葉遠俊，譚健俊，李冬梅，劉金梅，柯 帥，鄭夏華，徐曄春

（1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境園藝研究所/廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室，廣東 廣州 510640；2. 湛江創(chuàng)景園農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，廣東 湛江 524003）

【研究意義】姜荷花（Curcuma alismatifolia）隸屬于姜科姜黃屬，是一種多年生的球根花卉，因其花型優(yōu)美、花期持久、花色艷麗等優(yōu)點，可廣泛用于街邊綠化、公園造景和花海設計中[1]。姜荷花自然花期為6—10月，生長適宜溫度為26～30 ℃，非常適合在廣東等亞熱帶地區(qū)種植和推廣。此外，姜荷花瓶插壽命可達15 d，是一種高檔切花品種，具有很高的經(jīng)濟效益，開發(fā)利用前景廣闊[2]。目前市場上主流的姜荷花品種大多數(shù)引進自泰國，我國姜荷花新品種選育處于起步階段，具有自主知識產(chǎn)權(quán)的品種較為缺乏[3]。在新品種選育方面，姜荷花主要采用雜交育種，但姜荷花的種子種皮較硬，外層被蠟質(zhì)，對外界刺激響應慢，具有一定的硬實特性。自然條件下，姜荷花種子休眠期較長，發(fā)芽時間通常為5月份左右，從收獲種子到萌芽長達6個月?？紤]到姜荷花秋冬季地上部分停止生長，正常萌芽的種子生長期只有6個月，當年播種的實生苗難以開花，延緩了新品種選育進程。而且，正常播的種子出苗極不整齊，不能滿足大批量育苗的需求。因此，迫切需要尋找打破姜荷花種子休眠的方法，提前發(fā)芽期并提高發(fā)芽勢和發(fā)芽率，縮短育種周期。

【前人研究進展】目前，對姜荷花的研究主要集中在資源鑒評、組培快繁、分子遺傳等方面，對姜荷花種子打破休眠的問題報道較少[4-6]。對同類型硬實種子研究表明，打破種子休眠的方法包括層積處理、激素浸種處理、熱水浸種處理、機械破皮處理、強氧化劑處理等[7-8]。其中激素和熱水浸種處理具有取材簡單、操作容易、廢液回收處理方便等優(yōu)點，常作為生產(chǎn)實踐的有效手段。吳玉霞等[9]研究發(fā)現(xiàn)，60～80 ℃的熱水浸種可以有效解除文冠果種子休眠，發(fā)芽率為對照的10倍，幼苗長勢較好。蘇曉敏等[10]研究了熱水處理對14種植物種子萌芽的影響，發(fā)現(xiàn)熱水可有效解除某些硬實種子的機械休眠，在生產(chǎn)實踐中可選用這種經(jīng)濟環(huán)保的處理方式。在研究激素對種子休眠的影響中，赤霉素（GA3）和脫落酸（ABA）是最主要的兩種，兩者存在相互拮抗的關系，其中GA3可以解除種子休眠，而ABA則會誘導種子進入休眠進而延遲萌芽[11]。李植良等[12]研究不同濃度的GA3對茄子種子萌發(fā)和植株生長的影響，發(fā)現(xiàn)高濃度的GA3（＞1 000 mg/L）對解除茄子種子休眠具有顯著效果，且對一葉一心期株高有極顯著的增加。田琳琳等[13]探討不同處理對霧靈香花芥種子萌發(fā)的影響，結(jié)果表明種子萌發(fā)的最適溫度為20 ℃，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)及幼苗根長隨著GA3濃度的增加呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，當GA3濃度達到500 mg/L時，發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)達到最大。

【本研究切入點】本課題組在2019年3—5月進行種子萌芽的初步試驗，分別利用低溫（4℃）冷藏30 d及不同濃度（50、100、150、200 mg/L）GA3處理，發(fā)現(xiàn)低溫冷藏處理效果不佳，不能真正打破姜荷花種子休眠。赤霉素處理雖然一定程度打破休眠，但是效率并不高，出苗也不整齊，可能與赤霉素濃度、浸種時間及溫度有關?？紤]到姜荷花種子硬實的特性，在前期工作的基礎上，本研究利用激素和熱水分別對種子進行浸種處理，激素種類、濃度、熱水溫度、浸種時間各有差異，同時進行激素和熱水的組合處理，比較不同方法對姜荷花種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響。【擬解決的關鍵問題】以姜荷花雜交種子為研究對象，通過不同浸種處理方法，對比分析姜荷花種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率，篩選破除休眠最有效的處理方法，為姜荷花雜交育種提供便利，加快新品種選育進程。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料選取2019年姜荷花雜交F1代種子（姜荷花‘春天’× 姜荷花‘斯嘉麗’），使用的外源激素（GA3、IBA和6-BA）購自上海生工生物工程股份有限公司，試驗于2020年3—5月在廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用重點實驗室內(nèi)進行。

