王丹丹，劉華棟，宋 林

(1.遼東學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，遼寧丹東 118003; 2.渭南市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，陜西渭南 714000)

紅花(Carthamustinctorius)為隸屬于桔梗目(Campanulales)菊科(Asteraceae)紅花屬(CarthamusL.)的1a生草本植物，別名紅藍(lán)花、刺紅花，喜溫暖、干燥氣候，抗寒性強(qiáng)，耐貧瘠。其干燥花富含羥基紅花紅色素A等黃酮類化合物，具有活血通經(jīng)，散瘀止痛，散濕去腫的功效，是一種藥油兼用的重要經(jīng)濟(jì)作物，在中國新疆、云南、四川及河南等地廣泛種植[1]。

花青素(Anthocyan)，又稱為花色素，是一種天然的水溶性色素，多存在于植物的花瓣、果實(shí)和葉片中，也是植物中的主要呈色物質(zhì)。目前已知的花青素有20種，植物中常見的有6種，分別為芍藥色素(Pn)、天竺葵色素(Pg)、飛燕草色素(Dp)、矢車菊色素(Cy)、牽?；ㄉ?Pt)和錦葵色素(Mv)?；ㄇ嗨卮嬖谟谥参锛?xì)胞的液泡中，根據(jù)液泡中溶液pH的不同，花青素的顏色也有所不同，如在酸性溶液中呈紅色，在堿性溶液中呈藍(lán)色，而在中性溶液中呈紫色，并且其顏色的深淺與花青素的含量呈正比關(guān)系[2-3]。自然界中游離的花青素極少見，通常一個(gè)花色基元與一個(gè)或多個(gè)單糖結(jié)合形成糖苷，以糖苷形式存在，又稱為花色苷(Anthocyanin)。植物花青素的合成屬于類黃酮合成途徑的一個(gè)分支，在植物細(xì)胞質(zhì)中，苯丙氨酸作為合成途徑的直接前體，經(jīng)過一系列的酶促反應(yīng)最終轉(zhuǎn)化成各種花青素。MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物轉(zhuǎn)錄因子家族中最大的家族成員之一，廣泛存在于植物中，參與植物的初生和次生代謝反應(yīng)、植物細(xì)胞形態(tài)和模式建成等多個(gè)生長發(fā)育過程，對植物生長具有重要的調(diào)節(jié)作用。絕大多數(shù)MYB轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)高度保守，根據(jù)其DNA的結(jié)合區(qū)重復(fù)次數(shù)的不同，又分為1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB、4R-MYB4個(gè)家族。其中R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子對植物花青素的次生代謝調(diào)控有著重要的作用，在玉米、擬南芥、矮牽牛等植物中均得到深入研究[4-9]。ZmC1是植物中克隆的第1個(gè)R2R3-MYB基因，也是第1個(gè)被克隆的花青素合成調(diào)控因子，該轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控玉米糊粉層花青素的生物合成[10]。在擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，PAP1/AtMYB75、PAP2/AtMYB90的過量表達(dá)能夠誘導(dǎo)花青素的大量積累，同時(shí)擬南芥的AtMYB11/PFG2、AtMYB12/PFG1、AtMYB111/PFG3能夠參與調(diào)控類黃酮合成途徑的上游生物合成基因群(early biosynthetic genes，EBGs)，激活CHS、CHI、F3H和FLS1的表達(dá)。葡萄VvMYBA1、VvMYBA2可以通過激活UFGT基因的啟動子，進(jìn)而提高花青素的合成積累，從草莓中分離出來的FaMYB1對煙草的過表達(dá)試驗(yàn)顯示，F(xiàn)aMYB1可以直接抑制類黃酮生物合成途徑下游基因(ANS)的表達(dá)，減少花青素的積累[11-16]。隨著植物花青素代謝途徑的深入研究，越來越多關(guān)于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物花青素代謝的機(jī)制被發(fā)現(xiàn)，如蘋果MdMYB10能夠協(xié)同蘋果MdbHLH3(bHLH類轉(zhuǎn)錄因子)，提高M(jìn)dDFR基因的表達(dá)，在果實(shí)成熟的過程中誘導(dǎo)蘋果果皮生成紅色花青素。在擬南芥中，類黃酮代謝途徑還可以通過MYB、bHLH、WD40轉(zhuǎn)錄因子相互作用，形成一個(gè)三聯(lián)復(fù)合體(MYB-bHLH-WD40)進(jìn)行調(diào)控[17-18]。

