夏凡育，鄭美慧，李曉娜，王彥力，王 月

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040)

0 引言

目前普遍認(rèn)為NO2為一種具有一定毒性的氣態(tài)大氣污染物[2,4,5]，但從NO2對植物生理生態(tài)的影響方面來考慮，不同濃度NO2對不同植物的影響有差異，同時植物對其的應(yīng)答機(jī)制也是復(fù)雜的[13]。一些研究已經(jīng)闡明，較高濃度水平的NO2對植物生理代謝有著不利影響，但一些研究同時也表明，NO2濃度的適度提高可促進(jìn)植物生長[14-16]。相關(guān)試驗也證明了NO2可以作為氮源參加氮代謝途徑，但同時也可以作為信號分子來調(diào)控植物體的相關(guān)生理活動[16]。基于此，對于大氣NO2沉降對植物的生理生態(tài)學(xué)研究不能單純著眼于相關(guān)逆境應(yīng)答機(jī)制的探索，也要針對植物對NO2的相關(guān)代謝過程做好定量與定性的深入研究。

桑樹(Morusalba)系屬桑科桑屬落葉喬木或灌木，是一種經(jīng)濟(jì)效益與生態(tài)效益俱佳的優(yōu)良樹種[17]，在我國分布廣泛。桑樹具有良好的溫度耐受力與水分耐受力，環(huán)境適應(yīng)性很強(qiáng)，生態(tài)幅較大，可作為先鋒樹種進(jìn)行環(huán)境植被修復(fù)[18-19]。傳統(tǒng)的桑樹開發(fā)主要集中于紡織與中藥領(lǐng)域，但現(xiàn)今對于桑樹價值的開發(fā)較以往更加多元。桑葉飼料的營養(yǎng)價值較傳統(tǒng)飼料更占優(yōu)勢[20]，一些研究還發(fā)現(xiàn)桑葉和桑葚有調(diào)節(jié)免疫功能、抗氧化等效用，具有一定的藥理活性功效[21]。因此，桑樹不但具有良好的生態(tài)效益，也是我國飼料工業(yè)和食品工業(yè)中重要的原料樹種、經(jīng)濟(jì)樹種[18-22]。

一些研究已經(jīng)證明，桑樹對酸雨的適應(yīng)性較強(qiáng)[23]，相關(guān)報道也說明了NO2熏蒸桑樹可在一定程度上促進(jìn)桑樹的光合與生長發(fā)育[24]。但大氣氮素通過濕沉降途徑對桑樹產(chǎn)生的相關(guān)影響研究仍未深入。為研究大氣NO2濕沉降對桑樹葉片光合特性的影響，以黑龍江省推廣的耐鹽堿桑樹品種“秋雨?！睘椴牧?，以不同濃度的NH4NO3對桑樹葉片進(jìn)行噴施處理，并探討NO2濕沉降逆境脅迫對桑樹光合特性的相關(guān)系列影響機(jī)制，其結(jié)果可為植物對大氣NO2多途徑沉降的應(yīng)答機(jī)制以及NO2進(jìn)入植物體后的代謝過程研究提供相關(guān)數(shù)據(jù)或證據(jù)，以期為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與環(huán)境評估提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019年6月—11月在東北林業(yè)大學(xué)植物生理實驗室進(jìn)行，供試桑樹品種為黑龍江省推廣種植的主栽品種——秋雨桑，種子由黑龍江省蠶業(yè)研究所提供。發(fā)芽培育后，待供試苗木生長到20 cm時，移栽到直徑12 cm、高15 cm的培養(yǎng)缽中。為保證試驗材料的相對一致性，在移植時去掉桑樹幼苗分支和葉片，只保留主根和主莖各5 cm。每缽定植2株，共計60株。培養(yǎng)基質(zhì)由草炭土和蛭石均勻混合而成，待供試苗木生長到30～40 cm時，選用長勢一致的桑樹幼苗進(jìn)行模擬NO2濕沉降處理。

