張力杰 陳 明 朱偉東

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院泌尿外科，南京 210009)

良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)是中老年男性高發(fā)疾病之一，早期無(wú)明顯癥狀，但隨著下尿路梗阻加重，可出現(xiàn)一系列下尿路癥狀(low urinary tract symptoms，LUTS)，如尿頻、尿急、尿失禁等。既往研究認(rèn)為，BPH患者的LUTS發(fā)生原因主要可歸結(jié)為2類(lèi)：靜態(tài)因素(前列腺體積增大)與動(dòng)態(tài)因素(膀胱頸、前列腺平滑肌張力異常)[1]。近期研究發(fā)現(xiàn)，前列腺炎癥(prostatic inflammation，PI)可能是決定BPH相關(guān)性LUTS的另一重要因素，但其與LUTS的確切關(guān)系仍存在爭(zhēng)議[2]。PI常表現(xiàn)為尿路刺激癥狀等，其發(fā)病機(jī)制多與免疫功能下降、炎癥感染等相關(guān)，因其癥狀與BPH相似，臨床中往往難以區(qū)分，影響患者治療及預(yù)后[3]。研究發(fā)現(xiàn)，免疫-炎癥紊亂與PI密切相關(guān)，以活化T淋巴細(xì)胞研究最多，且證實(shí)輔助性T細(xì)胞(helper T cells，Th)參與前列腺疾病的發(fā)生發(fā)展，但關(guān)于Th1/Th2、CD4+T細(xì)胞在BPH及PI中的作用尚未完全明確[4]。本研究檢測(cè)BPH患者前列腺組織及外周血中Th1/Th2/Th17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)情況，并區(qū)分伴或不伴PI患者的各因子表達(dá)水平，探討多參數(shù)聯(lián)合檢測(cè)在BPH診療中的意義，為BPH的多因子治療提供參考。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對(duì)象 收集2016年8月～2018年8月在我院接受外科手術(shù)治療的BPH患者120例為BPH組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合手術(shù)指征并行尿道前列腺電切術(shù)治療，且術(shù)后病理檢查確診為BPH；②術(shù)前國(guó)際前列腺癥狀評(píng)分(IPSS)>13分；③年齡45～85歲；④手術(shù)病理及臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①未經(jīng)病理檢查證實(shí)為BPH者；②疑似或明確診斷為前列腺癌者；③存在前列腺手術(shù)史者；④存在PI史或反復(fù)尿路感染史者。另選擇同期且年齡與BPH組相匹配的健康志愿者40例作為對(duì)照組，均無(wú)急慢性感染、自身免疫性疾病及性傳播疾病，近6個(gè)月內(nèi)無(wú)嚴(yán)重外傷史及手術(shù)史。所有受試者知情同意，研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.1.2儀器與試劑 FACS Calibur型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD Bio-science公司)；2010型電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑盒(美國(guó)羅氏公司)；PE標(biāo)記IL-17A單抗、FITC標(biāo)記CD4及CD25、APC標(biāo)記CD127、PE標(biāo)記的IFN-γ、IL-2、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-4、IL-6、IL-10抗體及其通行對(duì)照抗體、完全RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)BD公司)；離子霉素、佛波酯(PMA)刺激劑(美國(guó)Sigma公司)；其余常規(guī)試劑為實(shí)驗(yàn)室分析純。

