國偉，楊軍，任法新，梁平平

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemic-reperfusion injury，MIRI)是心肌長時間缺血重新恢復血液灌注后出現(xiàn)的一種損傷，其特點是更為明顯和嚴重的損害或功能障礙，包括心肌收縮功能障礙、冠狀動脈血流和血管反應性的變化。目前關于心肌缺血再灌注損傷的發(fā)病機制尚不完全清楚，也無預防及治療的有效藥物[1-2]。因此，探討MIRI的深層發(fā)病機制和臨床研發(fā)靶向治療藥物具有重大意義。近年來，SHH(sonic hodgehog)信號通路對心血管系統(tǒng)疾病的影響越來越受到人們的重視，其為探索保護心肌細胞功能提供了新的作用靶點[3]。研究還發(fā)現(xiàn)，SHH信號通路參與了多種缺血動物模型中的血管再生，包括腦、角膜、骨骼肌缺血及肢體缺血模型等[4-5]。然而，SHH信號通路在心肌缺血再灌注損傷中的研究很少?；诖?，現(xiàn)探討SHH信號通路激活對微血管內皮細胞(CMECs)缺血再灌注損傷促進血管再生的潛在作用，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗動物： SD大鼠(雄性)，月齡1月，體質量100～150 g，購于山東大學實驗動物中心，動物許可證號SCXK(魯)2016-0016，標準飼養(yǎng)，日常光照，自然飲水。 (2)試劑：10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液購于美國Invitrogen公司，無L-谷氨酰胺DMEM培養(yǎng)基，胰蛋白酶，Cyclopamin購于美國Sigma-Alidrich公司，重組人SHH蛋白購于美國Cambridge公司，ELISA試劑盒購于武漢Antigene公司，Trizol試劑盒購于美國Invitrogen公司，SMA 400 UV0VIS購于上海Merinton公司，BCA蛋白檢測試劑盒購于美國Rochford公司，TM型cDNA合成試劑盒購于美國Bio-Rad公司。(3)儀器：全自動酶標儀(日本Olympus公司，型號AU400)， Bio-Image(Bio-Rad)圖像分析軟件。

1.2 實驗方法 2016年7月—2017年2月于青島大學附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院進行實驗。

1.2.1 大鼠原代心臟微血管內皮細胞培養(yǎng)：參照參考文獻[6]，CMECs來源于SD雄性大鼠心臟組織，大鼠腹腔內注射0.1%戊巴比妥鈉(2 ml/100 g)麻醉，無菌條件下迅速取出心臟，并用PBS液洗凈3遍，去除大血管、瓣膜及結締組織，剪去右心室和左、右心房，將左心室浸泡在75%酒精中10 s，然后將心肌組織剪碎成塊，1 mm3大小，并加入0.025%胰酶水浴(溫度37℃)中消化10 min，再用100 mm尼龍網濾除未消化左心室心肌組織，繼而用含10% FBS的DMEM 培養(yǎng)液將沉淀反復混勻，然后用1 ml的吸管軟柔吹打3次。將所得左心室細胞懸液接種在培養(yǎng)瓶中，于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，6 h后倒出培養(yǎng)液去掉未貼壁的平滑肌細胞、成纖維細胞等，再加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，孵育48 ～72 h后更換1次培養(yǎng)液，獲取原代細胞。

1.2.2 實驗分組及干預措施：選取培養(yǎng)7 d的CMECs建立體外氧糖剝奪/復氧(OGD/R)損傷模型用以模擬心肌缺血再灌注損傷，參照文獻[7]具體操作如下：CMECs用PBS緩沖液反復沖洗，然后在無血清培養(yǎng)基的OGD條件下培養(yǎng)，并置于無糖或無L-谷氨酰胺DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2氧糖剝奪條件下培育CMECs 1 h；再從缺氧條件下取出CMECs培養(yǎng)板,用PBS緩沖液洗3 次，然后在正常氧條件下孵育CMECs 1.5 h。