迄今，對紅花CtMYB-TF1基因的研究鮮有報(bào)道，基于學(xué)者們的研究成果，本試驗(yàn)以紅花花瓣為試驗(yàn)材料，提取紅花總RNA，通過搜索紅花基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫相關(guān)EST序列片段，結(jié)合擬南芥模式植物的MYB轉(zhuǎn)錄因子家族數(shù)據(jù)庫進(jìn)行反復(fù)篩選，利用NCBI上的Blast功能在線設(shè)計(jì)特異性克隆引物，以RACE和RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增獲取CtMYB-TF1基因序列全長，采用在線生物信息學(xué)軟件預(yù)測CtMYB-TF1基因序列的氨基酸結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)的理化特性，同時(shí)構(gòu)建氨基酸序列同源性系統(tǒng)進(jìn)化樹，并分析紅花MYB-TF1基因在紅花花青素等類黃酮代謝物合成調(diào)控中的作用，為進(jìn)一步研究紅花MYB-TF1基因過表達(dá)對提高紅花花青素的含量問題奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用紅花品種為AC-1無刺紅，種子采購于安國中藥材推廣站，2019年3月21日種植于遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院，經(jīng)分子鑒定，確定為紅花(Carthamustinctorius)。于2019年7月20日選取長勢良好、花色穩(wěn)定的植株，采集開花盛期的花瓣作為試驗(yàn)材料，置于-80度凍存，待用[19]。

1.2 總RNA提取

稱取50 g紅花花期1 d、3 d、5 d和7 d花瓣組織研磨成均勻粉末，置于1.5 mL離心管中，按照RNA提取試劑盒(Total RNA Extractor Trizol)說明書提取紅花總RNA，并檢測紅花總RNA的完整性[20-21]。按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟，以提取的高質(zhì)量紅花總RNA為模板，引物為CtMYB-R1(表1)，按照一步法 RT-PCR擴(kuò)增試劑盒(M-MuLV One-step RT-PCR Kit)說明書生成cDNA第1鏈，-20 ℃保存，作為紅花CtMYB-TF1基因核心序列克隆的模板。

1.3 CtMYB-TF1基因核心序列的克隆

以擬南芥(Arabidopsisthaliana)的AtMYB-TF1基因序列(GenBank登錄號為CB074560.1)設(shè)計(jì)引物(表1)。模板為紅花CtMYB-TF1基因新合成的第1鏈cDNA，引物為MYB-coreF/MYB-coreR，克隆紅花CtMYB-TF1基因的核心序列。反應(yīng)體系20 μL，即0.8 μL cDNA，0.5 μL dNTP Mix，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，0.8 μL Advantage○R2 聚合酶混合液 (50×)，2 μL Advantage○R2 PCR 緩沖液 (10×)，滅菌ddH2O 加至20 μL；PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸6 min。將PCR擴(kuò)增的目的片段克隆到pUCm-T載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受體細(xì)胞TOP10[22]。選擇陽性轉(zhuǎn)化子送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 引物信息

1.4 紅花 CtMYB-TF1基因RACE擴(kuò)增

根據(jù)CtMYB-TF1核心片段設(shè)計(jì)CtMYB1-F1/ CtMYB1-F2特異性正向引物，分別與CtMYB1-R2反向引物組合進(jìn)行2次巢式PCR，快速擴(kuò)增紅花CtMYB-TF1基因3′端序列[23-24]。擴(kuò)增條件中退火溫度：第1輪巢式PCR，65 ℃ 45 s；第2輪巢式PCR，60 ℃ 45 s；延伸時(shí)間：第1輪巢式PCR，72 ℃ 3 min；第2輪巢式PCR， 72 ℃ 5 min，其余反應(yīng)條件均同“1.3”。根據(jù)CtMYB-TF1基因核心片段設(shè)計(jì)CtMYB2-R1、CtMYB2-R2和 CtMYB-R3特異性反向引物，分別與SMARTer RACE 快速擴(kuò)增試劑盒中UPM引物組合進(jìn)行3次巢式PCR，快速擴(kuò)增紅花CtMYB-TF1基因 5′端序列。步驟同“1.3”。