1.2方法

1.2.1樣本采集 受試者隔夜空腹8 h以上，次日清晨取空腹靜脈血3 ml置于EDTA抗凝采血管內(nèi)混勻，室溫下1 500 r/min離心5 min，吸取血漿分裝于凍存管，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2CBA法檢測(cè)外周血Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子水平 采用15 ml離心管，按照CBA Flex Set試劑盒制備細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品(2 500 pg/ml)，按照1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256梯度標(biāo)記8個(gè)流式管，檢測(cè)稀釋液作用標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照。上述各管內(nèi)分別加入稀釋液300 μl，并從原液管開(kāi)始逐步按照相應(yīng)比例稀釋。捕獲微球后分別取出10 μl，根據(jù)需要檢測(cè)的總樣本數(shù)計(jì)算總微球吸取體積=樣本數(shù)×10 μl。本次檢測(cè)7個(gè)因子即捕獲7種微球，混合后于200 g離心5 min，棄上清，血清增強(qiáng)液中重懸，振蕩混勻，室溫下避光保存30 min。各試管中加入捕獲微球混合品各50 μl，標(biāo)準(zhǔn)管中加入等量稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品，樣本管加入待測(cè)樣本50 μl，各試管中均加入人Th1/Th2/Th17藻紅蛋白檢測(cè)試劑各50 μl。室溫下避光孵育3 h，加入1 ml洗液離心5 min，棄上清，加入洗液300 μl進(jìn)行微球重懸處理。渦旋振蕩3～5 s混勻，上機(jī)檢測(cè)，采用FCAP Array v3.0軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3外周血Th1/Th2/Th17細(xì)胞數(shù)量檢測(cè) 取抗凝血100 μl于試管中，加入等量無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液(1∶1)，加入5 μl PMA工作液(1 μg/ml)、離子霉素工作液4 μl與6 μl莫能霉素工作液(0.1 mg/ml)混勻，37℃、5%CO2培養(yǎng)4～6 h。取出培養(yǎng)試管，加入20 μl CD4-FITC抗體于室溫下避光孵育20 min，加入BD固定破膜劑進(jìn)行細(xì)胞固定破膜，室溫下避光孵育20 min，PBS洗滌1次，分別加入IFN-γ-APC、IL-4-PE-CY5與IL-17-APC-H7單抗混勻，室溫避光孵育30 min，350 g離心30 min，含1%FBS的PBS洗滌2次，棄上清。加入200 μl含1%FBS的PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。按照上述步驟制備同型對(duì)照管，加入IgG1-FITC、IgG-PE抗體進(jìn)行檢測(cè)，各管細(xì)胞數(shù)為20 000個(gè)，計(jì)算Th1/Th2/Th17細(xì)胞百分比，F(xiàn)lowjo 7.6.2 軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.4前列腺組織中IL-17蛋白表達(dá)檢測(cè) BPH組患者在TURP術(shù)中采集病灶組織，采用4%甲醛固定、石蠟包埋并連續(xù)切片，切片厚度3 μm，HE染色。由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生進(jìn)行雙盲閱片，并根據(jù)國(guó)際前列腺炎組織學(xué)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織炎癥分級(jí)評(píng)價(jià)，分為無(wú)炎癥、輕度炎癥(組織內(nèi)有散在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn))、中度炎癥(聚集性分布炎癥細(xì)胞，但無(wú)腺體上皮組織損傷或淋巴樣小結(jié)節(jié))、重度炎癥(聚集性炎癥細(xì)胞并形成淋巴樣小結(jié)節(jié)或伴腺體上皮組織損傷)[5]。采用免疫組化法測(cè)定組織中IL-17A、IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10蛋白表達(dá)。細(xì)胞基質(zhì)和(或)細(xì)胞核呈棕色顆粒沉著為陽(yáng)性。選擇染色良好區(qū)域測(cè)定灰度值，采用Leica Q550CW圖像采集分析系統(tǒng)分析，選擇3張染色較好的切片置于顯微鏡下觀察(×400)，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，測(cè)定單位面積內(nèi)染色細(xì)胞(陽(yáng)性)光密度值(A)作為蛋白表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1HE染色結(jié)果 BPH組HE染色鏡下可見(jiàn)腺體上皮細(xì)胞為簇狀增生或乳頭狀增生，上皮細(xì)胞體積較大，無(wú)明顯核仁，細(xì)胞質(zhì)淡染，胞核呈短梭形，胞間界限模糊不清。91例符合PI標(biāo)準(zhǔn)，占75.83%，其中，輕度炎癥24例，中度炎癥49例，重度炎癥18例。

2.2各組一般資料比較 3組研究對(duì)象年齡、體重指數(shù)(BMI)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；BPH-PI組患者病程、前列腺體積、總前列腺特異性抗原(t-PSA)及IPSS評(píng)分顯著高于單純BPH組(P<0.05)，但單純BPH組的t-PSA與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組一般資料比較Tab.1 Comparison of general data of each group

2.3各組Th1/Th2/Th17細(xì)胞比例比較 與對(duì)照組相比，BPH組Th1細(xì)胞比例、Th1/Th2比值和Th17細(xì)胞比例明顯升高(P>0.05)且BPH-PI組變化更為顯著，Th2細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組Th1/Th2/Th17細(xì)胞比例比較Tab.2 Comparison of Th1/Th2/Th17 cell percentage in each group