實驗分組： (1)正常對照組(Control，C組)：CMECs不給予任何外部因素處理；(2)C+SHH組：CMECs在正常氧條件下孵育1 h后，加入人重組SHH蛋白3 μg/ml正常孵育1.5 h；(3)C+CYC(環(huán)杷明，Cyclopamine， CYC)組：CMECs在正常氧條件下孵育1 h后，加入CYC(SHH信號通路抑制劑)20 μmol/L正常孵育1.5 h； (4)OGD組：CMECs給予OGD/R，即缺血1 h，再灌注1.5 h；(5) OGD+SHH組：CMECs缺血1 h后，加入含人重組SHH蛋白3 μg/ml的再灌液再灌注1.5 h；(6)OGD+CYC組：CMECs缺血1 h后，加入含CYC 20 μmol/L的再灌液再灌注1.5 h。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 MTT法測定CMECs細胞活力：CMECs以5×104/ml細胞密度接種在96孔板上，每孔200 μl。細胞以SHH蛋白(3 μg/ml)、CYC(20 μmol/L)處理后各組在相應正常氧或OGD/R條件下孵育48 h,然后以12 000 r/min離心去除上清液。每個孔再加入MTT 20 μl并培養(yǎng)4 h,繼而每個孔加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μl震蕩混勻10 min；使每個孔的細胞結晶物得到充分溶解后，再用全自動酶標儀在波長為570 nm處測定各個孔的吸光度值(OD值)。

1.3.2 ELISA法測定血清血管新生因子VEGF、FGF和Ang-1水平：將50 μg/ml的VEGF、 FGF和Ang-1抗體涂在預處理的微孔板上，置37℃水浴箱中溫育2 h。4℃孵化過夜后，微孔板用含0.05% Tween-20 (PBST) 的PBS緩沖液反復沖洗3遍，封閉在5%山羊血清PBST中1 h。然后樣本用含10%小牛血清和5%山羊血清的PBST按1∶100稀釋，再用辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG在37℃水浴箱中孵育2 h。最后，用1 mol/L硫酸溶液終止反應，并用酶標儀測定492 nm吸光度值。

1.3.3 RT-PCR法測定血管生長因子VEGF、FGF和Ang-1 mRNA表達水平：各項干預結束后，提取細胞總RNA，參照RT-PCR試劑盒說明書進行逆轉錄反應。遵循SYBR Green熒光染料技術(SYBR Green Master mix; Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)進行實時定量PCR反應，從而獲取各組標本的標準曲線，在每一次聚合酶鏈反應結束時進行擴增產物的標準曲線分析，確認只有一個樣品被擴增和檢測。其中，磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參。計算機自動分析Ct值。Ct值為每個反應管內熒光強度達到系統(tǒng)設定的有目的DNA合成時經歷的循環(huán)數(shù)。mRNA表達的差異采用相對定量法比較, 即以2-△△Ct表示待測標本的相對mRNA水平,其中△Ct =(目的基因Ct值-看家基因平均Ct值)。

1.3.4 Western-blot檢測SHH、SMO、Patched-1、Gli-1和Gli-2蛋白表達：用M-PER哺乳動物蛋白裂解液提取細胞蛋白，在臨用前加入以下試劑: DTT 0.5 mmol/L,PMSF 0.5 mmol/L,aprotinin 10 μg/ml，12 000 r/min離心15 min棄去沉淀，測定蛋白濃度，每組取30 μg進行Western-blot檢測。以GAPDH為內參，采用Bio-Image(Bio-Rad)圖像分析軟件對每個條帶采集信號并分析。目的蛋白相對表達量=目的蛋白IA值/內參蛋白IA值。其中，條帶測定值以積分吸光度值(IA)表示。

2 結 果

2.1 各組CMECs細胞活力比較 與C組 CMECs細胞活力(0.86±0.12，n=10)比較， C+SHH組CMECs細胞活力(1.21±0.45，n=10)顯著增加(t=1.996,P<0.05)，C+CYC組(0.64±0.19，n=10)顯著降低(t=1.988,P<0.05)；與C組細胞活力比較,OGD組細胞活力(0.41±0.07，n=10)顯著減弱(t=1.972,P<0.05)；與OGD組細胞活力比較，OGD+SHH組(0.83±0.10，n=10)顯著增加(t=2.004，P<0.05)，OGD+CYC組(0.23±0.05，n=10)顯著降低(t=2.212,P<0.05)，見圖1。