1.2 試驗方法

挑選外觀飽滿，干凈無損傷的姜荷花種子，每100粒作為一個處理組，放入50 mL離心管，先用0.5%多菌靈浸泡消毒15 min，消毒后用無菌水沖洗2～3次瀝干備用。

1.2.1 不同激素處理 選用3種外源激素，分別用濃度梯度50、100、200、400、800、1 000 mg/L的GA3，濃度梯度 50、100、200、400 mg/L的 IBA和濃度梯度10、50、100、150 mg/L的6-BA進行處理。將種子倒入50 mL配制好的激素溶液，放在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中浸泡24 h，無菌水浸泡24 h作為對照，每種處理3次重復。處理完成后用紗布過濾種子，無菌水沖洗2～3次，分散放入鋪有2層滅菌濕潤濾紙的90 mm培養(yǎng)皿中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)。

1.2.2 不同溫度熱水浸種處理 利用45、60、80 ℃熱水分別浸泡處理種子5、10、15 min，每種處理3次重復。處理完成后過濾取出種子，分散放入鋪有2層滅菌濕潤濾紙的90 mm培養(yǎng)皿中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)。

1.2.3 熱水浸種和外源激素浸泡共同處理 先將已消毒的種子用60 ℃熱水浸種處理10 min，然后分別加入50 mL配制好的400 mg/L GA3溶液、100 mg/L IBA溶液和100 mg/L 6-BA溶液，在恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫浸泡24 h，每種處理3次重復。處理完成后過濾取出種子，分散放入鋪有2層滅菌濕潤濾紙的90 mm培養(yǎng)皿中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每天觀察種子的發(fā)芽情況，并及時補充無菌水保持濾紙濕潤，以肉眼明顯可見種子胚根突破種皮至少1 mm為發(fā)芽標準，每2 d記錄1次所有處理的發(fā)芽數(shù)量，由于姜荷花種子正常播種發(fā)芽緩慢，持續(xù)發(fā)芽時間可長達3個月以上，因此在播種60 d停止試驗，并以播種60 d內(nèi)的發(fā)芽總數(shù)計算發(fā)芽率，播種40 d種子發(fā)芽數(shù)量達到高峰時的發(fā)芽率作為發(fā)芽勢，計算發(fā)芽率和發(fā)芽勢：

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析，并利用Duncan法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素處理對姜荷花種子打破休眠的影響

姜荷花清水對照種子在播種60 d內(nèi)發(fā)芽率和發(fā)芽勢均為0，而利用外源激素處理則能有效打破姜荷花的休眠。GA3濃度為400 mg/L時處理效果最佳，播種26 d種子開始萌發(fā)，播種60 d發(fā)芽率為50.7%，發(fā)芽勢為29.3%；IBA濃度為400 mg/L時處理效果最佳，播種28 d種子開始萌發(fā)，播種60 d發(fā)芽率為18.3%，發(fā)芽勢為6.6%；6-BA濃度為50 mg/L時處理效果最佳，播種26 d種子開始萌發(fā)，播種60 d發(fā)芽率為18%，發(fā)芽勢為11.3%（表1）。對比3種不同激素處理的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)GA3浸種后的種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率均高于其他處理，說明GA3是最有效打破姜荷花種子休眠的外源激素。

2.1.1 GA3浸種處理對姜荷花種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響 GA3浸種處理姜荷花雜交種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率均高于對照，起始萌發(fā)時間提前1個多月（圖1）。在不同濃度梯度GA3處理試驗中，發(fā)芽率和發(fā)芽勢均隨著GA3處理濃度先上升后下降。最低濃度（50 mg/L）的GA3處理，種子播種28 d開始萌發(fā)，播種60 d最大發(fā)芽率為26.7%，整個萌發(fā)階段增長速度緩慢，沒有明顯的高峰期。最高濃度（1 000 mg/L）的GA3處理，種子在播種26 d萌發(fā)，播種60 d最大發(fā)芽率為39.3%，萌發(fā)前期增長速度快，后期增長速度放緩。當GA3處理濃度為400 mg/L時，發(fā)芽勢和發(fā)芽率達到最大值，分別為29.3%和50.7%，且與其他處理差異顯著，發(fā)芽率始終保持快速增長態(tài)勢。

