張學平，金鈺，邵宏偉，王丹，王靜

類風濕性關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為主的慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，臨床主要表現(xiàn)為手、足小關(guān)節(jié)等處多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，可導致患者關(guān)節(jié)疼痛、損壞甚至功能喪失，嚴重影響患者生活質(zhì)量[1]。目前臨床多采用影像學結(jié)合相關(guān)標志物對類風濕性關(guān)節(jié)炎進行診斷和評估，但診斷效能仍較低[2]。 研究表明，長鏈非編碼RNA母系表達基因3(LncRNA MEG3)在骨性關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織中表達量明顯降低，與軟骨退化程度密切相關(guān)[3]。Li等[4]研究發(fā)現(xiàn)，強直性脊柱炎患者LncRNA MEG3表達下調(diào)，可靶向調(diào)控炎性因子表達發(fā)揮抗炎作用，可作為治療靶點。微小RNA-141(miR-141)在骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型脊髓背角細胞中表達上調(diào)，可促進關(guān)節(jié)疼痛的發(fā)生[5]。LncRNA MEG3與miR-141在結(jié)直腸癌化療耐藥進展中存在調(diào)控關(guān)系[6]，但類風濕性關(guān)節(jié)炎中二者作用關(guān)系尚不清楚。現(xiàn)分析類風濕性關(guān)節(jié)炎患者血清LncRNA MEG3、miR-141表達水平及其與疾病發(fā)生發(fā)展、預后的關(guān)系，并對類風濕性關(guān)節(jié)炎的診斷和預后進行評估，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年2月—2018年1月鞍鋼集團公司總醫(yī)院風濕免疫科診治類風濕性關(guān)節(jié)炎患者191例(病例組)，其中男88例，女103例，年齡27～63(48.13±9.54)歲；病程0.5～4.6(2.37±0.71)年。以病情變化分為活動期98例(活動亞組)，緩解期93例(緩解亞組)?；顒觼喗M男42例，女56例，年齡27～63(47.72±9.15)歲；病程0.5～4.5(2.31±0.64)年；以膝、踝等負重關(guān)節(jié)腫脹疼痛為首發(fā)癥狀53例，以手、足等外周小關(guān)節(jié)腫脹疼痛為首發(fā)癥狀45例。緩解亞組男46例，女47例，年齡28～63(48.64±9.79)歲；病程0.5～4.6(2.39±0.73)年；以膝、踝等負重關(guān)節(jié)腫脹疼痛為首發(fā)癥狀47例，以手、足等外周小關(guān)節(jié)腫脹疼痛為首發(fā)癥狀46例。另選取同期在醫(yī)院體檢的健康者90例為健康對照組，其中男39例，女51例，年齡27～62(48.06±9.13)歲。3組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準同意，所有受試者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①根據(jù)美國風濕病學會診斷標準[7]，確診為類風濕性關(guān)節(jié)炎；②臨床資料完整；③依從性較好。(2)排除標準：①合并其他自身免疫性疾病；②合并高血壓、糖尿病及感染性疾病；③患有精神疾病及肝、腎功能嚴重不足者；④有既往治療史患者。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血清LncRNA MEG3、miR-141表達水平檢測：患者于入院翌日晨、健康者于體檢時分別采集空腹外周靜脈血5 ml，離心分離血清，于-80℃保存?zhèn)溆?。上述血清采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測LncRNA MEG3、miR-141表達水平。血清樣本在冰上完全解凍后使用RNA提取試劑盒(德國Roche公司生產(chǎn))提取總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(加拿大ABM公司生產(chǎn))對RNA進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。再使用qRT-PCR試劑盒(德國Roche公司生產(chǎn))進行qRT-PCR試驗，20 μl反應(yīng)體系如下：cDNA 2 μl，Mix 10 μl，ROX 0.4 μl，上、下游引物各2 μl，DEPC水3.6 μl。將反應(yīng)體系按如下步驟進行反應(yīng)：95℃ 7 min，1個循環(huán)；95℃ 15 s、62℃ 32 s、73℃ 15 s，40個循環(huán)，1個樣品重復3次。LncRNA MEG3以GAPDH為內(nèi)參基因，miR-141以U6為內(nèi)參基因，采用2-△△CT法計算血清LncRNA MEG3、miR-141相對表達水平。試驗所用引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，見表1。