1.2 試驗方法

為模擬NO2濕沉降，取NH4NO3[10，25]溶于水。根據(jù)相關(guān)研究[26]，本試驗設(shè)置3個氮沉降梯度[26]，分別為20 mmol/L(D20)、35 mmol/L(D35)、50 mmol/L(D50)，另以清水對照組(CK)。為排除NO2濕沉降對桑樹根系的影響，在噴施時用塑料布將盆體上層浮土覆蓋，以減少根系吸收。考慮到氣孔分布因素，同時對桑葉片正反面噴施酸雨，直到重度脅迫處理葉片出現(xiàn)病癥時開始檢測各指標(biāo)項目。每個處理梯度設(shè)置5次重復(fù)。

1.3 測定項目及方法

利用M-PEA型植物效率儀(Hansatech，英國生產(chǎn))測定30 min暗適應(yīng)后的桑樹幼苗葉片第3片完全展開葉片的葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)曲線(OJIP曲線)和820 nm光吸收曲線。在OJIP曲線測定過程中，誘導(dǎo)光強(qiáng)為3 000 μmol·m-2·s-1的脈沖紅光。從10 μs開始記錄相對熒光強(qiáng)度(Fv)，至2 s結(jié)束，其中曲線上O、J、I和P點分別表示當(dāng)時間為0、2、30和1 000 ms時曲線上對應(yīng)的點。參照Stasser[27]的計算方法進(jìn)行JIP-test分析，測定PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、PSⅡ潛在光化學(xué)活性(Fv/Fo)、光能吸收性能參數(shù)(PIABS)、PSII受體側(cè)QA的積累(VJ)、PQ 庫的異質(zhì)性(VI)、QA氧化還原次數(shù)(N)、光化學(xué)反應(yīng)集聚能量 (ABS/RC)、QA氧化還原反應(yīng)消耗能量 (TRo/RC)、光化學(xué)反應(yīng)中心捕獲的用于電子傳遞能量 (ETo/RC)、光化學(xué)反應(yīng)消耗能量 (DIo/RC)和單位面積有活性的反應(yīng)中心數(shù)目(RC/CSm)。PSⅠ反應(yīng)中心活性通過820 nm光吸收的最大值(Io)與最小值(Im)差值的相對值來表示，即△I/Io=(Io-Im)/Io。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運用Microsoft Excel(2010)和DPS(7.05)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，使用單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小顯著差異分析(LSD)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)組間的差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NO2濕沉降對桑樹葉片OJIP曲線的影響

在不同濃度梯度處理下，桑樹葉片OJIP曲線形態(tài)發(fā)生了較為明顯的變化。在O點，各組的相對熒光強(qiáng)度變化并未出現(xiàn)顯著性差異，但在分析各組J點、I點和P點時，不同的濃度，組間變化非常明顯，其中I點和P點變化較為顯著。定量分析發(fā)現(xiàn)：D20組的J點、I點和P點3點皆高于CK組；D35組的J點、I點和P點3點皆低于CK組；D50組的J點、I點和P點同樣均低于CK組，但較D35的3點明顯處于相對更低的熒光水平。

圖1 不同濃度NO2濕沉降對桑樹葉片OJIP曲線的影響Fig.1 Effects of different concentrations of NO2 wet deposition on OJIP curves of mulberry leaves

2.2 不同濃度NO2濕沉降對桑樹葉片PSI活性參數(shù)ΔI/Io的影響

從圖2可以明顯看出，不同處理組的820 nm光吸收值差異明顯，即PSI活性參數(shù)變化較為明顯。在低濃度處理下，葉片PSI活性較CK明顯提高，D20組的ΔI/I0值明顯高于對照組(CK)，幅度較比CK增長了36%(P<0.01)。而在高濃度處理下，D35、D50組的PSⅠ最大氧化還原能力均低于CK，且在所設(shè)置的最高濃度組D50組中下降最為顯著，兩組中D35組較CK下降幅度為21.8%(P<0.01)、D50組較CK下降幅度為40%(P<0.01)。在高濃度NO2濕沉降處理下，植物葉片光系統(tǒng)的PSⅠ活性受到了一定程度的抑制，但相對于兩個高濃度處理組，在低濃度NO2濕沉降處理下，植物葉片的PSⅠ活性明顯受到了促進(jìn)。

