查曉敏，朱復希，張靜靜，徐元宏

據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）調查報告顯示，不孕不育患者在育齡夫婦中占比約15%，其中男性因素占50%［1］。男性不育主要通過檢測精子濃度、活動力等參數(shù)判斷精液質量高低。由于精子的濃度和活動力容易受各種因素影響，同時臨床中發(fā)現(xiàn)精液常規(guī)檢查結果相仿的患者也存在明顯不同的受精率和妊娠結局，說明精液常規(guī)檢查結果用于男性不育及生育結局評估還不夠全面。此外，有研究指出無論男性不育癥患者精液常規(guī)檢查結果是否正常，都可能存在精子DNA異常［2］，因此急需尋找一種新的預測指標。精子DNA碎片指數(shù)（DFI）是一項獨立于精液常規(guī)檢查之外，從分子水平反映精子DNA損傷，評估男性生育力，并在一定程度上可預測輔助生殖技術（ART）臨床結局的參數(shù)，近年來受到廣泛關注［3］。與精液常規(guī)相比，精子DFI變異小、檢查快速、結果穩(wěn)定，被認為是評價男性精液質量和預測男性生育力更有潛力、更加準確的指標。本研究在嚴格控制女方因素和男性患者精子高畸形率的影響后用精子染色質結構分析（SCSA）法檢測精子DFI，研究其評估男性生育力及預測體外受精-胚胎移植（IVFET）/卵胞漿內單精子注射（ICSI）結局的價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象選擇2017年9月—2019年4月安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院生殖中心2 420例男性不育患者，年齡19～66歲，平均（32.29±5.94）歲。納入標準：（1）夫妻雙方第1次接受IVF-ET或ICSI治療。（2）精子畸形率≤96%。（3）女方年齡≤40歲，體質量指數(shù)（BMI）≤30 kg/m2，我院門診就診首次檢測卵泡刺激素（FSH）＜10.00 IU/L，不孕病因僅為輸卵管或卵巢因素且獲卵數(shù)≥5個。排除標準：（1）男方存在嚴重少精子癥（男方精子濃度＜5.00×106/mL）。（2）女方存在雙子宮、單角子宮、縱隔子宮等生殖器畸形，以及存在重度子宮腔粘連、內膜過薄等影響胚胎著床的情況。（3）女方合并有甲狀腺疾病、糖尿病等內分泌疾病。在2 420例患者中選擇117對不孕夫婦，根據(jù)患者情況選擇不同體外受精方式，根據(jù)體外受精方式分組。其中IVF組71對，男方年齡23～49歲，平均（33.51±6.32）歲，女方年齡23～40歲，平均（30.93±4.38）歲；ICSI組46對，男方年齡25～50歲，平均（33.50±5.80）歲，女方年齡23～39歲，平均（30.50±3.76）歲。

1.2 研究方法

1.2.1 精液標本采集患者禁欲3～7 d后，用無毒、無菌容器采集全部精液，并立即置于37℃孵箱內，30 min內觀察精液是否液化，液化后取出標本，用吸管吸取足夠樣本進行檢測。

1.2.2 精子DFI檢測采用美國BD（Becton，Dickinson and Company）公司流式細胞儀（accuri C6）精子染色質結構分析（SCSA）法配合流式細胞術，檢測試劑盒為精子核完整性染色試劑盒［浙江星博生物科技有限公司，YZB/浙（甬）0159-2-12］。調整精子濃度為1×106～2×106個/mL，取100μL用流式細胞術檢測精子DNA完整性，分析5 000條以上為有效數(shù)據(jù)，利用吖啶橙染料的異染性質，使完整的雙鏈DNA精子核顯示綠色熒光，受損的單鏈DNA精子核顯示紅色熒光。根據(jù)DFI值分為A組（DFI≤15%，精子DNA完整性好）、B組（15%＜DFI＜30%，精子DNA完整性一般）、C組（DFI≥30%，精子DNA完整性差）。IVF組與ICSI組分別根據(jù)精子DFI水平進一步各分為3個亞組，即IVF-1組（DFI≤15%）、IVF-2組（15%＜DFI＜30%）、IVF-3組（DFI≥30%）；ICSI-1組（DFI≤15%）、ICSI-2組（15%＜DFI＜30%）、ICSI-3組（DFI≥30%）。