1.3.2 血清IL-6、TNF-α、MMP-3表達水平檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測血清白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3) 表達水平，嚴格按照試劑盒(美國Abcam公司生產(chǎn))說明書進行操作。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1 各組血清LncRNA MEG3、miR-141表達水平比較 血清LncRNA MEG3表達水平比較，活動亞組<緩解亞組<健康對照組，而miR-141表達水平比較，活動亞組>緩解亞組>健康對照組(P均<0.05)，見表2。

表2 各組受試者血清LncRNA MEG3、miR-141表達水平比較

2.2 各組血清IL-6、TNF-α、MMP-3表達水平比較 健康對照組、緩解亞組、活動亞組血清IL-6、TNF-α、MMP-3表達水平均依次升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)，見表3。

表3 各組受試者血清IL-6、TNF-α、MMP-3表達水平比較

2.3 血清LncRNA MEG3、miR-141表達與炎性因子相關(guān)性分析 血清LncRNA MEG3與血清miR-141表達水平呈負相關(guān)(r=-0.432，P=0.000)。血清LncRNA MEG3與血清IL-6、TNF-α、MMP-3水平均呈負相關(guān)(P<0.01)，血清miR-141與血清IL-6、TNF-α、MMP-3水平均呈正相關(guān)(P<0.01)，見表4。

表4 血清LncRNA MEG3、miR-141表達與炎性因子相關(guān)性

2.4 血清LncRNA MEG3、miR-141診斷類風濕性關(guān)節(jié)炎效能 利用ROC綜合分析血清LncRNA MEG3、miR-141水平診斷類風濕性關(guān)節(jié)炎的價值。血清LncRNA MEG3診斷類風濕性關(guān)節(jié)炎的AUC為0.801(95%CI0.744～0.858)，截斷值為0.80，其診斷敏感度為78.00%，特異度為72.20%,約登指數(shù)為0.502。血清miR-141診斷類風濕性關(guān)節(jié)炎的AUC為0.822(95%CI0.768～0.875)，截斷值為1.84，其診斷敏感度為77.50%，特異度為83.30%,約登指數(shù)為0.608。二者聯(lián)合檢測診斷類風濕性關(guān)節(jié)炎的AUC為0.867(95%CI0.813～ 0.921)，敏感度為89.60%，特異度為79.90%,約登指數(shù)為0.695，見圖1。

圖1 血清LncRNA MEG3、miR-141診斷

2.5 影響類風濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的危險因素分析 以是否發(fā)生類風濕關(guān)節(jié)炎為因變量，以血清LncRNA MEG3、miR-141、IL-6、TNF-α、MMP-3表達水平為自變量建立Logistic回歸模型。高miR-141、高IL-6、高TNF-α、高MMP-3水平是影響類風濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的危險因素，而高LncRNA MEG3水平是其發(fā)生的保護因素(P<0.01)，見表5。

表5 影響類風濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的危險因素分析

3 討 論

類風濕性關(guān)節(jié)炎患者多表現(xiàn)為手、足、腕、膝關(guān)節(jié)等部位受累，出現(xiàn)腫脹、畸形、脫位等，若累及其他器官可出現(xiàn)心肌炎、冠狀動脈炎、皮膚潰瘍、間質(zhì)性腎炎等，嚴重影響患者身心健康[1]。目前類風濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制尚不明確，但多數(shù)研究認為，T淋巴細胞及巨噬細胞釋放大量炎性細胞因子引起骨關(guān)節(jié)破壞是類風濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的主要機制[8]。

