是一種高分子量的多蛋白復(fù)合體,可激活下游的Caspase-1前體裂解形成活化型Caspase-1,這一過程對蛋白酶解具有重要作用[13]。Caspase-1可進一步裂解IL-1β和IL-18的前體,形成成熟的IL-1β和IL-18,其中IL-1β與IgAN發(fā)病過程中免疫介質(zhì)在腎小球內(nèi)系膜中的調(diào)節(jié)有關(guān),IL-18則直接通過多種機制參與免疫性或非免疫性腎臟組織損傷[14,15]。炎癥小體的形成是由NOD樣受體家族成員引起的,其中NLRP3為最常見的一種NOD樣受體成員,可被大范圍的外源性和內(nèi)源性的信號分子激活。NLRP3被信號分子激活后,將解除NACHT和LRRs結(jié)構(gòu)域的相互作用,ASC是炎癥小體中的接頭蛋白,NLRP3與ASC結(jié)合后,可募集Caspase-1的前體并使其裂解活化[16-18]。為了進一步探究miR-223在IgAN中對NLRP3炎癥小體的影響,本研究檢測了IL-1β、IL-18及其炎癥小體相關(guān)蛋白水平等指標(biāo),發(fā)現(xiàn)在IgAN大鼠血清中IL-1β和IL-18濃度升高,而上調(diào)miR-223表達或沉默NLRP3表達均可顯著降低IL-1β和IL-18濃度。同時,本研究發(fā)現(xiàn)在IgAN模型細胞中,炎癥小體蛋白ASC和Caspase-1蛋白水平上調(diào),miR-223過表達可降低模型細胞中ASC和Caspase-1的蛋白水平,通過提高NLRP3的蛋白表達可拮抗miR-223的作用。而在IgAN大鼠腎組織中,NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白水平上調(diào),通過提高miR-223表達或沉默NLRP3表達均可降低IgAN大鼠腎組織中NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白水平。以上結(jié)果表明miR-223通過靶向抑制NLRP3蛋白水平阻礙NLRP3炎癥小體的激活,從而在IgAN中發(fā)揮腎臟保護作用。
綜上所述,miR-223可通過靶向作用于NLRP3降低NLRP3蛋白水平,阻礙NLRP3炎癥小體激活,從而抑制炎癥細胞因子IL-1β和IL-18產(chǎn)生,減輕由IgAN引起的腎組織病理性損傷,降低細胞凋亡。本研究首次探明了miR-223在IgA腎病中對NLRP3炎癥小體的作用及機制,為IgAN治療提供了有潛力的靶向治療思路。