圖2 不同濃度NO2濕沉降對桑樹葉片PSI活性參數(shù)ΔI/Io的影響Fig.2 Effects of wet deposition of different concentrations of NO2 on PSI activity parameters ΔI/Io of mulberry leaves

2.3 不同濃度NO2濕沉降對桑樹葉片F(xiàn)v/Fm、Fv/Fo、Fo/Fm和PIABS的影響

圖3表明，在經(jīng)過NO2濕沉降處理后的桑樹葉片上，其Fv/Fm、Fv/Fo、Fo/Fm、PIABS發(fā)生了一定程度的變化。與CK相比，D20處理組的Fv/Fm、Fv/Fo、PIABS3個參數(shù)各增長了4.2%(P>0.05)、16.2%(P<0.01)和78.8%(P<0.01)，而兩個高濃度處理組的Fv/Fm、Fv/Fo、PIABS3個參數(shù)均低于CK組，且D50組下降程度明顯高于D35組，可以看出Fv/Fo、PIABS變化程度較為顯著，F(xiàn)v/Fm同樣產(chǎn)生變化，但整體幅度并不明顯。上述變化反映了葉片PSⅡ的光化學(xué)活性受到了抑制，從而抑制了光化學(xué)反應(yīng)，降低了PSII最初光能轉(zhuǎn)換效率以及電子傳遞速率，導(dǎo)致原初反應(yīng)受到抑制，說明低濃度NO2濕沉降處理對PSⅡ反應(yīng)中心活性具有促進(jìn)作用，但在相對高濃度時，抑制了反應(yīng)中心活性。

圖3 不同濃度NO2濕沉降對桑樹葉片F(xiàn)v/Fm、Fv/Fo、Fo/Fm、PIABS的影響Fig.3 Effects of different concentrations of NO2 wet deposition on Fv/Fm,Fv/Fo,Fo/Fm and PIABS of mulberry leaves

2.4 不同濃度NO2濕沉降對桑樹葉片Area、VJ、VI、Sm、N的影響

Area可代表PSⅡ受體側(cè)PQ庫對電子接受能力的大小，各組材料的電子接受能力為D20>CK>D35>D50。VJ在不同濃度處理下所表現(xiàn)出的變化不同。高濃度處理相對于CK抑制了反應(yīng)中心的開放，但低濃度下有效促進(jìn)了反應(yīng)中心的開放程度。VI代表電子經(jīng)過QB時的能量耗散比率，由圖4可知，只有D35組相較于CK上升了3.7%(P>0.05)，而其他兩個處理組皆低于對照組。Sm表示質(zhì)體醌庫大小，可以看出隨著處理濃度的提高，整體質(zhì)體醌庫大小隨濃度呈現(xiàn)正比例關(guān)系，D50>D35>D20>CK，N的變化較為明顯，隨著處理濃度的增加，各組均呈現(xiàn)高于CK對照組的情況，其中D50>D35>D20>CK。

圖4 不同濃度NO2濕沉降對桑樹葉片Area、VJ、VI、Sm、N的影響Fig.4 Effects of different concentrations of NO2 wet deposition on Area,VJ,VI,Sm and N of mulberry leaves

2.5 不同濃度NO2濕沉降對桑樹葉片ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC、ETo/RC的影響

ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC、ETo/RC是4個重要的單位反應(yīng)中心比活性參數(shù)。圖5表明，經(jīng)NO2濕沉降處理后的桑樹葉片QA處于可還原態(tài)時，PSⅡ反應(yīng)中心傳遞情況隨濕沉降處理濃度的改變同樣產(chǎn)生了變化。低濃度水平下，單位反應(yīng)中心吸收的光能(ABS/RC)、用于還原QA的能量(TRo/RC)、用于電子傳遞的能量(ETo/RC)及耗散的能量(DIo/RC)均變小，而在高濃度水平下，各部分捕獲或耗散的能量較低濃度處理組開始升高，其中除ETo/RC外，普遍高于CK。低濃度D20組的ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC、ETo/RC較CK數(shù)據(jù)水平分別降低了34.1% (P<0.01)、42.0% (P<0.01)、30.4%(P<0.01)、20.6%(P<0.01)。而高濃度組的相關(guān)數(shù)據(jù)較D20組顯著升高，并且隨著處理濃度的加大，能量流參數(shù)值升高程度也隨之提升，普遍呈現(xiàn)出D50>D35>D20的情況。

圖5 不同濃度NO2濕沉降對桑樹葉片ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC、ETo/RC的影響Fig.5 Effects of different concentrations of NO2 wet deposition on ABS/RC,DIo/RC,TRo/RC and ETo/RC of mulberry leaves

3 討論

通過整個試驗發(fā)現(xiàn)NO2濕沉降處理下NO2處理濃度與葉片光合特性的關(guān)系，在相對低濃度處理時呈現(xiàn)促進(jìn)光合現(xiàn)象，在相對高濃度處理時呈現(xiàn)抑制光合現(xiàn)象。

葉綠素?zé)晒馀c植物的原初反應(yīng)關(guān)系密切，為了解植物PSⅡ原初反應(yīng)相關(guān)情況，對樣品進(jìn)行了快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)曲線(OJIP曲線)及JIP-Test分析[28]。通過OJIP曲線形狀可以看出，曲線形狀在不同濃度處理下發(fā)生的變化較為顯著，PSII的結(jié)構(gòu)和功能受到了不同處理條件的影響。整體來看，較比CK曲線，在低濃度濕沉降處理下，20 mmol/L(D20)處理組有相對更高的曲線，說明植物葉片的原初反應(yīng)呈現(xiàn)更加活躍的趨勢，這與劉會芳等人[29]的結(jié)果類似。而在高濃度處理時，整體原初反應(yīng)受到抑制，這與王月等人[23]和胡月等人[30]的試驗結(jié)果較為相似。在Fv/Fm、Fv/Fo、Fo/Fm等數(shù)據(jù)中，樣品的整體最大光化學(xué)效率浮動幅度并不明顯，這表明了光系統(tǒng)II 反應(yīng)中心的先增進(jìn)活性再抑制活性的過程。Vj反映了PSII有活性反應(yīng)中心的關(guān)閉程度，與對照植物相比，低濃度下Vj明顯下降，可初步證明PSII反應(yīng)中心的活性和反應(yīng)中心的開放程度得到了加強(qiáng)，這一點亦可從OJIP曲線J點前部分得到證明。D20組具有更小的熒光信號，反應(yīng)中心的開放促進(jìn)了葉片的電子傳輸，從而加速了NADPH和ATP的合成以及轉(zhuǎn)化。胡彥波等人對楊樹研究發(fā)現(xiàn)[31]，高濃度NO2熏蒸所模擬的NO2干沉降處理抑制了葉片的最大光化學(xué)效率。而本試驗中，隨著處理濃度加大，不同濃度處理組的性能指數(shù)PIABS表現(xiàn)不同，低濃度處理組(D20)的性能指數(shù)和CK相比提高，而高濃度處理組的性能指數(shù)相對于對照組明顯下降，可見高濃度濕沉降處理下的桑樹的光合性能明顯受到了抑制。

