張鼎偉 張燕飛 汪 煒 霍 佳 楊珮雯 張鈺匯 王 媛

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科，西安 710004)

銀屑病是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的常見的慢性炎癥性皮膚病，主要表現(xiàn)為表皮角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖，分化異常，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，促炎細(xì)胞因子釋放等[1]。盡管其發(fā)病潛在機(jī)制非常復(fù)雜，尚不明確，但免疫功能障礙在該病的發(fā)病過程中起著至關(guān)重要的作用，特別是T細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)參與了銀屑病的發(fā)生和維持。免疫細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，如IL-17、IFN-γ、TNF-α和IL-22，這些細(xì)胞因子又作用于角質(zhì)形成細(xì)胞以加重銀屑病炎癥，最終導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、分化、凋亡異常，形成了臨床可見的銀屑病特征性皮損[2]。

免疫系統(tǒng)在銀屑病的發(fā)病過程中起著至關(guān)重要的作用，免疫細(xì)胞產(chǎn)生的大量炎癥細(xì)胞因子促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。在銀屑病的皮膚區(qū)域，促炎細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)升高，吸引免疫細(xì)胞，導(dǎo)致局部和侵襲細(xì)胞的增殖。IL-17、IL-22、TNF-α等多種炎癥因子被認(rèn)為是銀屑病的重要病理因素。IL-22主要是由多種免疫細(xì)胞比如Th17和Th22產(chǎn)生，在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[3]。IL-22通過誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞快速增殖，并特異性表達(dá)IL-22受體，從而導(dǎo)致銀屑病的發(fā)病[4]。此外，IL-22在銀屑病患者的血清中高表達(dá)，且與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[5]。IL-22在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮非常重要的作用，常被用于體外誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞炎癥或異常增生作為銀屑病的研究模型[6]。

Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor kazal type，SPINK)家族是一類具有Kazal結(jié)構(gòu)域的絲氨酸蛋白酶抑制劑，與多種人類疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7]。Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子7(SPINK7)，又名食管癌相關(guān)基因2(ECRG2)是SPINK家族的重要成員，與皮膚等組織的炎癥性疾病相關(guān)。有研究報(bào)道SPINK7在銀屑病和濕疹等炎癥性皮膚病中表達(dá)上調(diào)[8]。本研究通過利用IL-22刺激人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞建立的炎癥模型，探討SPINK7對(duì)IL-22誘導(dǎo)人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT增殖能力及炎癥應(yīng)答的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；MTT試劑盒和二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Trizol試劑盒和細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；IL-23、TNF-α和IL-17A檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；anti-SPINK7抗體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；anti-cyclin D1、anti-survivin、anti-β-catenin和anti-c-Myc抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；anti-β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將HaCaT置于10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后更換新鮮的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)、傳代。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。用100 ng/ml IL-22刺激HaCaT細(xì)胞，模擬銀屑病炎癥模型。

1.2.2SPINK7 siRNA序列為5′-AAAGTAATGGAAGAGTTCAGTTT-3′，由上海GenePharma公司合成。使用BgⅢ和HindⅢ限制酶將siRNA寡核苷酸序列克隆至pSUPER.Retro.puro逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，構(gòu)建pSUPER.Retro.puro-SPINK7-siRNA質(zhì)粒，并經(jīng)測(cè)序分析驗(yàn)證。

1.2.3RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá) 采用TRIzol法按照說明書步驟提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)進(jìn)行RNA定量。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用SYBR Green Master熒光定量PCR試劑在7900HT熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)以檢測(cè)目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染后48 h，收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，通過BCA法檢測(cè)總蛋白濃度。運(yùn)用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次；用ECL化學(xué)發(fā)光劑孵育，顯色終止后用凝膠成像儀進(jìn)行拍照采集圖片，并用Image J圖像分析軟件進(jìn)行條帶的灰度值分析，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 將各組細(xì)胞接種至96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為5×103個(gè)，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。轉(zhuǎn)染24 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加 20 μl 濃度為5 mg/ml的MTT培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，棄去上清，每孔加150 μl DMSO室溫振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在 490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值。

1.2.6ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中的IL-23、TNF-α和IL-17A 收集各組細(xì)胞上清液，采用ELISA法分別檢測(cè)上清液中IL-23、TNF-α和IL-17A的表達(dá)水平，參照ELISA試劑盒說明書分別測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處各孔吸光度值。