1.2.3 精液質量分析參照第5版《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》采用計算機輔助精子分析系統(tǒng)（computer assisted sperm analysis，CASA）分析精液，應用西班牙SCA全自動精子質量分析儀。精液參數(shù)正常范圍：精液量≥1.5 mL，精子濃度≥15×106/mL，前向運動精子（PR）≥32%，精子活動率≥40%。

1.2.4 精子形態(tài)分析精子形態(tài)學按照第5版《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》推薦方法，采用巴氏染色法，蘇木素-EA50染液染色進行精子形態(tài)學分析，觀察精子畸形率。

1.2.5 IVF-ET和ICSI治療女方按常規(guī)促性腺激素釋放激素激動劑（GnRH-α）長方案進行，通過陰道B超及血清雌二醇（E2）水平監(jiān)測卵泡發(fā)育，卵泡發(fā)育成熟后肌內注射人絨毛膜促性腺激素（HCG），36 h后在B超引導下取卵，采用上游法或密度梯度離心法優(yōu)化處理精液，取卵4～6 h后行IVF或ICSI，授精后16～18 h觀察受精情況。根據(jù)Gardner法對囊胚進行評級，將D5評分≥3BB或D6評分≥4BB定義為優(yōu)質胚胎；選擇1～2個優(yōu)質胚胎冷凍后解凍移植，移植后行黃體支持。移植35 d后B超下見孕囊原始心管搏動為臨床妊娠。

1.2.6 IVF/ICSI臨床結局計算方法IVF受精率=（受精卵數(shù)/獲卵總數(shù)）×100%；ICSI受精率=（受精卵數(shù)/MⅡ卵數(shù)）×100%；卵裂率=（受精卵裂胚胎數(shù)/受精卵數(shù)）×100%；優(yōu)質胚胎率=（優(yōu)質胚胎數(shù)/正常受精卵裂胚胎數(shù)）×100%；臨床妊娠率=（臨床妊娠周期數(shù)/所有移植周期數(shù)）×100%

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，不符合正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)采用M（P25，P75）表示，組間比較Kruskal-WallisH檢驗，兩兩比較用Nemenyi檢驗，相關性分析用Spearman法，符合正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗；計數(shù)資料以例或例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組患者臨床資料比較A、B、C組患者年齡、精子DFI、精子畸形率逐次升高，精子濃度、PR、精子活動率逐次降低（P＜0.01），3組患者精液量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of conventional parameters and deformity rate of sperm between different DFI groups表1 不同精子DFI組精液常規(guī)參數(shù)、畸形率比較

2.2 精子DFI與精液常規(guī)參數(shù)、精子畸形率相關性分析精子DFI與年齡、精子畸形率呈正相關（rs分別為0.186、0.302，均P＜0.01），與精子濃度、PR、精子活動率呈負相關（rs分別為-0.289、-0.618、-0.620，均P＜0.01）。

2.3 各亞組間臨床資料比較見表2。與IVF-1組比較，IVF-3組精子濃度、PR降低；IVF-3組精子畸形率較IVF-2組升高；與ICSI-1組和ICSI-2組比較，ICSI-3組PR降低；ICSI-3組精子畸形率較ICSI-1組升高（P＜0.05）。IVF及ICSI組中各亞組間女方年齡、BMI、FSH、獲卵數(shù)及男方年齡差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

Tab.2 Comparison of basic characteristics,semen parameters and malformation rate between three subgroups表2 各亞組間基本特征、精液參數(shù)、畸形率比較

2.4 各亞組臨床結局比較在IVF組和ICSI組中，各亞組受精率、優(yōu)胚率、臨床妊娠率及卵裂率差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of clinical outcomes between different subgroups表3 各亞組間臨床結局比較

3 討論

精子DFI是反映精子染色質結構，評估男性生育力，并在一定程度上可預測ART臨床結局的參數(shù)。有報道指出高DFI可對精液質量和ART結局產生不良影響［4］，但關于精子DFI與年齡、精液常規(guī)參數(shù)、畸形率的相關性及對ART結局的影響一直有爭議。本研究在嚴格控制女方因素和男性患者精子高畸形率的影響后用SCSA法檢測精子DFI，研究精子DFI評估男性生育力及預測IVF-ET/ICSI結局的價值。