LncRNA是一類長度大于200個核苷酸的轉(zhuǎn)錄RNA，可調(diào)控機體蛋白質(zhì)合成，并在疾病進展中發(fā)揮重要作用。Chen等[9]研究發(fā)現(xiàn)，骨關(guān)節(jié)炎中LncRNA MEG3表達明顯下調(diào)，可調(diào)控軟骨細胞增殖、凋亡、細胞外基質(zhì)降解和炎性反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，類風濕性關(guān)節(jié)炎患者血清LncRNA MEG3表達水平明顯降低，且活動亞組低于緩解亞組，與LncRNA MEG3在骨關(guān)節(jié)炎進展中表達趨勢一致，提示LncRNA MEG3水平降低可能通過預示炎性反應(yīng)水平上調(diào)和軟骨細胞活性增強，反映類風濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展進程。LncRNA MEG3可減少炎性細胞因子產(chǎn)生，緩解肺部細菌感染小鼠促炎反應(yīng)，在膿毒癥抗菌免疫進展中有重要作用[10]。Tong等[11]研究報道，糖尿病視網(wǎng)膜病變中高糖可通過抑制LncRNA MEG3表達，促進TNF-α、IL-6等炎性因子分泌，影響疾病加重。有研究報道，過表達LncRNA MEG3可通過減少TNF-α、IL-6緩解骨關(guān)節(jié)炎兔模型的疼痛和炎性反應(yīng)[12-13]。MMP-3是預測類風濕性關(guān)節(jié)炎患病嚴重程度及預后的重要生物標志物[14-16]。有研究證實，LncRNA MEG3可通過下調(diào)MMP-3來抑制胃癌細胞遷移能力[17]。本研究結(jié)果顯示，類風濕性關(guān)節(jié)炎患者血清LncRNA MEG3與IL-6、TNF-α、MMP-3表達水平均呈負相關(guān)，提示LncRNA MEG3水平降低可能通過升高IL-6、TNF-α、MMP-3等炎性細胞因子水平，促進炎性反應(yīng)，進而影響類風濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生和病情加重。

miRNA長度約20個核苷酸，能夠在各種組織和細胞中穩(wěn)定存在，可參與機體生理反應(yīng)和疾病進展。有研究表明，非酒精性脂肪肝炎進展中miR-141高表達，下調(diào)其表達可減少肝脂肪變性和炎性反應(yīng)[18]。股骨頭壞死小鼠模型骨組織中miR-141高表達，抑制其表達可改善成骨細胞活性，抑制股骨頭壞死進展[19]。本研究結(jié)果顯示，類風濕性關(guān)節(jié)炎患者血清miR-141表達水平明顯升高，且活動亞組miR-141表達水平明顯較高，提示miR-141表達上調(diào)可能通過影響炎性反應(yīng)和成骨細胞代謝，促進骨關(guān)節(jié)破壞及類風濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展。miR-141在子癇前期患者胎盤組織中高表達，與病理妊娠的免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)[20]。Rajkumar等[21]研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中后小鼠腦組織中miR-141表達上調(diào)，可靶向調(diào)控IL-6、TNF-α促進炎性反應(yīng)增加，導致神經(jīng)功能缺損加重和梗死面積增加。骨關(guān)節(jié)炎中TNF-α可誘導MMP-3表達，促進炎性反應(yīng)和疾病進展[22]。本研究結(jié)果顯示，類風濕性關(guān)節(jié)炎患者血清miR-141與IL-6、TNF-α、MMP-3表達水平均呈正相關(guān)，提示miR-141可能通過影響炎性細胞因子表達，促進骨關(guān)節(jié)損傷發(fā)生，導致類風濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展。

研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA MEG3可通過靶向miR-141促進結(jié)直腸癌細胞的化療敏感性[6]。Li等[23]研究表明，類風濕性關(guān)節(jié)炎患者滑膜細胞中過表達LncRNA MEG3可下調(diào)miR-141水平，促進細胞增殖并抑制炎性反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，類風濕性關(guān)節(jié)炎患者血清LncRNA MEG3與miR-141表達水平呈負相關(guān)，提示LncRNA MEG3與miR-141間可能存在相互作用，共同影響類風濕性關(guān)節(jié)炎進展。本研究還發(fā)現(xiàn)，高miR-141水平是影響類風濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的危險因素，而高LncRNA MEG3水平則是其保護因素，且血清LncRNA MEG3、miR-141水平聯(lián)合檢測診斷類風濕性關(guān)節(jié)炎的曲線下面積、敏感度及特異度最高，提示血清LncRNA MEG3水平降低、miR-141水平升高可能作為類風濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的預測指標，臨床可通過二者聯(lián)合診斷，評估類風濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生。

綜上所述，類風濕性關(guān)節(jié)炎患者血清LncRNA MEG3低表達、miR-141高表達，二者間可能存在一定相互作用，通過調(diào)控炎性反應(yīng)，參與類風濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展進程。但二者間具體調(diào)控機制尚需進一步進行試驗探究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

張學平：設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；金鈺：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核；邵宏偉：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；王丹：進行統(tǒng)計學分析；王靜：課題設(shè)計，論文撰寫