2.4各組外周血Th1/Th2/Th17相關(guān)細(xì)胞因子水平比較 與對(duì)照組相比，單純BPH組和BPH-PI組外周血IL-17A、IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10水平顯著升高(P<0.05)，且BPH-PI組顯著高于單純BPH組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組外周血Th1/Th2/Th17相關(guān)細(xì)胞因子水平比較Tab.3 Comparison of levels of Th1/Th2/Th17 related cytokine in peripheral blood of each

2.5BPH患者前列腺組織中Th1/Th2/Th17相關(guān)細(xì)胞因子蛋白表達(dá)比較 BPH-PI組患者前列腺組織中IL-17A、IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10蛋白表達(dá)顯著高于單純BPH組(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 BPH患者前列腺組織中Th1/Th2/Th17相關(guān)細(xì)胞因子蛋白表達(dá)比較Tab.4 Comparison of Th1/Th2/Th17 related cytokine proteins expressions in prostatic tissues of BPH

3 討論

免疫學(xué)認(rèn)為，男性生殖系統(tǒng)是免疫優(yōu)勢(shì)系統(tǒng)，免疫性炎癥在BPH發(fā)病中的作用近年備受關(guān)注[6]。研究發(fā)現(xiàn)，BPH患者的病灶組織中存在組織學(xué)炎癥，主要為T(mén)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，推測(cè)自身免疫紊亂導(dǎo)致前列腺在內(nèi)的生殖系統(tǒng)損傷可能是BPH及PI的發(fā)病基礎(chǔ)，而感染、創(chuàng)傷等屬于促進(jìn)因素[7]。本研究中，75.83% BPH患者伴有PI，55.83%為中、重度炎癥，且伴有PI的BPH患者具有更長(zhǎng)的病程、更大的前列腺體積、更高的t-PSA水平和IPSS評(píng)分，證實(shí)BPH患者普遍具有局部炎癥，但文獻(xiàn)報(bào)道僅5%～10% PI患者具有細(xì)菌感染證據(jù)，大部分患者的病因及病機(jī)尚未明確，同時(shí)，局部組織中免疫性炎癥是否會(huì)引起B(yǎng)PH患者組織、外周血中免疫細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子異常表達(dá)尚未明確[8]。

Th細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞的主要亞群之一，按其分泌細(xì)胞因子的功能差異可分為T(mén)h1、Th2與Th17 3個(gè)亞群，其中，Th1/Th2平衡主要影響機(jī)體細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡，Th17細(xì)胞則具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用，可正向調(diào)節(jié)NK細(xì)胞與Th1細(xì)胞功能而介導(dǎo)免疫反應(yīng)，又可介導(dǎo)免疫逃逸、耐受與抑制等[9]。本研究中，BPH患者的Th1細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組，且BPH-PI組明顯高于單純BPH組(P<0.05)，Th2細(xì)胞略有升高差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但BPH患者的Th1/Th2比值明顯升高，且以BPH-PI組升高更為顯著。證實(shí)BPH患者中存在外周血Th1/Th2細(xì)胞失衡，且Th1占據(jù)相對(duì)優(yōu)勢(shì)地位。Th17細(xì)胞是一種近期發(fā)現(xiàn)的CD4+T淋巴細(xì)胞，其作用機(jī)制與Th1/Th2具有較大差異，主要通過(guò)分泌IL-17等細(xì)胞因子參與機(jī)體自身免疫或炎癥反應(yīng)[10,11]。本研究中，BPH患者外周血中Th17細(xì)胞比例較對(duì)照組明顯升高，且BPH-PI患者升高更為顯著(P<0.05)，提示Th17細(xì)胞過(guò)表達(dá)可能參與BPH的發(fā)生發(fā)展。

