查曉敏，朱復(fù)希，張靜靜，徐元宏

據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）調(diào)查報(bào)告顯示，不孕不育患者在育齡夫婦中占比約15%，其中男性因素占50%［1］。男性不育主要通過(guò)檢測(cè)精子濃度、活動(dòng)力等參數(shù)判斷精液質(zhì)量高低。由于精子的濃度和活動(dòng)力容易受各種因素影響，同時(shí)臨床中發(fā)現(xiàn)精液常規(guī)檢查結(jié)果相仿的患者也存在明顯不同的受精率和妊娠結(jié)局，說(shuō)明精液常規(guī)檢查結(jié)果用于男性不育及生育結(jié)局評(píng)估還不夠全面。此外，有研究指出無(wú)論男性不育癥患者精液常規(guī)檢查結(jié)果是否正常，都可能存在精子DNA異常［2］，因此急需尋找一種新的預(yù)測(cè)指標(biāo)。精子DNA碎片指數(shù)（DFI）是一項(xiàng)獨(dú)立于精液常規(guī)檢查之外，從分子水平反映精子DNA損傷，評(píng)估男性生育力，并在一定程度上可預(yù)測(cè)輔助生殖技術(shù)（ART）臨床結(jié)局的參數(shù)，近年來(lái)受到廣泛關(guān)注［3］。與精液常規(guī)相比，精子DFI變異小、檢查快速、結(jié)果穩(wěn)定，被認(rèn)為是評(píng)價(jià)男性精液質(zhì)量和預(yù)測(cè)男性生育力更有潛力、更加準(zhǔn)確的指標(biāo)。本研究在嚴(yán)格控制女方因素和男性患者精子高畸形率的影響后用精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析（SCSA）法檢測(cè)精子DFI，研究其評(píng)估男性生育力及預(yù)測(cè)體外受精-胚胎移植（IVFET）/卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）結(jié)局的價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選擇2017年9月—2019年4月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心2 420例男性不育患者，年齡19～66歲，平均（32.29±5.94）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）夫妻雙方第1次接受IVF-ET或ICSI治療。（2）精子畸形率≤96%。（3）女方年齡≤40歲，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）≤30 kg/m2，我院門診就診首次檢測(cè)卵泡刺激素（FSH）＜10.00 IU/L，不孕病因僅為輸卵管或卵巢因素且獲卵數(shù)≥5個(gè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）男方存在嚴(yán)重少精子癥（男方精子濃度＜5.00×106/mL）。（2）女方存在雙子宮、單角子宮、縱隔子宮等生殖器畸形，以及存在重度子宮腔粘連、內(nèi)膜過(guò)薄等影響胚胎著床的情況。（3）女方合并有甲狀腺疾病、糖尿病等內(nèi)分泌疾病。在2 420例患者中選擇117對(duì)不孕夫婦，根據(jù)患者情況選擇不同體外受精方式，根據(jù)體外受精方式分組。其中IVF組71對(duì)，男方年齡23～49歲，平均（33.51±6.32）歲，女方年齡23～40歲，平均（30.93±4.38）歲；ICSI組46對(duì)，男方年齡25～50歲，平均（33.50±5.80）歲，女方年齡23～39歲，平均（30.50±3.76）歲。

1.2 研究方法

1.2.1 精液標(biāo)本采集患者禁欲3～7 d后，用無(wú)毒、無(wú)菌容器采集全部精液，并立即置于37℃孵箱內(nèi)，30 min內(nèi)觀察精液是否液化，液化后取出標(biāo)本，用吸管吸取足夠樣本進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 精子DFI檢測(cè)采用美國(guó)BD（Becton，Dickinson and Company）公司流式細(xì)胞儀（accuri C6）精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析（SCSA）法配合流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)試劑盒為精子核完整性染色試劑盒［浙江星博生物科技有限公司，YZB/浙（甬）0159-2-12］。調(diào)整精子濃度為1×106～2×106個(gè)/mL，取100μL用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)精子DNA完整性，分析5 000條以上為有效數(shù)據(jù)，利用吖啶橙染料的異染性質(zhì)，使完整的雙鏈DNA精子核顯示綠色熒光，受損的單鏈DNA精子核顯示紅色熒光。根據(jù)DFI值分為A組（DFI≤15%，精子DNA完整性好）、B組（15%＜DFI＜30%，精子DNA完整性一般）、C組（DFI≥30%，精子DNA完整性差）。IVF組與ICSI組分別根據(jù)精子DFI水平進(jìn)一步各分為3個(gè)亞組，即IVF-1組（DFI≤15%）、IVF-2組（15%＜DFI＜30%）、IVF-3組（DFI≥30%）；ICSI-1組（DFI≤15%）、ICSI-2組（15%＜DFI＜30%）、ICSI-3組（DFI≥30%）。