2 結(jié)果

2.1IL-22誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞中SPINK7高表達(dá) 檢測(cè)IL-22刺激對(duì)HaCaT細(xì)胞中SPINK7表達(dá)量的影響，結(jié)果如圖1所示，HaCaT細(xì)胞經(jīng)IL-22處理后，SPINK7的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)，說明IL-22能夠誘導(dǎo)SPINK7表達(dá)上調(diào)。為進(jìn)一步研究SPINK7在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的作用，采用小干擾RNA技術(shù)抑制HaCaT細(xì)胞中SPINK7表達(dá)量，并利用RT-PCR和Western blot檢測(cè)SPINK7的mRNA和蛋白表達(dá)水平以評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染是否成功。結(jié)果如圖1所示，si-SPINK7轉(zhuǎn)染有效降低了HaCaT細(xì)胞中SPINK7的表達(dá)水平。

2.2SPINK7沉默抑制IL-22誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞增殖 IL-22可誘導(dǎo)培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。為研究SPINK7是否能夠參與調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，MTT法檢測(cè)結(jié)果如圖2A顯示，與Control組相比，IL-22作用于HaCaT細(xì)胞后可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞增殖；而SPINK7沉默對(duì)IL-22誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用；該結(jié)果表明SPINK7沉默顯著抑制IL-22-誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)。進(jìn)而利用Western blot檢測(cè)SPINK7沉默對(duì)IL-22刺激的HaCaT細(xì)胞中cyclin D1及survivin表達(dá)的影響。結(jié)果如圖2B、C顯示，IL-22刺激顯著上調(diào)cyclin D1及survivin表達(dá)量；而SPINK7沉默后，cyclin D1及survivin表達(dá)水平明顯降低。由此推測(cè)SPINK7沉默可能通過下調(diào)cyclin D1及survivin表達(dá)從而抑制IL-22誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)。

2.3沉默SPINK7抑制IL-22誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞炎癥損傷 RT-PCR檢測(cè)SPINK7對(duì)IL-22刺激的炎癥反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖3A、C所示，與Control組相比，IL-22誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞中IL-23、TNF-α和IL-17A mRNA的表達(dá)水平均顯著升高；而沉默SPINK7后能夠降低炎癥因子IL-23、TNF-α和IL-17A的mRNA的水平。進(jìn)一步用ELISA檢測(cè)上清中細(xì)胞因子分泌水平，結(jié)果如圖3D～F顯示，IL-22處理后促炎癥細(xì)胞因子IL-23、TNF-α和IL-17A的含量均有所增加；抑制SPINK7后顯著降低細(xì)胞上清中IL-23，TNF-α和IL-17A的表達(dá)量。上述結(jié)果表明SPINK7沉默通過下調(diào)炎癥因子表達(dá)，阻斷IL-22誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的保護(hù)作用。

圖1 IL-22誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞中SPINK7高表達(dá)Fig.1 SPINK7 was enhanced in IL-22-stimulated HaCaT cellsNote:A.The mRNA expression of SPINK7 was detected using RT-PCR assay；B.Western blot analysis was conducted to measure the protein level of SPINK7.*.P<0.05 vs Control;#.P<0.05 vs IL-22+si-NC.n=3.

圖2 SPINK7對(duì)IL-22誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effects of SPINK7 on IL-22-induced HaCaT cell proliferationNote:A.MTT assay was applied to evaluate cell proliferation；B and C.The protein expression of cyclin D1 and survivin was determined using Western blot analysis.*.P<0.05 vs Control;#.P<0.05 vs IL-22+si-NC.n=3.

圖3 SPINK7對(duì)IL-22誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響Fig.3 Influence of SPINK7 on IL-22-stimulated inflam-mation response in HaCaT cellsNote:A～C.The mRNA expression of inflammation factors IL-23,TNF-α and IL-17A was evaluated using RT-PCR assay；D～F.ELISA assay was performed to estimate the production of inflammation mediators.*.P<0.05 vs Control;#.P<0.05 vs IL-22+si-NC.n=3.

圖4 SPINK7對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響Fig.4 Effects of SPINK7 on Wnt/β-catenin signalingNote:Western blot was applied to detect the expression of β-catenin and c-Myc.*.P<0.05 vs Control;#.P<0.05 vs IL-22+si-NC.n=3.

