毛 英，劉 黎，張 匠，楊 帆，王曉華

非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer， NSCLC)為肺癌主要類型，占全部肺癌的80%以上，通常采取手術(shù)治療、放射治療及聯(lián)合含鉑化學(xué)治療方案治療[1-5]。目前研究發(fā)現(xiàn)NSCLC的發(fā)生和進(jìn)展與腫瘤免疫微環(huán)境有關(guān)，腫瘤細(xì)胞與免疫微環(huán)境相互影響，產(chǎn)生各種免疫抑制因子，損傷患者免疫功能，為腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移提供基礎(chǔ)[6-9]。輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)主要分為Th1、Th2和Th17等多個(gè)亞群，Th1和Th2分別主導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫，當(dāng)Th1/Th2平衡失調(diào)意味著免疫微環(huán)境失衡，腫瘤易發(fā)生免疫逃逸，造成惡性腫瘤不良轉(zhuǎn)歸[10]。Th17是近年來新發(fā)現(xiàn)的T淋巴細(xì)胞亞群，主要分泌炎性因子白細(xì)胞介素(IL)-17，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，可能與惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展相關(guān)[11]。既往有關(guān)肺癌患者Th1、Th2和Th17的研究多為測定外周血水平，較少關(guān)注癌組織免疫微環(huán)境，而且NSCLC術(shù)后化學(xué)治療對Th1、Th2和Th17表達(dá)的影響報(bào)道較少。本研究探討NSCLC患者癌組織免疫微環(huán)境中Th1、Th2和Th17的表達(dá)水平及意義，以期為NSCLC臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月—2019年12月遂寧市中心醫(yī)院收治的符合納入及排除標(biāo)準(zhǔn)的NSCLC 64例，男38例，女26例；年齡42～79(60.33±9.47)歲。TNM分期Ⅰ期15例，Ⅱa期20例，Ⅱb期16例，Ⅲa期13例；病理類型：鱗癌29例，腺癌35例；腫瘤部位：右上肺15例，右中肺6例，右下肺11例，左上肺17例，左下肺15例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)同意執(zhí)行，所有患者和(或)其家屬均簽署相關(guān)知情同意書。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均符合NSCLC病理診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]；②TNM分期Ⅰ～Ⅲa期，均行肺癌根治術(shù)，獲取肺癌組織標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)檢查；③肺部病灶皆為原發(fā)性；④均于遂寧市中心醫(yī)院首次診斷，既往未接受任何化學(xué)治療、放射治療、靶向治療和免疫治療等。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有其他惡性腫瘤史者；②肺癌晚期遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，無法接受肺癌根治術(shù)者；③肺癌根治術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)者；④放棄治療或轉(zhuǎn)院者；⑤合并類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病者。

1.3試劑與儀器 主要試劑：人Th1、Th2、Th17亞群檢測試劑盒(貝克曼庫爾特公司生產(chǎn))，胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(賽默飛世爾科技公司生產(chǎn))，IL-4、IL-17和干擾素-γ(IFN-γ)檢測試劑盒(美國RayBiotech公司生產(chǎn))，藻紅蛋白類熒光素標(biāo)記鏈霉親和素工作液(賽默飛世爾科技公司生產(chǎn))。主要儀器：貝克曼CytoFLEX流式細(xì)胞儀(貝克曼庫爾特公司生產(chǎn))，邁瑞MR-96A酶標(biāo)儀(邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司生產(chǎn))。

1.4研究方法 收集所有患者肺癌根治術(shù)后獲得的病理組織新鮮樣本，分別取病灶中心區(qū)域癌組織、遠(yuǎn)離癌組織5 cm以上癌旁正常組織。將所取標(biāo)本切割成直徑2 mm的組織塊，做好標(biāo)記，取用均遵循“先正常-后腫瘤”的順序，避免組織污染。將上述新鮮組織標(biāo)本，剪碎后用研缽研碎，加入EP管中，再加入胰蛋白酶-EDTA消化液，充分消化后經(jīng)過濾網(wǎng)過濾，去除組織大碎片，取濾液1500 r/min加速離心后，棄上層清液即為組織浸潤單細(xì)胞懸液。將癌組織、癌旁正常組織的單細(xì)胞懸液置于培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)5 h，然后加入流式細(xì)胞表面熒光抗體CD3、CD4，4℃反應(yīng)30 min后，再加入IL-4、IL-17和IFN-γ等細(xì)胞抗體，4℃反應(yīng)30 min后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)雙抗體夾心法分別檢測細(xì)胞因子IL-4、IL-17和IFN-γ水平。取人Th1、Th2、Th17亞群檢測試劑盒，依據(jù)流式熒光法，加入45 μl 捕獲微球混懸液入孔板，分別加入標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋樣本45 μl，室溫避光孵育1 h，洗滌后加入25 μl生物素耦聯(lián)的檢測抗體，室溫避光孵育30 min，洗滌后加入25 μl 藻紅蛋白類熒光素標(biāo)記鏈霉親和素工作液，洗滌后加入150 μl 洗液，重新懸浮微球，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。用FCAP Array軟件繪制流式圖譜，分析Th1、Th2和Th17表達(dá)水平[13]。治療前和化學(xué)治療1～4療程末分別抽取患者肘靜脈血5 ml(乙二胺四乙酸二鈉抗凝管采集)，1500 r/min加速離心后，棄上層清液即為單細(xì)胞懸液。外周血Th1、Th2和Th17表達(dá)水平采用流式熒光法檢測，檢測方法及試劑盒同上。

