冷超糧/南陽理工學(xué)院 473000

1 研究背景

豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）是豬的一種急性、高度接觸性的傳染性病毒。它引起的豬瘟（Classical swine fever,CSF），臨床上主要表現(xiàn)為稽留高熱、皮膚和粘膜有大量出血點(diǎn)以及白細(xì)胞減少癥等。CSF被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）和我國農(nóng)業(yè)部列為一類動(dòng)物傳染病。各年齡段、各類型豬均易感。因其流行廣，發(fā)病率及死亡率高，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，多種CSFV新亞型變異毒株不斷出現(xiàn)，給該病的防控帶來了更為嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。因此，建立快速、靈敏、成本低又操作方便的檢測方法十分必要。本實(shí)驗(yàn)將建立新型豬瘟病毒熒光定量RT-PCR檢測方法。

2 實(shí)驗(yàn)方法和步驟

2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室保存的CSFV毒株HNC1NS5B的基因序列，比對GenBank中CSFV各亞型代表株，Shimen（AF092448）、HCLV（AF091507）、Brescia（AF091661）、Paderborn（GQ902941）、Alfort（J04358）、Zj0801（FJ529205）和JSZL（KT119352）的5‘NTR序列，設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增目的片段大小為98bp，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成；

上游引物QCSFV-F，序列為：CCCTCCAGCGACGGCCG；

下游引物QCSFV-R，序列為：ACTTAGACCACCCAGGGAG；

2.2 5‘NTR基因的克隆

2.2.1 待PK-15細(xì)胞長到單層約90%密度時(shí)，將培養(yǎng)基棄去并用PBS溶液洗滌2次，按照MOI: 0.5的量將CSFV HNC1病毒液加入T25培養(yǎng)瓶中，并補(bǔ)充無血清的DMEM培養(yǎng)基至5mL，將培養(yǎng)瓶放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4～5d，然后將培養(yǎng)瓶放入-80℃冰箱，反復(fù)凍融3次后將病毒液取出，以9000g離心5min，取上清-80℃保存?zhèn)溆?。病毒RNA提取按照北京全式金生物技術(shù)有限公司EasyPure?Viral DNA/RNA Kit試劑盒說明書，取200μL已離心的病毒液上清進(jìn)行總RNA提取。

2.2.2 按照北京全式金生物技術(shù)有限公司TransScript?-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，總cDNA樣品保存至-80℃?zhèn)溆谩０凑毡本┤浇鹕锛夹g(shù)公司Trans Taq DNA Polymerase High Fidelity (HiFI)試劑盒說明書進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系 為 20μL：10×HiFi Buffer I：2μL；2.5mM dNTPs：2μL；QCSFV-F：1μL（終濃度為 0.1μM）；QCSFV-R：1μ（ 終濃度為 0.1μM）L；HiFi DNA polymerase：0.5μL；cDNA：1μL；ddH2O: 12.5μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，再以35個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，最后再72℃延伸10min。

PCR擴(kuò)增完成后，取10μL產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳確定，鑒定為陽性的PCR產(chǎn)物用OMEGA Gel Extraction Kit試劑盒純化回收，然后克隆到pMD18-T載體，并轉(zhuǎn)化到DH5α平板，挑取陽性克隆，并進(jìn)行測序鑒定。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用OMEGA Plasmid Mini Kit I試劑盒提取重組質(zhì)粒，然后用紫外分光光度計(jì)定量。將計(jì)算好拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)DNA模板以10倍系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋為終濃度在4.49×102～108copies/μL。定量RT-PCR反應(yīng)體系為25μL：SYBR?Premix Ex Taq（2×）：12.5μL；QCSFV-F：1μL（終濃度為 0.1μM）；QCSFV-R：1μL（終濃度為 0.1μM）；DNA模板：2μL；ddH2O: 8.5μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 10min，再以39個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，最后再先降到65℃持續(xù)5s，再升到95℃，再增加0.5℃結(jié)束，用以來繪制溶解曲線。儀器使用BIO-RAD CFX96TM Real Time System。

2.4 敏感性、特異性、重復(fù)性試驗(yàn)

2.4.1 利用普通PCR和本實(shí)驗(yàn)建立的熒光定量RT-PCR檢測方法分別檢測100～107TC ID50/m L不同模板量的病毒液，比較兩種方法檢測的敏感性。

2.4.2 利用本實(shí)驗(yàn)建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測方法，分別檢測CSFV HNC1株、PRRSV、PRV、PEDV 和PCV2。進(jìn)行特異性試驗(yàn)。

2.4.3 取拷貝數(shù)為 105copies/μL、106copies/μL、107copies/μL的模板分別進(jìn)行5次批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)，以驗(yàn)證 CSFV 熒光定量RT-PCR檢測方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