一般認(rèn)為，植物在逆境情況下，其光系統(tǒng)會產(chǎn)生不同程度的光抑制[32-33]，而在光系統(tǒng)Ⅰ中，PSⅠ最大氧化還原能力是目前經(jīng)常用來討論PSⅠ功能活性的重要參數(shù)[34-35]。王帥等人發(fā)現(xiàn)，在氮肥施加下，可以提高玉米的PS1活性參數(shù)ΔI/I0，但高濃度的效果差于低濃度[36]。在本試驗中可以看到，PSⅠ的功能活性呈現(xiàn)低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的趨勢，高濃度的處理會造成反應(yīng)中心的功能性衰減。PSⅠ和PSⅡ之間存在著連續(xù)性作用[37]，相關(guān)研究也證實了PSⅠ的活性受PSⅡ影響較大[37]，且有研究表明PSⅡ活性下降時，PSⅠ的光抑制現(xiàn)象可以得到緩解[38]。但本試驗中，低濃度組的PSⅠ活性仍呈高位，說明低濃度處理組在電子傳遞增加的情況下，處理條件增強(qiáng)了PSⅠ反應(yīng)中心的功能活性。而在高濃度處理時，盡管電子傳遞能力變?nèi)?，但PSⅠ的反應(yīng)中心卻產(chǎn)生了損傷，導(dǎo)致最大氧化還原能力下降。

ABS/RC、TRo/RC、DIo/RC、ETo/RC是反應(yīng)中心比活性參數(shù)，可以用來討論反應(yīng)中心能量流的大小[28]。其中，整體呈現(xiàn)出低濃度組低于對照，而高濃度區(qū)間高于對照且呈現(xiàn)正比例關(guān)系。低濃度組下各項指標(biāo)的下降原因，結(jié)合活性參數(shù)分析，該濃度下整體光合效率較比CK得到了提升，而在光系統(tǒng)活性與開放程度皆得到提升的情況下，吸收的光能更多地用于光合作用，所以使得整個系統(tǒng)呈現(xiàn)出一種低耗能高效率的運行狀態(tài)；而高濃度組則恰恰相反，整體光系統(tǒng)的活性與光合效率由于受到反應(yīng)中心功能活性的抑制或破壞，同時也存在著與碳同化產(chǎn)生競爭性抑制的可能，故呈現(xiàn)出高耗能低效率的能量利用情況。

模擬NO2濕沉降對電子傳遞情況也產(chǎn)生了顯著影響。在Vj與Vi上升時，電子傳遞鏈中電子傳遞受阻[39]；PSⅡ電子鏈?zhǔn)荏w側(cè)的變化可以在Area中反映出來[40-41]，但Area的變化卻呈現(xiàn)低濃度高水平。而高濃度低水平的現(xiàn)象；PIABS光合系統(tǒng)性能指數(shù)既可以反映原初光化學(xué)量子產(chǎn)額，也可反映出反應(yīng)中心的密度、電子在PSI和PSII間的傳遞情況以及光系統(tǒng)的活性。很多時候，當(dāng)Fv/Fm未出現(xiàn)明顯波動時，PI參數(shù)已經(jīng)發(fā)生很大變化[42]?？梢钥吹?，Sm(質(zhì)體醌庫)隨濃度不斷升高；N，即QA周轉(zhuǎn)次數(shù)的變化呈現(xiàn)先低后高的態(tài)勢；高濃度處理下的PS I和PS II間的電子傳遞顯著降低，這說明了電子傳遞鏈的受體側(cè)已經(jīng)出現(xiàn)抑制甚至破壞現(xiàn)象。

4 結(jié)論

本試驗說明了大氣NO2濕沉降對桑樹葉片光合特性的影響非常明顯，但不同濃度的濕沉降對植物的影響效應(yīng)不同。在低濃度下呈現(xiàn)出促進(jìn)光合的現(xiàn)象，主要因低濃度濕沉降處理條件促進(jìn)了光系統(tǒng)Ⅰ和光系統(tǒng)Ⅱ的活性以及反應(yīng)中心的開放程度，而在高濃度下則導(dǎo)致抑制光合現(xiàn)象的出現(xiàn)，這是由于反應(yīng)中心活性受到抑制、光合反應(yīng)中心開放程度減小、電子鏈傳遞能力降低所導(dǎo)致?？梢猿醪阶C明，大氣NO2濕沉降對桑樹的光合特性具有高抑制、低促進(jìn)的兩重性。