注：與C組比較，a P<0.05；與 OGD組比較，b P<0.05

2.2 各組血清血管新生因子VEGF、FGF、Ang-1蛋白水平(pg/ml)比較 與C組血清VEGF、FGF和Ang-1水平(71.23±3.57,50.36±2.18,62.48±3.03,n=10)比較，C+SHH組(108.50±6.05,118.95±6.47,125.71±6.92,n=10)顯著增加(t=1.990,2.072,2.001,P<0.05)，C+CYC組(50.06±2.73,32.42±1.95,41.59±2.04,n=10)顯著降低(t=7.435,5.969,3.826,P<0.01);與C組血清VEGF、FGF和Ang-1水平比較,OGD組(35.19±2.01,15.47±0.94,20.86±1.27,n=10)顯著降低(t=10.009,7.763,8.684,P<0.01)；與OGD組血清VEGF、FGF和Ang-1水平比較，OGD+SHH組(69.85±3.26,48.45±2.20,63.24±3.15,n=10)顯著增加(t=12.394,10.871,8.375,P<0.01)，OGD+CYC組(24.83±1.58,8.13±0.51,8.90±0.68,n=10)顯著降低(t=2.128,2.003,2.370,P<0.05)，見圖2。

2.3 各組血管新生因子VEGF、FGF、Ang-1 mRNA表達比較 與C組VEGF、FGF和Ang-1的mRNA表達水平(1.00±0.05,1.00±0.06,1.00±0.04,n=10)比較，C+SHH組(1.52±0.64,1.68±0.53,1.76±0.75,n=10)顯著增加(t=2.043,2.125,1.990,P<0.05)，C+CYC組(0.86±0.51,0.74±0.48,0.82±0.49,n=10)顯著降低(t=3.507,4.427,3.072,P<0.01);與C組VEGF、FGF和Ang-1的mRNA表達水平比較,OGD組(0.43±0.27,0.40±0.23,0.48±0.28,n=10)顯著降低(t=8.462,4.017,3.002，P<0.01)；與OGD組VEGF、FGF和Ang-1的mRNA表達水平比較，OGD+SHH組(1.36±0.58,1.25±0.50,1.28±0.55,n=10)顯著增加(t=5.760,7.396,9.088,P<0.01)，OGD+CYC組(0.31±0.09,0.33±0.07,0.30±0.05,n=10)顯著降低(t=1.973,2.016,1.992,P<0.05)，見圖3、4。

2.4 各組SHH信號通路相關蛋白表達比較 與OGD組SHH、SMO、Patched-1、Gli-1、Gli-2的蛋白表達水平(1.00±0.34,1.00±0.36,1.00±0.39,1.00±0.37,1.00±0.43,n=10)比較,OGD+SHH組SHH信號通路相關蛋白表達水平(2.46±0.42,2.09±0.45,2.24±0.56,1.56±0.39,2.13±0.47,n=10)顯著增加(t=4.517,3.007,3.472,3.726,4.988,P<0.01)；OGD+CYC組(0.59±0.15,0.55±0.17,0.53±0.14,0.72±0.11,0.46±0.09,n=10)顯著降低(t=18.978,19.034,17.152,14.747,16.273,P<0.01)，見圖5、6。