3.1 精子DFI與年齡、精液常規(guī)、畸形率之間的關系本研究對2 420名男性患者精子DFI、年齡、精液常規(guī)、精子形態(tài)學進行分析，結果顯示精子DFI與年齡、精子畸形率呈正相關，與精子濃度、PR、活動率呈負相關；與A組和B組比較，C組年齡、精子畸形率升高，精子濃度、PR、精子活動率降低，與既往研究［5-6］一致。人類成熟精子核由組蛋白（15%）和魚精蛋白（85%）結合形成復合體。魚精蛋白是一種小分子堿性蛋白質，通過中和DNA的負電荷并與二硫鍵交聯(lián)使細胞核更為致密。在精子核成熟過程中，精子染色質內的組蛋白被只有其一半體積的魚精蛋白通過中間過渡蛋白形成魚精蛋白-DNA復合體。魚精蛋白-DNA復合體形成高度濃縮的染色質結構，使精子核極度壓縮，保護精子抵抗外界氧化或高溫等，有利于精子在生殖道內的運動和受精，使遺傳物質準確進入胚胎?；尉佑捎诩毎藘若~精蛋白-DNA復合體減少，不能壓縮精子核，導致精子核內存在大量體積較大的組蛋白，精子染色質結構疏松，精子DNA易發(fā)生損傷，且畸形精子產生的氧自由基（ROS）也可導致精子DNA損傷，最終使精子DNA碎片增多，精子DFI升高，表明精子DFI與精子畸形率相關，Yang等［7］研究也證實了這一點。而Le等［8］研究結果顯示精子DFI與精液常規(guī)各參數(shù)、畸形率相關性較弱，李紅芳等［9］研究亦指出精子DNA碎片率與精液常規(guī)各參數(shù)無相關性。對比分析原因可能與以下因素有關：（1）精子DFI檢測方法不同。（2）樣本量、研究方法和男性患者納入標準不同。Le等［8-9］采用染色質分散試驗（SCD）法，樣本量小（318例和112例），而本研究采用檢測精子DNA損傷金標準的SCSA法配合流式細胞術，且樣本量較大，更具有代表性。

3.2 精子DFI與IVF/ICSI臨床結局的關系本研究結果顯示IVF組和ICSI組受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、臨床妊娠率差異均無統(tǒng)計學意義，與既往研究［10-11］結果一致。但Simon等［12］通過Meta分析表明精子DFI較高會降低IVF/ICSI臨床妊娠率，原因可能為：（1）精液經過上游法和密度梯度離心優(yōu)化精子處理后精子DFI、畸形率降低，使得高精子DFI對臨床妊娠結局的影響減弱。（2）胚胎移植時優(yōu)先選擇優(yōu)質胚胎，這可能也是造成精子DFI與臨床妊娠結局無關的原因。（3）胚胎早期發(fā)育受母源性基因控制，精子DNA損傷被部分修復后成功妊娠，后期父源性基因激活發(fā)揮作用，精子DFI高患者胚胎可能最終無法持續(xù)妊娠至3個月后或者最終生產。Cissen等［13］也認為沒有足夠的證據(jù)推薦在進行ART夫婦中常規(guī)使用精子DNA碎片測試來預測妊娠和選擇治療方案，需要進一步研究精子DFI對3個月后妊娠率的預測價值，同時與3個月后妊娠的其他預測因子如女性年齡、男性年齡、精液參數(shù)和卵母細胞數(shù)量等進行比較。Esteves等［14］也提出出生率是評估精子DNA碎片化試驗的終點，并提出在IVF和ICSI組高精子DFI導致低出生率。

綜上所述，精子DFI與年齡、精子濃度、PR、精子活動率、畸形率相關，建議將精子DFI檢測作為精液分析的常用項目，以完善對男性生育能力的評價，并指導治療。精子DFI對IVF/ICSI臨床結局無預測價值，不建議將精子DFI檢測作為選擇ART方案時的檢查項目。