2.4沉默SPINK7抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活 Western blot法檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖4顯示，IL-22刺激顯著增加Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白β-catenin表達(dá)量，其下游靶基因c-Myc表達(dá)水平也明顯升高，從而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路；SPINK7沉默后，β-catenin和c-Myc的蛋白表達(dá)水平下降，提示沉默SPINK7能夠抑制IL-22激活的Wnt/β-catenin信號(hào)通路。

3 討論

銀屑病是一種以角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖分化和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的慢性炎癥性皮膚病。HaCaT細(xì)胞為人永生化的角質(zhì)形成細(xì)胞，具有無限增殖、易培養(yǎng)、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，且其生物學(xué)特性與人原代角質(zhì)形成細(xì)胞幾乎一致。因此，本研究采用IL-22刺激HaCaT細(xì)胞體外模擬角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖的病理狀態(tài)即類銀屑病病理模型。有研究報(bào)道SPINK7在銀屑病中高表達(dá)，而本實(shí)驗(yàn)表明IL-22處理導(dǎo)致SPINK7的mRNA及其蛋白表達(dá)顯著升高，說明SPINK7在銀屑病發(fā)展中具有重要作用。

角化細(xì)胞的過度增殖和皮膚組織的持續(xù)炎癥是銀屑病的主要病理過程。角質(zhì)形成細(xì)胞異常、過度、快速增殖是皮膚病變的重要原因，已知各種因素可導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖。Cyclin D1是原癌基因，在細(xì)胞G1/S轉(zhuǎn)換中起促進(jìn)作用；survivin是凋亡蛋白抑制劑家族中的成員，是迄今發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的凋亡抑制因子，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。本研究發(fā)現(xiàn)SPINK7沉默對(duì)IL-22誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞異常增殖具有明顯抑制作用。同時(shí)SPINK7沉默明顯抑制IL-22誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞中cyclin D1和survivin表達(dá)，提示SPINK7沉默可能通過抑制cyclin D1和survivin的表達(dá)發(fā)揮抑制IL-22誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞增殖。

銀屑病是一種慢性皮膚炎癥性疾病，控制病理過程中的炎癥反應(yīng)將有助于銀屑病疾病的預(yù)防和治療。大量文獻(xiàn)表明，免疫系統(tǒng)在銀屑病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，免疫細(xì)胞產(chǎn)生的大量炎癥細(xì)胞因子(IL-17、IL-22等)能夠促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖[9]。有證據(jù)表明，趨化因子和炎癥細(xì)胞因子的異常分泌導(dǎo)致了疾病的進(jìn)展[10]。在參與炎癥反應(yīng)的眾多介質(zhì)中，TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17都是與炎癥密切相關(guān)的因子，參與HaCaT細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。而IL-23、Th17軸在銀屑病發(fā)生發(fā)展中起重要作用[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-22刺激明顯導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞內(nèi)促炎癥因子IL-23、TNF-α和IL-17A的表達(dá)水平顯著上升，而SPINK7沉默后抑制這些炎癥因子的分泌，從而減輕細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。上述結(jié)果提示沉默SPINK7可能通過抑制增殖及炎癥因子的釋放，從而發(fā)揮抗銀屑病的作用，SPINK7有望成為銀屑病治療的新靶點(diǎn)。

進(jìn)一步探討沉默SPINK7對(duì)IL-22誘導(dǎo)HaCaT增殖和炎癥應(yīng)答調(diào)控的分子機(jī)制。Wnt/β-catenin信號(hào)通路涉及機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育以及細(xì)胞的增殖、凋亡等重要過程。已有研究表明Wnt/β-catenin通路異常激活與銀屑病的發(fā)生密切相關(guān)[12-13]。本研究通過Western blot檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵分子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-22處理后，β-catenin和c-Myc蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)而激活Wnt/β-catenin通路，但是沉默SPINK7能夠顯著降低β-catenin和c-Myc的表達(dá)，表明SPINK7沉默可抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，提示SPINK7沉默導(dǎo)致的對(duì)HaCaT細(xì)胞異常增殖和炎癥反應(yīng)的抑制作用可能與調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活有關(guān)。

綜上所述，沉默SPINK7可有效抑制IL-22誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞異常增殖和炎癥反應(yīng)，該過程可能與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活有關(guān)。了解SPINK7在銀屑病發(fā)病機(jī)制和Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的確切作用有望為尋常型銀屑病的發(fā)病機(jī)制及治療的研究提供一個(gè)新的思路，為本課題組進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)。