2.1.2 IBA浸種處理對姜荷花種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響 IBA浸種處理24 h姜荷花種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率均高于對照，但其發(fā)芽勢和發(fā)芽率整體低于GA3和6-BA浸種處理，起始萌發(fā)時間也晚于其他激素處理（圖2）。在不同濃度梯度的IBA處理試驗中，發(fā)芽勢之間差異不顯著，而發(fā)芽率隨著IBA濃度的增加，呈現(xiàn)兩頭高中間低的現(xiàn)象，其中50、400 mg/L的IBA處理效果最好，與其他IBA濃度處理差異顯著。對4種濃度的IBA處理結(jié)果進行動態(tài)觀測發(fā)現(xiàn)，浸種24 h處理雖然可以誘導部分姜荷種子發(fā)芽，但是并沒有出現(xiàn)明顯的發(fā)芽高峰，發(fā)芽率始終保持緩慢增長態(tài)勢，播種60 d發(fā)芽率最高僅為18.3%。

表1 不同濃度外源激素浸種處理對姜荷花種子發(fā)芽的影響Table 1 Effects of seed soaking with exogenous hormones at different concentrations on the germination of Curcuma alismatifolia seeds

圖1 不同濃度GA3浸種處理24 h對姜荷花種子發(fā)芽率的動態(tài)影響Fig. 1 Dynamic effects of different concentrations of GA3 seed soaking treatment for 24 h on the germination rate of Curcuma alismatifolia seeds

2.1.3 6-BA浸種處理對姜荷花種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響 6-BA浸種處理24 h姜荷花種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率均高于對照，但其發(fā)芽勢和發(fā)芽率整體低于GA3浸種處理，稍高于IBA浸種處理，起始萌發(fā)時間與GA3浸種處理相近（圖3）。在不同濃度梯度的6-BA處理試驗中，10 mg/L的6-BA處理發(fā)芽勢最低，與其他高濃度6-BA處理差異顯著。在發(fā)芽率方面，隨著6-BA濃度增加，發(fā)芽率呈現(xiàn)下降趨勢，各處理間發(fā)芽率差異不顯著。從發(fā)芽率動態(tài)變化可以看出，6-BA浸種24 h處理雖然可以誘導部分姜荷花種子發(fā)芽，但沒有出現(xiàn)特別明顯的發(fā)芽高峰，播種60 d內(nèi)發(fā)芽率最高僅為19.7%。

圖2 不同濃度IBA浸種處理24 h對姜荷花種子發(fā)芽率的動態(tài)影響Fig. 2 Dynamic effects of different concentrations of IBA seed soaking treatment for 24 h on the germination rate of Curcuma alismatifolia seeds

2.2 熱水浸種處理對姜荷花種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響

圖3 不同濃度6-BA浸種處理24 h對姜荷花種子發(fā)芽率的動態(tài)影響Fig. 3 Dynamic effects of different concentrations of 6-BA seed soaking treatment for 24 h on the germination rate of Curcuma alismatifolia seeds

熱水浸種處理姜荷花種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率均優(yōu)于對照，有一定的打破休眠效果（表2）。但熱水浸種的發(fā)芽勢普遍較弱，催芽效果不如激素浸種處理，起始發(fā)芽時間比激素處理晚4～8 d。通過不同溫度的熱水和浸種時間對比試驗發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，平均發(fā)芽勢和發(fā)芽率逐漸上升，在80 ℃熱水浸種處理中，浸種時間10 min和15 min出現(xiàn)種子全部死亡的情況。80 ℃熱水浸種5 min處理發(fā)芽勢和發(fā)芽率最高，達到10.3%和17%，但從圖4可以看出，在發(fā)芽高峰后發(fā)芽率增長幾乎停滯，種子已經(jīng)死亡。60 ℃熱水浸種處理整體優(yōu)于45 ℃熱水浸種處理，效果更加穩(wěn)定，沒有出現(xiàn)大批種子死亡的現(xiàn)象，其中60 ℃熱水浸種處理10 min效果最好，發(fā)芽勢和發(fā)芽率分別達到6%和16.7%?？梢?，80 ℃熱水浸種雖然在熱水浸種處理中效果較好，但過高的浸種水溫會導致部分種子死亡，降低后期發(fā)芽率。60 ℃熱水浸種有一定的促進發(fā)芽作用，對種子損傷也不大，適宜搭配激素共同對姜荷花種子進行處理，打破種子休眠并提高萌發(fā)率。