1.2.3 精液質(zhì)量分析參照第5版《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》采用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)（computer assisted sperm analysis，CASA）分析精液，應(yīng)用西班牙SCA全自動(dòng)精子質(zhì)量分析儀。精液參數(shù)正常范圍：精液量≥1.5 mL，精子濃度≥15×106/mL，前向運(yùn)動(dòng)精子（PR）≥32%，精子活動(dòng)率≥40%。

1.2.4 精子形態(tài)分析精子形態(tài)學(xué)按照第5版《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》推薦方法，采用巴氏染色法，蘇木素-EA50染液染色進(jìn)行精子形態(tài)學(xué)分析，觀察精子畸形率。

1.2.5 IVF-ET和ICSI治療女方按常規(guī)促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（GnRH-α）長(zhǎng)方案進(jìn)行，通過(guò)陰道B超及血清雌二醇（E2）水平監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育，卵泡發(fā)育成熟后肌內(nèi)注射人絨毛膜促性腺激素（HCG），36 h后在B超引導(dǎo)下取卵，采用上游法或密度梯度離心法優(yōu)化處理精液，取卵4～6 h后行IVF或ICSI，授精后16～18 h觀察受精情況。根據(jù)Gardner法對(duì)囊胚進(jìn)行評(píng)級(jí)，將D5評(píng)分≥3BB或D6評(píng)分≥4BB定義為優(yōu)質(zhì)胚胎；選擇1～2個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎冷凍后解凍移植，移植后行黃體支持。移植35 d后B超下見(jiàn)孕囊原始心管搏動(dòng)為臨床妊娠。

1.2.6 IVF/ICSI臨床結(jié)局計(jì)算方法IVF受精率=（受精卵數(shù)/獲卵總數(shù)）×100%；ICSI受精率=（受精卵數(shù)/MⅡ卵數(shù)）×100%；卵裂率=（受精卵裂胚胎數(shù)/受精卵數(shù)）×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=（優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常受精卵裂胚胎數(shù)）×100%；臨床妊娠率=（臨床妊娠周期數(shù)/所有移植周期數(shù)）×100%

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)采用M（P25，P75）表示，組間比較Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，兩兩比較用Nemenyi檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Spearman法，符合正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例或例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組患者臨床資料比較A、B、C組患者年齡、精子DFI、精子畸形率逐次升高，精子濃度、PR、精子活動(dòng)率逐次降低（P＜0.01），3組患者精液量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

Tab.1 Comparison of conventional parameters and deformity rate of sperm between different DFI groups表1 不同精子DFI組精液常規(guī)參數(shù)、畸形率比較

2.2 精子DFI與精液常規(guī)參數(shù)、精子畸形率相關(guān)性分析精子DFI與年齡、精子畸形率呈正相關(guān)（rs分別為0.186、0.302，均P＜0.01），與精子濃度、PR、精子活動(dòng)率呈負(fù)相關(guān)（rs分別為-0.289、-0.618、-0.620，均P＜0.01）。

2.3 各亞組間臨床資料比較見(jiàn)表2。與IVF-1組比較，IVF-3組精子濃度、PR降低；IVF-3組精子畸形率較IVF-2組升高；與ICSI-1組和ICSI-2組比較，ICSI-3組PR降低；ICSI-3組精子畸形率較ICSI-1組升高（P＜0.05）。IVF及ICSI組中各亞組間女方年齡、BMI、FSH、獲卵數(shù)及男方年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

Tab.2 Comparison of basic characteristics,semen parameters and malformation rate between three subgroups表2 各亞組間基本特征、精液參數(shù)、畸形率比較

2.4 各亞組臨床結(jié)局比較在IVF組和ICSI組中，各亞組受精率、優(yōu)胚率、臨床妊娠率及卵裂率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。

Tab.3 Comparison of clinical outcomes between different subgroups表3 各亞組間臨床結(jié)局比較

3 討論

精子DFI是反映精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，評(píng)估男性生育力，并在一定程度上可預(yù)測(cè)ART臨床結(jié)局的參數(shù)。有報(bào)道指出高DFI可對(duì)精液質(zhì)量和ART結(jié)局產(chǎn)生不良影響［4］，但關(guān)于精子DFI與年齡、精液常規(guī)參數(shù)、畸形率的相關(guān)性及對(duì)ART結(jié)局的影響一直有爭(zhēng)議。本研究在嚴(yán)格控制女方因素和男性患者精子高畸形率的影響后用SCSA法檢測(cè)精子DFI，研究精子DFI評(píng)估男性生育力及預(yù)測(cè)IVF-ET/ICSI結(jié)局的價(jià)值。

