喻青青 樊 旭 朱 敏 郗雪艷 杜伯雨

(湖北醫(yī)藥學(xué)院，十堰 442000)

肝癌的發(fā)病率不斷增加，腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell，CSCs)理論為肝癌的治療提供了新的思路[1]。CSCs有腫瘤樣特征，能夠維持其自我更新和分化的能力[2]。肝癌中也存在肝癌干細(xì)胞(liver cancer stem cells，LCSCs)[3]。因此，CSCs的特異性靶向治療對(duì)根除腫瘤和預(yù)防肝癌發(fā)生具有重要意義。

目前從中草藥中尋找天然抗腫瘤活性成分是抗癌藥物研究的一個(gè)重要途徑和研究熱點(diǎn)[4]。重樓現(xiàn)有藥理研究表明，重樓具有抗腫瘤活性作用[5]。本文應(yīng)用重樓有效成分重樓皂苷Ⅰ，通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞Huh7和HepG2的抑制作用，初步探究其是否具有抑制肝癌干細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1材料 HepG2細(xì)胞 和Huh7細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科研學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。重樓皂苷Ⅰ(純度98%)購自上海源葉生物科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自 Gibco公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞及藥物處理 人肝癌細(xì)胞Huh7和HepG2分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合為90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，不同濃度重樓皂苷Ⅰ處理肝癌細(xì)胞Huh7和HepG2。處理方法如下：①重樓皂苷Ⅰ(3.12 、6.25、12.50 μmol/L)處理肝癌細(xì)胞Huh7；②重樓皂苷Ⅰ(6.25、12.50、25 μmol/L)處理肝癌細(xì)胞HepG2，處理時(shí)間為24 h。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 選取80%～90%生長(zhǎng)密度且狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞Huh7和HepG2制成1×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，向96孔板中接種100 μl上述細(xì)胞懸液，對(duì)照孔用添加DMSO的培養(yǎng)液制成的細(xì)胞懸液，每個(gè)濃度接種6個(gè)孔。培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度重樓皂苷Ⅰ(1.56、3.12、6.25、12.50、25、50 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。移除培養(yǎng)液，向孔板中加入100 μl 0.5%MTT溶液，孵育4 h后棄上清，加入150 μl DMSO 振蕩6 min，溶解結(jié)晶物后570 nm處檢測(cè)吸光值，計(jì)算抑制率。抑制率%= (1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.3Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 取對(duì)數(shù)期肝癌細(xì)胞Huh7和HepG2，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，以無血清DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×106個(gè)/ml。向Transwell小室上部培養(yǎng)室內(nèi)加入200 μl細(xì)胞懸液，向底部培養(yǎng)室加入650 μl含10%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)24 h。然后，對(duì)照組不加藥，實(shí)驗(yàn)組給予不同濃度的重樓皂苷Ⅰ處理肝癌細(xì)胞Huh7(3.12、6.25、12.50 μmol/L)，HepG2(6.25、12.50、25 μmol/L)，處理時(shí)間24 h。吸去嵌室內(nèi)液體，用棉棒擦去嵌室底部?jī)?nèi)表面的細(xì)胞，以多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，PBS漂洗，于光鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞Huh7和HepG2，將計(jì)數(shù)好的細(xì)胞懸液加入6 cm培養(yǎng)皿中，使每皿細(xì)胞數(shù)為2×105個(gè)，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。然后，對(duì)照組不加藥，實(shí)驗(yàn)組給予不同濃度的重樓皂苷Ⅰ處理肝癌細(xì)胞Huh7(3.12、6.25、12.50 μmol/L)，HepG2(6.25、12.50、25 μmol/L)，處理24 h。收集細(xì)胞，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，用4℃預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次，并用1×結(jié)合緩沖液將各組待測(cè)細(xì)胞制成 1×106個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，用異硫氰酸熒光素(annexin V-fluorescein isothiocyanate,FITC)，碘化丙啶(propidium iodide，PI)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，室溫避光孵育15 min，利用流式細(xì)胞儀對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5磁珠分選(MACS)分選CD133+/CD133-Huh7和CD133+/CD133-HepG2細(xì)胞 取狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞Huh7和HepG2，胰酶消化后加入適量的DMEM液終止消化，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，使細(xì)胞總量達(dá)到約1×107個(gè)。每1×107個(gè)細(xì)胞加入80 μl緩沖液重懸，再加入20 μl CD133+微珠，4℃避光孵育30 min后離心去上清液。每1×108個(gè)細(xì)胞用緩沖液重懸細(xì)胞后過柱，分別收集CD133+/CD133--Huh7和CD133+/CD133--HepG2細(xì)胞。