表2 不同溫度熱水浸種處理對姜荷花種子發(fā)芽的影響Table 2 Effects of hot water seed soaking treatments at different temperatures on the germination of Curcuma alismatifolia seeds

圖4 不同溫度熱水浸種處理對姜荷花種子發(fā)芽率的動態(tài)影響Fig. 4 Dynamic effects of hot water soaking treatments at different temperatures on the germination rate of Curcuma alismatifolia seeds

2.3 熱水浸種和外源激素組合處理對姜荷花種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響

從表3可以看出，熱水浸種和3種激素組合處理均能顯著提高姜荷花種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率。其中60℃熱水+ GA3400 mg/L組合處理效果最好，發(fā)芽勢和發(fā)芽率分別達到40.7%和64.3%，與單獨使用GA3400 mg/L處理相比，分別提高11.4%和13.6%，差異達到極顯著水平。其他兩種激素與60℃熱水組合處理中，60℃熱水+ 6-BA 100 mg/L組合處理發(fā)芽勢和發(fā)芽率分別提高5.7%和18.3%，差異達到極顯著水平；60℃熱水+ IBA 100 mg/L組合處理發(fā)芽勢和發(fā)芽率分別提高4.7%和4.3%，差異達到顯著水平。

表3 熱水浸種和激素浸泡共同處理對姜荷花種子發(fā)芽勢的影響Table 3 Effect of hot water soaking and hormone soaking on the germination energy of Curcuma alismatifolia seeds

3 討論

休眠是植物在某個時期生長和代謝暫時停頓的現(xiàn)象，可避免以生命活動旺盛、易受逆境傷害的狀態(tài)度過寒冷、干旱等嚴酷時期[14]。植物休眠是一種復雜的生理過程，受體內(nèi)和外界多種因素決定，被認為是植物生理學最難攻克的難題之一。在農(nóng)作物中，休眠有著非常重要的作用，如水稻和玉米，種子成熟后如果不進行休眠，則會造成大量的經(jīng)濟損失[15]。但過度休眠也存在諸多弊端，休眠導致種子發(fā)芽時間長、不整齊，對后續(xù)的育種工作和生產(chǎn)加工都有很大的影響。對于園林花卉來說，種子休眠期過長會制約生產(chǎn)育種，同時增加額外的儲藏成本。在栽培育種上常常利用溫度或激素處理的技術手段，對種子進行打破休眠，以實現(xiàn)促進發(fā)芽和提早開花的目的[16]。

引起種子休眠除了外界不良環(huán)境條件外，還與種子自身因素有關，即種子的原發(fā)性休眠。種子的原發(fā)性休眠大致可以分為3類，即外源休眠、內(nèi)源休眠和綜合休眠[17]。姜荷花種子的種皮外層被蠟質(zhì)，透水透氣性差，在自然播種條件下，發(fā)芽出苗持續(xù)時間長，且極不整齊，符合硬實種子的特征。研究表明，熱水浸種處理可以去除種皮外層蠟質(zhì)油脂，增強種皮透性，促進種子萌發(fā)[18-19]，解除外部休眠。本試驗中利用適當溫度的熱水（60 ℃）浸種可以打破姜荷花種子的休眠，60 ℃熱水浸種處理的姜荷花種子在60 d內(nèi)的發(fā)芽率保持在10%～20%。高溫度熱水（80 ℃）短時間浸種雖然發(fā)芽勢更強，但同時也出現(xiàn)了部分種子死亡的現(xiàn)象，過高的浸種溫度和延長熱水浸種時間均增加種子死亡數(shù)量，這與候文煥等[20]在菜用黃麻種子的熱水浸種研究結(jié)果相似。由此推測，高溫長時間浸種處理雖然軟化了種皮，但同時也破壞了姜荷花種子內(nèi)部的酶活性，導致種子喪失部分生物學功能，在后期不能正常萌發(fā)。因此，利用熱水處理可以一定程度上打破姜荷花種子的休眠，提前發(fā)芽期，但要控制好溫度和處理時間。