1.5 紅花 CtMYB-TF1基因全長驗(yàn)證

為獲得紅花CtMYB-TF1基因全長cDNA片段，采用在線軟件DNAStar拼接紅花CtMYB-TF1基因的5′-末端片段、核心序列與3′-末端片段。以紅花CtMYB-TF1基因全長cDNA為模板，以包含該基因開放閱讀框(ORF)的CtMYB-F/CtMYB-R為引物，擴(kuò)增紅花CtMYB-TF1基因。

1.6 生物信息學(xué)分析

通過軟件DNAMAN將CtMYB-TF1基因翻譯成氨基酸序列；在線軟件ORF Finder 查找CtMYB-TF1基因全長cDNA序列最大開放閱讀框(ORF)，ExPASy-ProtParam tool(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)分析紅花CtMYB-TF1蛋白質(zhì)的氨基酸序列與理化特性；采用SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/)分析紅花CtMYB-TF1蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，并在NCBI數(shù)據(jù)庫采用在線Blast檢索紅花CtMYB-TF1蛋白質(zhì)的同源蛋白，DNAMAN 5.0進(jìn)行同源蛋白的氨基酸序列比對，并采用MEGA 7.0構(gòu)建紅花CtMYB-TF1蛋白質(zhì)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(鄰接法)[25]。

1.7 CtMYB-TF1基因和CtANS基因表達(dá)分析

檢測紅花CtMYB-TF1和紅花花青素合成酶基因(CtANS)在不同花期中的表達(dá)情況，以18S為內(nèi)參基因，采用Primer Premier 6軟件設(shè)計(jì)引物18SF/18SR、CtMYB-qF/ CtMYB-qR和CtANS-qF/ CtANS-qR(表1)。建立10 μL熒光定量RT-qPCR反應(yīng)體系：cDNA模板 1 μL，10 μmol ·L-1上下游引物各 0.5 μL，SYBR Green PCR Master mix 5 μL， ddH2O 3 μL；避光條件下將反應(yīng)液分別加入96孔板，添加后彈去氣泡，微孔板離心機(jī)離心2 min。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，52 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)；采用2-△△Ct法對紅花CtMYB-TF1和CtANS基因進(jìn)行相對定量表達(dá)分析，每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅花轉(zhuǎn)錄因子 CtMYB-TF1基因cDNA全長克隆

采用簡并引物CtMYB-coreF/ CtMYB-coreR進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增紅花CtMYB-TF1基因核心序列，克隆得到約900 bp 的DNA片段(圖1-A)，采用NCBI數(shù)據(jù)庫中Blastx在線軟件將紅花CtMYB-TF1基因核心片段編碼的氨基酸與多種植物的MYBs基因編碼的氨基酸進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)均具有85%～98%的相似性，驗(yàn)證克隆得到的cDNA片段為紅花CtMYB-TF1基因的核心序列?；诩t花CtMYB-TF1基因核心序列設(shè)計(jì)引物，分別進(jìn)行5′-RACE與3′-RACE 末端快速擴(kuò)增，分別得到約為1 300 bp 和1 000 bp的明亮條帶(圖1-B，1-C)，5′-RACE、核心序列與 3′-RACE采用DNAStar的SeqMan程序進(jìn)行3段序列的拼接，獲得紅花CtMYB-TF1基因cDNA全長為1 260 bp 。采用ORF Finder分析紅花CtMYB-TF1基因的cDNA片段為750 bp，采用包含CtMYB-TF1基因的開放閱讀框(ORF)的引物CtMYB-F/CtMYB-R進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，得到與預(yù)測大小一致的約750 bp 明亮目的片段(圖1-D)。驗(yàn)證該片段包含完整的紅花CtMYB-TF1基因的ORF，表明試驗(yàn)成功克隆得到紅花CtMYB-TF1基因的全長cDNA序列，即CtMYB-TF1基因。