1.2.6CD133+及CD133-細(xì)胞體外成球?qū)嶒?yàn) 將CD133+和CD133-細(xì)胞分別以2×103個(gè)/孔接種于6孔板中，均給予含生長(zhǎng)因子的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基(32 μl 25 ng/ml EGF+40 μl 20 ng/ml FGF+800 μl B27+40 ml DMEM/F12)，置于含5%CO2的37℃恒溫箱中培養(yǎng)，每隔3 d換液，培養(yǎng)第10天時(shí)用倒置顯微鏡觀察陽性及陰性細(xì)胞各自生長(zhǎng)成球情況。

2 結(jié)果

2.1重樓皂苷Ⅰ可抑制肝癌細(xì)胞系Huh7和HepG2的活力 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率分析重樓皂苷Ⅰ對(duì)肝癌細(xì)胞活力的影響。結(jié)果如圖1A所示，對(duì)于Huh7細(xì)胞，當(dāng)重樓皂苷Ⅰ的濃度大于1.56 μmol/L 時(shí)，Huh7細(xì)胞的存活率降低到80%以下并且隨濃度的增加而降低。圖1B顯示，對(duì)于HepG2細(xì)胞，當(dāng)重樓皂苷Ⅰ的濃度大于3.12 μmol/L時(shí)，HepG2細(xì)胞的存活率降低到80%以下并且隨濃度的增加而降低。

2.2重樓皂苷Ⅰ可抑制Huh7和HepG2的遷移能力 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果：圖2A和圖2B均顯示，重樓皂苷Ⅰ劑量組，隨著重樓皂苷Ⅰ濃度的增加，穿膜細(xì)胞數(shù)量逐漸下降并低于對(duì)照組。

2.3重樓皂苷Ⅰ可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡 圖3A顯示，與空白對(duì)照組比較，重樓皂苷Ⅰ干預(yù)Huh7細(xì)胞24 h后，隨著給藥劑量的增加，活細(xì)胞數(shù)量明顯降低，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，凋亡率從(22.32±4.83)%增加到(46.86±4.53)%，表明重樓皂苷Ⅰ誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞發(fā)生凋亡。圖3B顯示，重樓皂苷Ⅰ作用HepG2細(xì)胞24 h后，6.25 μmol/L組細(xì)胞凋亡率為(17.27±4.35)%，12.50 μmol/L組細(xì)胞凋亡率為(27.52±6.65) %，25 μmol/L細(xì)胞凋亡率為(43.76±6.77)%，均明顯高于對(duì)照組(0.67±0.07)%。說明重樓皂苷Ⅰ對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的誘導(dǎo)作用存在濃度依賴性。

圖1 重樓皂苷Ⅰ對(duì)Huh7和HepG2細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of Polyphyllin Ⅰ on cell viability in Huh7 cells and HepG2 cellsNote:*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001 vs control group.

圖2 Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重樓皂苷Ⅰ對(duì)Huh7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞遷移能力的影響(×20)Fig.2 Influence of PolyphyllinⅠ on migration ability of Huh7 cells and HepG2 cells by Transwel1 cel1 migratioll assay(×20)

2.4重樓皂苷Ⅰ對(duì)肝癌干細(xì)胞的影響 細(xì)胞培養(yǎng)至第8天時(shí)，CD133+細(xì)胞組培養(yǎng)基中大量懸浮細(xì)胞逐漸聚集成團(tuán)呈立體球狀，而CD133-細(xì)胞在相同條件下球狀相對(duì)較小。給予含CD133+、CD133-的Huh7細(xì)胞6.25μmol/L重樓皂苷Ⅰ處理24 h，給予含CD133+、CD133-的HepG2細(xì)胞12.5 μmol/L重樓皂苷Ⅰ處理24 h，發(fā)現(xiàn)含CD133+、CD133-的Huh7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)的形態(tài)都發(fā)生同樣的變化，細(xì)胞團(tuán)溶解，逐漸變小，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生皺縮。如圖4。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)觀察重樓皂苷Ⅰ對(duì)Huh7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Detection of apoptosis in Huh7 cells and HepG2 cells were tread with different concentrations of PolyphyllinⅠby flow cytometric analysisNote:*.P<0.05,**.P<0.01 vs control group.