種子內(nèi)源休眠的由種子內(nèi)部自身因素導致，如種皮或者胚乳含有ABA等抑制發(fā)芽的物質(zhì)，胚尚未發(fā)育成熟等[21]。在實際應用中，多種外源激素浸種處理均有打破種子內(nèi)部休眠的作用，常見報道的有GA3、6-BA、IBA、IAA等[22-23]。GA3是最常用于植物種子打破休眠的激素，可以刺激胚芽的營養(yǎng)生長，增加自由生長素的含量，提高細胞膜通透性，促進種子內(nèi)部貯藏物質(zhì)的降解，還可以調(diào)節(jié)種子內(nèi)部其他激素之間的平衡，實現(xiàn)種子提前萌芽的目標。但對于不同的植物材料，GA3處理的效果可能不太一樣，適宜的濃度也有很大差別。韋妍等[24]在研究赤霉素浸種對刺蒺藜種子萌發(fā)特性中發(fā)現(xiàn)，濃度為300 mg/L時能顯著提升發(fā)芽率和活力指數(shù)，濃度為400 mg/L時可以顯著提高發(fā)芽勢，濃度在200～400 mg/L時能增加刺蒺藜幼苗根重量、莖長度和莖重量。在茄子種子萌發(fā)試驗中，利用不同濃度GA3處理紅茄、水茄和刺天茄的種子，發(fā)現(xiàn)1 000 mg/L GA3處理水茄和刺天茄的發(fā)芽率最高，而600 mg/L GA3處理紅茄發(fā)芽率達到最大值[25]。IAA是通過影響植物細胞的分裂、伸長和分化，以此來促進種子的提前發(fā)芽，而IBA可誘導根原體的形成，促進細胞分化和分裂，有利于新根生成和維管束系統(tǒng)的分化。林華忠[26]同時利用多種外源激素處理紅花槐和刺槐，發(fā)現(xiàn)一定濃度的激素處理可以起到促進種子萌發(fā)的作用，當6-BA和IBA處理濃度為10～50 mg/L時，種子萌發(fā)率和發(fā)芽勢隨著濃度的升高逐漸上升。本試驗結(jié)果表明，一定濃度的激素浸種處理24 h對打破姜荷花種子休眠有顯著效果，其中效果最好的外源激素是GA3，最佳浸種濃度為400 mg/L，播種60 d內(nèi)發(fā)芽率達到50.7%，發(fā)芽勢達到29.3%，發(fā)芽率曲線上出現(xiàn)明顯的發(fā)芽高峰期。催芽效果其次是6-BA和IBA，播種60 d內(nèi)發(fā)芽率保持在10%～20%，發(fā)芽率曲線上未出現(xiàn)明顯的發(fā)芽高峰期，發(fā)芽勢較弱。由此可以推斷，GA3是最適宜用于打破姜荷花種子休眠的外源激素，可直接用于生產(chǎn)實踐中的品種選育。

熱水浸種處理和外源激素浸種處理均能不同程度的打破姜荷花種子休眠，說明姜荷花種子兼具外部休眠和內(nèi)部休眠的特性，屬于綜合休眠類型。在熱水浸種處理和外源激素浸種組合處理試驗中比較發(fā)現(xiàn)，熱水浸種處理催芽效果與外源激素浸種處理催芽效果可以疊加，發(fā)芽率和發(fā)芽勢優(yōu)于單獨使用熱水和外源激素浸種處理。其中60℃熱水浸種10 min+400 mg/L GA3浸種24 h是本試驗得到的最佳處理組合，播種60 d內(nèi)發(fā)芽率達到64.3%，發(fā)芽勢達到40.7%。雖然這種組合處理提高了姜荷花種子發(fā)芽率，但與霧靈香花芥（95%）[13]、菜用黃麻（87.3%）[20]等植物比起來，發(fā)芽率仍然偏低。因此，后續(xù)研究考慮使用其他物理和化學的處理方法，結(jié)合已有的研究結(jié)果，進一步尋求更加高效的處理組合。

4 結(jié)論

為了解除姜荷花種子的休眠，提高發(fā)芽勢和發(fā)芽率，使用熱水和外源激素共同浸種處理效果最好。但是，熱水溫度及外源激素濃度過高有可能抑制或者殺死種子，降低發(fā)芽率。結(jié)果表明，熱水浸種溫度越高催芽效果越明顯，使用60℃熱水浸種為宜，浸種時間不超過15 min，當水溫達到80℃時，部分種子出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；外源激素浸種處理中GA3的催芽效果最明顯，最佳處理濃度為400 mg/L；兩種浸種方法組合使用，播種60 d發(fā)芽率達到64.3%，發(fā)芽勢達到40.7%，與對照相比發(fā)芽勢和發(fā)芽率均顯著提高。經(jīng)處理后的姜荷花種子萌發(fā)提前、發(fā)芽率高，幼苗出苗整齊，生長健壯，無任何異常。本研究比較了不同處理方法對姜荷花種子解除休眠的影響，縮短了姜荷花新品種選育周期，適合育種實踐中推廣應用。