2.2 紅花CtMYB-TF1蛋白質(zhì)理化特性分析

CtMYB-TF1基因全長1 260 bp，cDNA為750 bp，編碼249個(gè)氨基酸(圖2)；5′非翻譯區(qū)(5′ untranslated region,5′-UTR)長306 bp， 3′非翻譯區(qū)(3′untranslated region,3′-UTR)長204 bp。ProtParam預(yù)測CtMYB-TF1蛋白質(zhì)分子式為C1220H1930N358O378S13，分子質(zhì)量為28.08 ku，理論等電點(diǎn)(pI)7.14，偏堿性；其編碼蛋白的氨基酸組成中賴氨酸(Lys)和絲氨酸(Ser)的含量最高，各占9.2%，酪氨酸(Tyr)的含量最低，占0.8%；帶正電荷的強(qiáng)堿性氨基酸殘基(Arg+Lys)與帶負(fù)電荷的強(qiáng)酸性氨基酸殘基(Asp+Glu)均為37，說明該編碼蛋白呈電中性；不穩(wěn)定系數(shù)為52.04(52.04>40)，說明該編碼蛋白質(zhì)不穩(wěn)定；脂肪指數(shù)為68.51，說明該編碼蛋白屬于一種中溫型的生物蛋白；根據(jù)生物信息學(xué)軟件expasy的protscale在線分析工具對紅花CtMYB-TF1基因編碼蛋白進(jìn)行親疏水性分析，結(jié)果顯示，MIN：-2.721(Val/133)，MAX：0.532(Ser/87)。正值越大表示疏水性越強(qiáng)，負(fù)值越小表示親水性越強(qiáng)，該編碼蛋白序列僅在84～90區(qū)域具有明顯疏水性，其余區(qū)域均為親水性，并且在113～142區(qū)域有最強(qiáng)親水性，因此預(yù)測該編碼蛋白為親水性蛋白(圖3)。將紅花CtMYB-TF1基因編碼蛋白的氨基酸序列上傳到生物信息學(xué)軟件SOPMA進(jìn)行二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，可見紅花CtMYB-TF1基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)主要是由一些α-螺旋、轉(zhuǎn)角和大量的無規(guī)則卷曲構(gòu)成，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相一致(圖4，圖5)。

為了更好地判斷紅花CtMYB-TF1與這些已知的類黃酮生物合成調(diào)節(jié)相關(guān)的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子之間的關(guān)系，在多序列比較的基礎(chǔ)上進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用MEGA-X軟件對這些序列以鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹，Bootstrap參數(shù)設(shè)置為1 000。結(jié)果顯示，這12個(gè)不同的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)其在類黃酮生物合成途徑中的不同功能分為3大類，即黃酮醇(Flavonol)、花青素/原花青素(Anthocyanin/proanthocyanidin)和花青素(Anthocyanin)。其中，紅花CtMYB-TF1基因與調(diào)控花青素/原花青素的葡萄VvMYBPA1和親緣關(guān)系較近(圖6)。

2.3 紅花 CtMYB-TF1基因的功能預(yù)測

通過生物信息學(xué)在線軟件MEME掃描發(fā)現(xiàn)，紅花CtMYB-TF1基因編碼蛋白的氨基酸序列N末端存在1個(gè)SG5功能域的基序(DExWLRxxT)(圖7)，推測紅花CtMYB-TF1屬于S5亞族，該亞族成員包括擬南芥AtMYB123和玉米ZmC1。

2.4 CtMYB-TF1基因和CtANS基因表達(dá)分析

采用qPCR技術(shù)分析紅花CtMYB-TF1基因和花青素合成酶基因CtANS分別對紅花花期 1 d、3 d、5 d和7 d花瓣中蛋白質(zhì)表達(dá)量的調(diào)控，并分析紅花CtMYB-TF1基因的表達(dá)對其CtANS基因表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示，18S RNA、CtMYB-TF1和CtANS基因3種基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物特異性較強(qiáng)，并無熒光信號污染，如引物二聚體和非特異性產(chǎn)物等，對熒光定量qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，發(fā)現(xiàn)各基因的擴(kuò)增曲線峰值較為集中且單一，擬南芥18S RNA基因Tm值集中在82.5 ℃，紅花CtMYB-TF1基因Tm值集中在81.5 ℃，紅花CtANS基因Tm值集中在84.1 ℃。結(jié)果顯示，以18S RNA的蛋白質(zhì)相對表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)，紅花CtMYB-TF1基因在花期的各個(gè)時(shí)期相對表達(dá)量均高于紅花CtANS基因，并且隨著花期時(shí)間的延長紅花CtMYB-TF1基因和CtANS基因的相對表達(dá)量也有增高，其中在花期的第5天紅花CtMYB-TF1基因的相對表達(dá)量出現(xiàn)峰值(圖8)。試驗(yàn)進(jìn)行了3組生物學(xué)重復(fù)。