2.5 臨床樣品的檢測 臨床組織樣品（肺、脾、腎和淋巴結(jié)等），經(jīng)勻漿后離心取上清或血清樣品，按照前述的RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)方法進(jìn)行檢測。根據(jù)熒光定量PCR的結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中病毒的含量。熒光定量PCR儀會(huì)自動(dòng)顯示樣品的濃度。

3 結(jié)果判斷

3.1 5‘NTR基因的克隆 以 CSFV HNC1cDNA 為模板，利用自行設(shè)計(jì)的引物，PCR 擴(kuò)增 5‘NTR基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測，與 DNA Marker 比較，結(jié)果顯示在98bp 有特異性 DNA 條帶，鑒定為陽性的PCR產(chǎn)物（見圖1）。

圖1 CSFV HNC1 5‘NTR基因的PCR擴(kuò)增

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 對樣品進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測，使用儀器BIO-RAD CFX96TM Real Time System，繪制溶解曲線。在稀釋的線性濃度范圍內(nèi)，模板量與對應(yīng)的Ct值之間線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.998。Ct值分別為32.78、28.84、24.83、21.05、17.28、14.03和 9.49，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為 -3.780，截距為42.686，直線方程為y=-3.780x+42.686（圖2）。

圖2 熒光定量RT-PCR檢測CSFV的擴(kuò)增曲線（A）和標(biāo)準(zhǔn)曲線（B）

3.3 敏感性試驗(yàn) 普通PCR最低能檢測到105TCID50病毒液（圖3），而該方法能檢測的最低模板量為101TCID50病毒液（圖4），比普通PCR檢測方法敏感10000倍。

圖3 普通RT-PCR檢測CSFV敏感性試驗(yàn)結(jié)果

圖4 熒光定量RT-PCR檢測CSFV敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3.4 特異性試驗(yàn) 利用本實(shí)驗(yàn)建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測方法，檢測只有CSFV HNC1株檢測結(jié)果為陽性，其他對照樣品檢測結(jié)果均為陰性（圖5）

圖5 熒光定量RT-PCR檢測CSFV特異性試驗(yàn)結(jié)果

3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取拷貝數(shù)為 105copies/μL、106copies/μL、107copies/μL的模板分別進(jìn)行5次批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果顯示批內(nèi)變異系數(shù)均小于1%，批間變異系數(shù)均小于2%，說明該方法具有較好的重復(fù)性（見下表）。

C o p i e s/μ L n V i r a l s a m p l e s批內(nèi)重復(fù)域值（C T值）批間重復(fù)域值（C T值）M e a n s S D C V(%)M e a n s S D C V(%)S a m p l e 1 1 0 5 5 2 2.5 1 0.2 2 0.9 7 2 2.9 4 0.3 7 1.6 6 S a m p l e 2 1 0 5 5 1 9.4 5 0.1 1 0.5 5 1 9.6 3 0.3 0 1.5 3 S a m p l e 3 1 0 5 5 1 5.2 2 0.1 4 0.9 4 1 5.1 1 0.2 2 1.4 7

4 小結(jié)

目前CSFV的病原檢測方法有間接免疫熒光（IFA）、抗原捕獲ELISA、普通的RT-PCR和熒光定量RT-PCR等。IFA需要較昂貴的顯微鏡和有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)人員，且該法經(jīng)驗(yàn)性較強(qiáng)，耗時(shí)長，難度大。基于抗原捕獲ELISA法的試劑盒主要依賴進(jìn)口，價(jià)格昂貴，而且敏感度較低，不利于普及。普通的RT-PCR方法具有操作簡便、快速和特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，但在病毒含量較低時(shí)，會(huì)出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。熒光定量RTPCR方法具有更高的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn)，受到多數(shù)學(xué)者的青睞。之前有學(xué)者成功建立了基于探針的熒光定量RT-PCR方法，但該法過于昂貴，且需要特殊的配套儀器。其他學(xué)者有建立的基于熒光染料的熒光定量RT-PCR方法，但使用的引物是基于病毒的變異較大E2蛋白設(shè)計(jì)，特異性差，不利于對多種不同亞型CSFV毒株的擴(kuò)增。

由于以上存在的諸多問題，本實(shí)驗(yàn)參考國內(nèi)外流行的多種CSFV亞型毒株，基于高度保守的5‘NTR區(qū)，設(shè)計(jì)合成特異性引物，成功建立了豬瘟病毒SYBR?Green I熒光定量RT-PCR檢測方法。該法具有較好的特異性、敏感性和重復(fù)性，可用于所有亞型CSFV毒株的的快速檢測。