圖4 重樓皂苷Ⅰ對(duì)肝癌腫瘤干細(xì)胞的影響(×10)Fig.4 Effects of Polyphyllin I on stem cell balls of Huh7 cells and HepG2 cells(×10)

3 討論

幾乎所有的惡性腫瘤中都潛伏著極少的CSCs，是癌癥產(chǎn)生、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移乃至放化療抵抗以及治療失敗的根源[6]。肝癌已成為全球癌癥相關(guān)死亡的第二大原因，每年新增肝癌患者30萬～100萬例[7]。肝癌中也存在LCSCs，尋找LCSCs特異性靶點(diǎn)以及針對(duì)LCSCs的診斷及治療，將會(huì)為肝癌的預(yù)防、早期診斷、有效治療、預(yù)后監(jiān)測(cè)以及徹底治愈肝癌開辟一條嶄新的途徑[8]。

植物類抗腫瘤藥物是目前的研究熱點(diǎn)，重樓是其中之一[9-11]。重樓皂苷Ⅰ為重樓的主要有效成分，一些研究表明，重樓皂苷Ⅰ對(duì)卵巢癌、胃癌、骨髓瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等具有抗腫瘤的作用[12-17]。目前重樓皂苷Ⅰ在LCSCs中的作用還不清楚，因此，本文選取了肝癌細(xì)胞株Huh7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，旨在研究重樓皂苷Ⅰ在LCSCs中的作用[18-23]。

MTT結(jié)果顯示，重樓皂苷Ⅰ在體外對(duì)肝癌細(xì)胞株Huh7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，并且隨著藥物濃度的增加，抑制作用愈加明顯。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重樓皂苷Ⅰ作用于Huh7細(xì)胞時(shí)，當(dāng)濃度為6.25 μmol/L時(shí)，其抑制率為59%；重樓皂苷Ⅰ作用于HepG2細(xì)胞時(shí)，當(dāng)濃度為12.50 μmol/L，其抑制率45%；因此選取了不同給藥濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

目前治療腫瘤廣泛采用的策略主要是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，是治療腫瘤藥物的重要作用機(jī)制之一[24-26]。通過Annexin V-FITC/PI 雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)可見重樓皂苷Ⅰ對(duì)肝癌細(xì)胞細(xì)胞株誘導(dǎo)凋亡作用。重樓皂苷Ⅰ作用Huh7細(xì)胞24 h，細(xì)胞凋亡率隨濃度增加而增加；重樓皂苷Ⅰ作用HepG2細(xì)胞24 h后，對(duì)細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)存在濃度依賴性。

腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移的過程中最為關(guān)鍵的步驟就是腫瘤細(xì)胞的遷移[27]，它是導(dǎo)致患者死亡的重要原因之一。通過Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在Huh7細(xì)胞及HepG2細(xì)胞中重樓皂苷Ⅰ劑量與對(duì)照組比較，隨著濃度的增加，穿膜細(xì)胞數(shù)量逐漸下降，因此，重樓皂苷Ⅰ能抑制肝癌細(xì)胞株Huh7和HepG2細(xì)胞的遷移能力。

目前有多種表面標(biāo)志物被用來區(qū)別LCSCs，例如CDl33[28]。目前CD133+己成為包括肝癌在內(nèi)的多種實(shí)體腫瘤CSCs的標(biāo)志物[29]。可以采用免疫磁珠分離技術(shù)，以CD133為特征性表面標(biāo)志物來得到LCSCs[30]。結(jié)果顯示，免疫磁珠分選得到的CD133+-Huh7細(xì)胞和CD133+-Huh7細(xì)胞對(duì)比CD133--HepG2細(xì)胞和CD133--HepG2具有更強(qiáng)的體外成球能力，進(jìn)而采用中濃度的重樓皂苷Ⅰ處理腫瘤細(xì)胞球24 h，結(jié)果顯示CD133+及CD133-的腫瘤細(xì)胞球變小，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生皺縮。

本研究表明，重樓皂苷Ⅰ抑制肝癌細(xì)胞株Huh7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)兩種細(xì)胞的凋亡，降低其遷移能力。但是磁珠分選LCSCs后，通過無血清體外成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，得出結(jié)論是重樓皂苷Ⅰ不具備明顯的殺傷LCSCs的能力，提示重樓皂苷Ⅰ可能不是通過作用于LCSCs發(fā)揮抗肝癌作用，有待進(jìn)一步研究并探討重樓皂苷Ⅰ抗肝癌的作用機(jī)制，為臨床開發(fā)新的抗肝癌的藥物提供新的思路和基礎(chǔ)。