1.5觀察指標(biāo) 比較治療前癌組織與癌旁正常組織細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17水平和Th1、Th2、Th17表達(dá)水平，分析NSCLC臨床特征與治療前癌組織Th1、Th2、Th17表達(dá)水平的關(guān)系(根據(jù)中位數(shù)分為高表達(dá)組與低表達(dá)組各32例)。所有患者在手術(shù)后接受4個(gè)療程的含鉑化學(xué)治療方案化學(xué)治療，比較治療前和化學(xué)治療1～4療程末的外周血Th1、Th2、Th17表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1治療前癌組織與癌旁正常組織細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17水平和Th1、Th2、Th17表達(dá)水平 治療前，NSCLC患者癌組織IFN-γ水平低于癌旁正常組織，IL-4和IL-17水平高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。NSCLC患者癌組織Th1表達(dá)低于癌旁正常組織，Th2和Th17表達(dá)高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 治療前非小細(xì)胞肺癌患者癌組織與癌旁正常組織細(xì)胞因子水平及Th1、Th2、Th17表達(dá)水平比較

2.2NSCLC臨床特征與治療前癌組織Th1、Th2、Th17表達(dá)水平關(guān)系 不同性別和年齡NSCLC患者治療前癌組織Th1、Th2、Th17高表達(dá)和低表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療前TNM分期Ⅲ期NSCLC患者癌組織Th1低表達(dá)、Th2和Th17高表達(dá)比例明顯高于TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期NSCLC患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。治療前鱗癌與腺癌NSCLC患者癌組織Th1高表達(dá)和低表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但腺癌NSCLC患者癌組織Th2和Th17高表達(dá)比例明顯高于鱗癌NSCLC患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

2.3治療前和化學(xué)治療1～4療程末NSCLC患者外周血Th1、Th2和Th17表達(dá)水平 治療前后NSCLC患者外周血Th1、Th2和Th17表達(dá)水平總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。隨著化學(xué)治療療程的增加，NSCLC患者外周血Th1表達(dá)水平逐漸升高，Th2與Th17表達(dá)水平逐漸下降，與治療前比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Th1：t=2.645、P=0.009，t=4.356、P<0.001，t=5.245、P<0.001，t=6.362、P<0.001；Th2：t=2.066、P=0.041，t=6.017、P<0.001，t=6.812、P<0.001，t=7.865、P<0.001；Th17：t=2.057、P=0.042，t=3.681、P<0.001，t=6.038、P<0.001，t=7.482、P<0.001)。見表3。