3 討 論

探究花青素合成途徑的調(diào)控一直以來都是研究的熱點(diǎn)，目前，關(guān)于紅花調(diào)控花青素的轉(zhuǎn)錄因子研究鮮有報(bào)道。因此，對紅花CtMYB-TF1調(diào)控花青素含量的研究具有重要的理論和實(shí)際意義。紅花調(diào)控花青素代謝CtMYB-TF1基因的克隆與序列分析，為進(jìn)一步研究該基因在紅花體內(nèi)過表達(dá)時(shí)對花青素含量的影響奠定基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)以紅花花瓣為研究對象，提取總RNA，通過NCBI在線設(shè)計(jì)特異性引物，以RT-PCR技術(shù)成功克隆一段MYB基因序列，將其命名為紅花CtMYB-TF1。該基因編碼序列長750 bp，共編碼249個(gè)氨基酸，其蛋白質(zhì)分子式為C1220H1930N358O378S13，分子質(zhì)量為28.08 ku，是一種不穩(wěn)定的堿性親水蛋白；利用熒光定量qPCR技術(shù)對紅花CtMYB-TF1基因和CtANS基因進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)量分析，可見紅花CtMYB-TF1基因在花期的各個(gè)時(shí)段相對表達(dá)量均高于紅花CtANS基因，并且隨著花期時(shí)間的延長紅花CtMYB-TF1基因和CtANS基因的相對表達(dá)量也有增高，其中在花期的第5天紅花CtMYB-TF1基因的相對表達(dá)量出現(xiàn)峰值。CtMYB-TF1轉(zhuǎn)錄因子使紅花花青素CtANS基因的表達(dá)呈明顯上升狀態(tài)，為采用分子生物學(xué)及基因工程手段構(gòu)建高產(chǎn)的紅花花青素細(xì)胞系提供了實(shí)踐依據(jù)。

從鄰接法構(gòu)建的進(jìn)化樹來看，紅花CtMYB-TF1與葡萄VvMYBPA1親緣關(guān)系較近，同時(shí)在MEME掃描中發(fā)現(xiàn)紅花CtMYB-TF1基因編碼蛋白的氨基酸序列C末端存在擬南芥S5亞族的功能基序，說明紅花CtMYB-TF1屬于S5亞族，并且有可能參與花青素/原花青素的調(diào)控。此外，已知擬南芥AtMYB123能夠與TT8進(jìn)行協(xié)同作用，增強(qiáng)AtDFR基因的表達(dá)[26-27]，因此進(jìn)一步推測紅花CtMYB-TF1可能通過由PKC介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)行使其調(diào)控花青素合成的生物學(xué)功能，該基因也能夠與bHLH轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生協(xié)同作用參與調(diào)控DFR基因的表達(dá)，進(jìn)而影響到花青素的合成途徑，提高花青素的含量。這一推測在同為桔梗目菊科植物的菊花(ChrysanthemummorifoliumRamat.)當(dāng)中得到驗(yàn)證，LIU等[27]從菊花中分離出的CmMYB6與CmbHLH2的協(xié)同效應(yīng)有效地增強(qiáng)了CmDFR的表達(dá)，提高花青素的含量。當(dāng)然植物MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過程，關(guān)于紅花CtMYB-TF1轉(zhuǎn)錄因子在紅花內(nèi)的功能及調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步試驗(yàn)證明，分析紅花CtMYB-TF1轉(zhuǎn)錄因子的不同表達(dá)模式下花青素等代謝產(chǎn)物含量之間的關(guān)系，如此才能進(jìn)一步對紅花CtMYB-TF1轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行更準(zhǔn)確的定義。