圖4 不同組別CMECs中VEGF、FGF、Ang-1的mRNA表達

圖6 各組SHH、Patched-1、SMO、Gli-1、Gli-2的蛋白表達比較

3 討 論

SHH在人體組織細胞中分布最為廣泛，參與基因轉錄、調節(jié)細胞因子和功能蛋白表達，在調控胚胎生長發(fā)育、血管新生、腫瘤細胞增殖等方面有極其重要的作用[8-10]。在大鼠腦缺血動物模型中，研究發(fā)現(xiàn)腦缺血使SHH信號通路發(fā)生激活，給予該信號通路特異性抑制劑Cyclopamine后，卻進一步加重了腦缺血后神經功能的損傷，同時也加重了腦梗死面積及腦水腫的程度[11]。心肌缺血時，SHH的表達水平增加，促進骨髓來源的內皮祖細胞誘發(fā)血管生成,促進血管內皮細胞生長因子和血管生成素的表達增多[12]。但是SHH信號通路對心肌缺血再灌注損傷的影響及其機制的研究卻鮮有報道。 梁關鳳等[13]研究發(fā)現(xiàn)，激活SHH通路可抑制ATM磷酸化改善缺血缺氧誘導的心肌細胞DNA損傷，促進DNA損傷修復，抑制細胞凋亡。本研究表明，在OGD/R條件下，加入外源性重組人SHH蛋白后，CMECs的細胞活力顯著增加，同時，血清血管新生相關因子VEGF、FGF和Ang-1蛋白水平和mRNA表達也顯著增加；并且SHH信號通路下游信號蛋白SHH、SMO、 Patched-1、Gli-1和Gli-2的蛋白表達水平也顯著增加，但上述指標均可被SHH信號通路的特異性抑制劑Cyclopamine所抑制。因此，本研究初步揭示了SHH信號通路在CMECs缺血再灌注損傷后血管再生中發(fā)揮著重要作用。近年來眾多研究表明，SHH信號通路在各種組織和器官的血管再生過程中發(fā)揮著至關重要的作用，并且發(fā)現(xiàn)可能是通過SHH/SMO/Gli通路、磷酸肌醇3-激酶通路及Coup-TFII通路3種途徑來實現(xiàn)其對血管再生的調控[14]。但到目前為止，對于SHH信號通路在血管再生中的具體作用機制仍不十分清楚。本實驗研究證實，加入外源性重組人SHH蛋白可能通過激活SHH-Patched-SMO-Gli信號通路發(fā)揮促血管再生作用，從而對CMECs缺血再灌注損傷起到保護功能。

注：與C組比較，a P<0.05,b P<0.01；與OGD組比較，c P<0.05,d P<0.01

注：與C組比較，a P<0.05,b P<0.01；與 OGD組比較，c P<0.05,d P<0.01

注：與OGD組比較，a P<0.05,b P<0.01

VEGF是作用于內皮細胞糖基化的有絲分裂原，有多種生物學效應，包括介導血管內皮通透性增加，促進血管新生和抑制細胞凋亡等。Ang-1是促進血管形成與成熟的重要血管新生因子。FGF具有廣泛的有絲分裂和細胞生存活力，并且參與了多種生物學過程，包括細胞生長、腫瘤生長和侵襲。Infante等[15]在角膜和后肢缺血模型中研究SHH激活對血管生成的影響時，發(fā)現(xiàn)加入外源重組人SHH蛋白會使成年小鼠血管和心臟的Patched-1表達增多，并促使多種血管新生因子(如VEGF、Ang-1和Ang-2)表達的上調。Spence等[16]在研究雞胚胎視網膜的血管再生情況時發(fā)現(xiàn)，SHH信號通路激活可以導致FGF表達增多。Omitz等[17]研究發(fā)現(xiàn)，SHH可以通過激活硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(一種細胞外基質蛋白，HSPGs)促使bFGF表達上調，繼而發(fā)揮保護心肌免受缺血損傷的功能。本研究結果發(fā)現(xiàn)，加入外源性重組人SHH蛋白可以激活SHH信號通路，從而進一步上調血管新生因子VEGF、 FGF和Ang-1在CMECs缺血再灌注損傷后的表達，繼而發(fā)揮促進血管新生的重要作用。但是SHH信號通路在CMECs缺血再灌注損傷后如何調控血管新生因子VEGF、FGF和Ang-1的表達，以及其調控血管新生的潛在具體分子生物學機制仍需以后實驗進一步研究。

綜上所述，SHH信號通路激活可以通過增強細胞活力，上調血清血管新生相關因子VEGF、FGF和Ang-1的表達，從而在缺血再灌注損傷CMECs血管再生過程中起重要作用。隨著科學研究的進一步深入，SHH信號通路很有可能成為治療人類心血管系統(tǒng)疾病的一個嶄新的突破，將為心肌缺血后的功能恢復提供重要理論依據和新的方法指導。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

國偉：設計研究方案，實施具體研究過程，分析實驗數(shù)據，論文撰寫；楊軍：提出研究思路，論文審核；任法新、梁平平：實施研究過程，修改論文