3 討論

免疫分子生物學(xué)研究顯示，NSCLC的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移與機(jī)體免疫狀態(tài)相互影響，當(dāng)機(jī)體免疫功能下降時(shí)易促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，當(dāng)腫瘤進(jìn)展時(shí)機(jī)體免疫功能又會受到抑制[14]。遲佳琦等[15]研究表明，腫瘤免疫微環(huán)境與預(yù)后密切相關(guān)，微環(huán)境對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程具有促進(jìn)和抑制兩種作用，故了解腫瘤免疫微環(huán)境的特征對判斷患者腫瘤發(fā)生與發(fā)展有重要意義。T淋巴細(xì)胞是免疫微環(huán)境中重要的組成成分，其中Th根據(jù)功能與表型又可以分為Th1、Th2和Th17等多個(gè)亞群。Th1主要介導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫，發(fā)揮腫瘤免疫監(jiān)視作用，主要分泌IFN-γ細(xì)胞因子；IFN-γ細(xì)胞因子可以促進(jìn)Th1的成熟、增殖和分化，并且抑制Th2。一項(xiàng)動物實(shí)驗(yàn)研究顯示，在小鼠模型中Th1表達(dá)下調(diào)，血清IFN-γ細(xì)胞因子水平下降[16]。Th2主要介導(dǎo)機(jī)體體液免疫，分泌IL-4、IL-6和IL-10等細(xì)胞因子，主要作用是限制Th1的保護(hù)性免疫。有研究顯示，在惡性腫瘤患者中，免疫應(yīng)答通常向Th2偏倚，Th2表達(dá)上調(diào)，表示將保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受機(jī)體免疫系統(tǒng)排斥，形成一種免疫豁免微環(huán)境；當(dāng)Th1表達(dá)下調(diào)，Th2表達(dá)上調(diào)，即為Th1/Th2平衡偏移，免疫微環(huán)境失衡，機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)，腫瘤細(xì)胞脫離免疫監(jiān)視發(fā)生免疫逃逸，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長與轉(zhuǎn)移[17-18]。本研究結(jié)果顯示，治療前NSCLC患者癌組織IFN-γ水平低于癌旁正常組織，IL-4水平高于癌旁正常組織；NSCLC患者癌組織Th1表達(dá)水平低于癌旁正常組織，Th2表達(dá)水平高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明在癌組織中Th1免疫應(yīng)答被削弱，T淋巴細(xì)胞亞群向Th2偏移，并且Th1分泌的IFN-γ水平下降、Th2分泌的IL-4水平上升，細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫失衡，驗(yàn)證了上述觀點(diǎn)。此外，本研究結(jié)果還顯示，隨著化學(xué)治療療程的增加，NSCLC患者外周血Th1表達(dá)水平逐漸增加，Th2與Th17表達(dá)水平逐漸下降，與治療前比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明NSCLC患者化學(xué)治療后免疫微環(huán)境中Th1/Th2逐漸趨向于平衡狀態(tài)，化學(xué)治療可以使患者T細(xì)胞免疫功能得到改善，這與洪丹[19]的研究報(bào)道相符，說明檢測患者Th1、Th2表達(dá)情況對免疫功能評估有重要意義。

表2 非小細(xì)胞肺癌臨床特征與治療前癌組織Th1、Th2、Th17表達(dá)水平關(guān)系[例(%)]

Th17是近年來新發(fā)現(xiàn)的Th亞群，主要分泌炎性因子IL-17。有研究顯示，在正常組織中Th17處于較低水平，而在癌組織中Th17明顯增多，較低水平的Th17是維持正常免疫微環(huán)境的基礎(chǔ)[20]。本研究結(jié)果顯示，NSCLC患者癌組織Th17表達(dá)水平高于癌旁正常組織，IL-17水平高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。陳鋼等[21]研究也發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者外周血中Th17和IL-17表達(dá)水平明顯高于健康人群。目前對于Th17影響腫瘤生長的作用機(jī)制尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，Th17分泌的IL-17細(xì)胞因子可促進(jìn)腫瘤血管生成，這為腫瘤細(xì)胞的生長與轉(zhuǎn)移提供基礎(chǔ)[22]。還有研究認(rèn)為，Th17介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，使腫瘤組織發(fā)生炎性浸潤和壞死，打破了機(jī)體平衡的免疫微環(huán)境[23-24]。本研究結(jié)果顯示，隨著化學(xué)治療療程的增加，NSCLC患者外周血Th17表達(dá)水平逐漸下降，與治療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與上述研究報(bào)道基本一致。

表3 治療前和化學(xué)治療1～4療程末非小細(xì)胞肺癌患者外周血Th1、Th2和Th17表達(dá)水平比較

本研究還分析了NSCLC臨床特征與治療前癌組織Th1、Th2、Th17表達(dá)水平關(guān)系，結(jié)果顯示治療前TNM分期Ⅲ期NSCLC患者癌組織Th1低表達(dá)、Th2和Th17高表達(dá)比例明顯高于TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期NSCLC患者；治療前腺癌NSCLC患者癌組織Th2和Th17高表達(dá)比例明顯高于鱗癌NSCLC患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。陳鋼等[21]研究也發(fā)現(xiàn)，Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者的Th17水平高于Ⅰ～Ⅱ期患者。TNM分期一般可以代表患者腫瘤進(jìn)展情況，腫瘤進(jìn)展越快癌組織Th1表達(dá)越低、Th2和Th17表達(dá)越高，驗(yàn)證了NSCLC患者癌組織存在Th1、Th2和Th17免疫微環(huán)境平衡失調(diào)，這可能是患者免疫功能下降的原因。李文軍等[25]的研究也發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者伴隨Th1、Th2及其分泌的細(xì)胞因子水平異常，且與NSCLC患者T分期、預(yù)后有關(guān)。

綜上所述，NSCLC患者癌組織存在Th1、Th2和Th17免疫微環(huán)境平衡失調(diào)，檢測Th1、Th2和Th17表達(dá)情況對免疫功能評估有重要意義，Th1、Th2和Th17或許可以作為NSCLC監(jiān)測和預(yù)后評估的指標(biāo)，也為NSCLC靶向免疫治療提供了新的方向。