3.1 精子DFI與年齡、精液常規(guī)、畸形率之間的關(guān)系本研究對(duì)2 420名男性患者精子DFI、年齡、精液常規(guī)、精子形態(tài)學(xué)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示精子DFI與年齡、精子畸形率呈正相關(guān)，與精子濃度、PR、活動(dòng)率呈負(fù)相關(guān)；與A組和B組比較，C組年齡、精子畸形率升高，精子濃度、PR、精子活動(dòng)率降低，與既往研究［5-6］一致。人類成熟精子核由組蛋白（15%）和魚精蛋白（85%）結(jié)合形成復(fù)合體。魚精蛋白是一種小分子堿性蛋白質(zhì)，通過(guò)中和DNA的負(fù)電荷并與二硫鍵交聯(lián)使細(xì)胞核更為致密。在精子核成熟過(guò)程中，精子染色質(zhì)內(nèi)的組蛋白被只有其一半體積的魚精蛋白通過(guò)中間過(guò)渡蛋白形成魚精蛋白-DNA復(fù)合體。魚精蛋白-DNA復(fù)合體形成高度濃縮的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，使精子核極度壓縮，保護(hù)精子抵抗外界氧化或高溫等，有利于精子在生殖道內(nèi)的運(yùn)動(dòng)和受精，使遺傳物質(zhì)準(zhǔn)確進(jìn)入胚胎。畸形精子由于細(xì)胞核內(nèi)魚精蛋白-DNA復(fù)合體減少，不能壓縮精子核，導(dǎo)致精子核內(nèi)存在大量體積較大的組蛋白，精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松，精子DNA易發(fā)生損傷，且畸形精子產(chǎn)生的氧自由基（ROS）也可導(dǎo)致精子DNA損傷，最終使精子DNA碎片增多，精子DFI升高，表明精子DFI與精子畸形率相關(guān)，Yang等［7］研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。而Le等［8］研究結(jié)果顯示精子DFI與精液常規(guī)各參數(shù)、畸形率相關(guān)性較弱，李紅芳等［9］研究亦指出精子DNA碎片率與精液常規(guī)各參數(shù)無(wú)相關(guān)性。對(duì)比分析原因可能與以下因素有關(guān)：（1）精子DFI檢測(cè)方法不同。（2）樣本量、研究方法和男性患者納入標(biāo)準(zhǔn)不同。Le等［8-9］采用染色質(zhì)分散試驗(yàn)（SCD）法，樣本量?。?18例和112例），而本研究采用檢測(cè)精子DNA損傷金標(biāo)準(zhǔn)的SCSA法配合流式細(xì)胞術(shù)，且樣本量較大，更具有代表性。

3.2 精子DFI與IVF/ICSI臨床結(jié)局的關(guān)系本研究結(jié)果顯示IVF組和ICSI組受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、臨床妊娠率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與既往研究［10-11］結(jié)果一致。但Simon等［12］通過(guò)Meta分析表明精子DFI較高會(huì)降低IVF/ICSI臨床妊娠率，原因可能為：（1）精液經(jīng)過(guò)上游法和密度梯度離心優(yōu)化精子處理后精子DFI、畸形率降低，使得高精子DFI對(duì)臨床妊娠結(jié)局的影響減弱。（2）胚胎移植時(shí)優(yōu)先選擇優(yōu)質(zhì)胚胎，這可能也是造成精子DFI與臨床妊娠結(jié)局無(wú)關(guān)的原因。（3）胚胎早期發(fā)育受母源性基因控制，精子DNA損傷被部分修復(fù)后成功妊娠，后期父源性基因激活發(fā)揮作用，精子DFI高患者胚胎可能最終無(wú)法持續(xù)妊娠至3個(gè)月后或者最終生產(chǎn)。Cissen等［13］也認(rèn)為沒(méi)有足夠的證據(jù)推薦在進(jìn)行ART夫婦中常規(guī)使用精子DNA碎片測(cè)試來(lái)預(yù)測(cè)妊娠和選擇治療方案，需要進(jìn)一步研究精子DFI對(duì)3個(gè)月后妊娠率的預(yù)測(cè)價(jià)值，同時(shí)與3個(gè)月后妊娠的其他預(yù)測(cè)因子如女性年齡、男性年齡、精液參數(shù)和卵母細(xì)胞數(shù)量等進(jìn)行比較。Esteves等［14］也提出出生率是評(píng)估精子DNA碎片化試驗(yàn)的終點(diǎn)，并提出在IVF和ICSI組高精子DFI導(dǎo)致低出生率。

綜上所述，精子DFI與年齡、精子濃度、PR、精子活動(dòng)率、畸形率相關(guān)，建議將精子DFI檢測(cè)作為精液分析的常用項(xiàng)目，以完善對(duì)男性生育能力的評(píng)價(jià)，并指導(dǎo)治療。精子DFI對(duì)IVF/ICSI臨床結(jié)局無(wú)預(yù)測(cè)價(jià)值，不建議將精子DFI檢測(cè)作為選擇ART方案時(shí)的檢查項(xiàng)目。