細(xì)胞因子是由免疫、炎癥細(xì)胞分泌的主要調(diào)節(jié)因子，促炎細(xì)胞因子是誘發(fā)免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因素，同時(shí)也可通過(guò)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答抗感染、腫瘤等。在炎癥狀態(tài)下，大量炎癥細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子釋放可上調(diào)凋亡抑制因子(如bcl-2)表達(dá)，導(dǎo)致前列腺細(xì)胞大量增殖而發(fā)病[12]。因此，多種炎癥因子在機(jī)體免疫-炎癥系統(tǒng)中具有持續(xù)性、協(xié)調(diào)性、多效應(yīng)性作用，多參數(shù)檢測(cè)具有重要意義。因傳統(tǒng)ELISA法一次性?xún)H可完成1種細(xì)胞因子檢測(cè)，故本研究采用CBA技術(shù)進(jìn)行一次性多參數(shù)檢測(cè)。Th1細(xì)胞分泌的IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-2均屬于炎癥調(diào)節(jié)因子，TNF-α、IFN-γ屬于促炎細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)多種炎癥因子釋放，導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并可誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞黏附、趨化與浸潤(rùn)，還可抑制組織金屬蛋白酶(matrix metalloprote inase,MMP)抑制因子合成而引發(fā)MMPs過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致局部組織中MMPs沉積而導(dǎo)致強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)[13]。Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-6、IL-10，其中，IL-4和IL-10可通過(guò)對(duì)IL-1、TNF-α等的抑制效應(yīng)而發(fā)揮抗炎效應(yīng)，并可降低前列腺組織中靶分子的穩(wěn)定性而加速其降解，從而發(fā)揮清除炎癥的作用[14]。研究顯示，PI患者的外周血及精液中IL-10表達(dá)較健康對(duì)照組明顯升高，且其含量越高患者臨床癥狀越嚴(yán)重，原因可能為IL-10在T淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞中的表達(dá)與其他細(xì)胞因子表達(dá)相對(duì)滯后，在炎癥狀態(tài)下為抑制炎癥反應(yīng)反饋性升高，證其對(duì)促炎細(xì)胞因子具有持續(xù)、反饋性抑制作用[15]。IL-6屬于多功能細(xì)胞因子，在正常生理狀態(tài)下可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答并促進(jìn)細(xì)胞增殖分化，在病理狀態(tài)下可誘導(dǎo)IL-2等細(xì)胞因子生成，可促進(jìn)造血及細(xì)胞的增殖分化，激活免疫反應(yīng)及NK、T、B細(xì)胞等，募集T細(xì)胞而擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[16]。本研究中，BPH組患者血清IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10水平較對(duì)照組明顯升高，且BPH-PI組明顯高于單純BPH組(P<0.05)，與李云祥等[17]報(bào)道并不完全一致。而王磊等[18]研究顯示，61.11%的BPH患者伴有PI，且存在明顯的IL-6及TNF-α高表達(dá)，與本研究結(jié)論一致。因此認(rèn)為T(mén)h1/Th2細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子失衡所介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)可能仍參與BPH發(fā)病過(guò)程，但具體機(jī)制有待深入研究。IL-17是由Th17細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子，IL-17A是其主要亞型，可作為前炎癥介質(zhì)而誘導(dǎo)IL-1、TNF-α、IL-6等的釋放而放大炎癥反應(yīng)，已被證實(shí)在自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[19]。本研究中，BPH組患者血清IL-17A水平明顯高于對(duì)照組，且BPH-PI組顯著高于單純BPH組(P<0.05)。提示由IL-17A所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能在BPH的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。局部組織檢測(cè)顯示，BPH-PI患者的前列腺組織中IL-17A、IL-2、TNF-α、INF-γ、IL-4、IL-6、IL-10蛋白表達(dá)均高于單純BPH患者(P<0.05)，與蔣玉清等[20]報(bào)道結(jié)論相符。證實(shí)Th1/Th2/Th17相關(guān)細(xì)胞因子過(guò)表達(dá)可能參與BPH發(fā)生發(fā)展，且以IL-17A蛋白表達(dá)升高最為顯著，推測(cè)局部Th17細(xì)胞浸潤(rùn)及其釋放的IL-17A所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)可能在BPH的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，Th1/Th2/Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)失衡在BPH發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，主要表現(xiàn)為T(mén)h2向Th1轉(zhuǎn)化和Th17過(guò)度活躍，且與多種細(xì)胞因子異常表達(dá)有關(guān)，在BPH-PI其患者中表現(xiàn)更為明顯。Th1/Th2/Th17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)失衡可能通過(guò)局部或全身慢性炎癥在BPH發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮特異性作用，多參數(shù)聯(lián)合檢測(cè)細(xì)胞因子水平對(duì)評(píng)價(jià)疾病免疫微環(huán)境或監(jiān)測(cè)疾病的發(fā)生、發(fā)展及臨床治療具有重要參考價(jià)值。PI是BPH發(fā)生發(fā)展的結(jié)果或誘因，或兩者互為誘因，仍需繼續(xù)探討，但可以肯定的是伴發(fā)PI可加重BPH病情，臨床診療中應(yīng)引起高度重視。