羅曼曼，馮智軍，任志檢,3，曾蕾,3，徐雪蓮,3，李玉民

(1.蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730030； 2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院腫瘤外科病區(qū)，蘭州 730030；3.甘肅省消化系統(tǒng)腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730030)

肝細(xì)胞肝癌通常繼發(fā)于慢性肝病，如乙型和丙型肝炎、酒精和非酒精性肝炎、代謝綜合征等，是最常見的肝臟惡性腫瘤之一，約占肝臟惡性腫瘤的90%[1]。目前，肝癌的外科治療方式主要為肝移植和手術(shù)切除[2]，術(shù)后復(fù)發(fā)一直是影響患者外科術(shù)后生存的關(guān)鍵因素，文獻(xiàn)報(bào)道肝癌肝切除術(shù)后5年復(fù)發(fā)率超過70%，肝移植術(shù)后1年和5年復(fù)發(fā)率約為15%和30%[3]，中位復(fù)發(fā)率高達(dá)16%，且復(fù)發(fā)時(shí)間大多在肝移植后16個(gè)月內(nèi)[4]。也有文獻(xiàn)報(bào)道，肝癌肝移植術(shù)后低風(fēng)險(xiǎn)復(fù)發(fā)患者的中位生存時(shí)間為75.2個(gè)月，顯著高于中、高風(fēng)險(xiǎn)復(fù)發(fā)患者(11.3個(gè)月和3.3個(gè)月)[5]。因此，探索肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)的腫瘤標(biāo)志物對(duì)于優(yōu)化患者治療方案和延長(zhǎng)生存時(shí)間具有重要預(yù)測(cè)價(jià)值。

目前，隨著對(duì)肝癌轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的不斷深入，微RNA(microRNA,miRNA)逐漸受到關(guān)注。miRNA是短的非編碼RNA，長(zhǎng)度僅為20～24 nt，其通過影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯，參與多細(xì)胞生物中基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[6]。miRNA參與肝癌調(diào)控的多個(gè)方面，包括增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成、耐藥和自噬等[7]。既往研究表明[8-9]，hsa-miR-335-5p在肝癌中被認(rèn)為是一種主要起抑癌作用的miRNA，其在肝癌組織和細(xì)胞系中低表達(dá)，而其過表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移，但是否影響肝癌肝移植后腫瘤復(fù)發(fā)目前尚不明確。因此，本研究基于公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)，通過生物信息學(xué)分析，為hsa-miR-335-5p是否參與肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)、能否作為臨床監(jiān)測(cè)肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物尋找證據(jù)。

1 材料與方法

1.1芯片數(shù)據(jù)來源 在PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索hsa-miR-335-5p和肝癌的相關(guān)文獻(xiàn)，在基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)GEO(Gene Expression Omnibus)[10](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中以“肝細(xì)胞肝癌”“肝移植術(shù)”和“miRNA”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，物種限定為“人”，篩選并確定目標(biāo)數(shù)據(jù)集后利用GEO2R分析工具獲得目標(biāo)數(shù)據(jù)集中肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)的差異miRNA，差異miRNA的篩選符合以下條件：|logFC|>1且P<0.05，并用R軟件繪制火山圖來可視化差異基因的整體表達(dá)情況。

1.2Hsa-miR-335-5p基本信息 使用PubMed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)、miRBase[11](http://www.mirbase.org/)、UCSC (http://genome.ucsc.edu/)等在線數(shù)據(jù)庫(kù)查找hsa-miR-335-5p的物種保守性、堿基序列、染色體序列等基本信息。

1.3Hsa-miR-335-5p靶基因預(yù)測(cè) 收集miRTarBase[12](http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/)和DIANA-TarBase v7.0[13](http://www.tarbase.com/)數(shù)據(jù)庫(kù)有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持的miRNA及其靶基因，預(yù)測(cè)hsa-miR-335-5p靶基因，在GEPIA[14](http://gepia.cancer-pku.cn)數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇ANOVA方法用于配對(duì)肝癌和正常組織，以|logFC|>1且P<0.01為篩選條件，獲得肝細(xì)胞肝癌中表達(dá)上調(diào)的差異基因，三者通過Funrich[15]工具取交集獲得共表達(dá)差異基因。

1.4共表達(dá)靶基因的基因本體(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路分析 Enrichr[16]數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)在線的綜合性的基因富集分析工具，運(yùn)用Enrichr數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)共有的靶基因進(jìn)行GO分析和KEGG分析，篩選出P<0.05且顯著富集的GO及KEGG通路名稱。

1.5共表達(dá)靶基因的蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因分析 STRING[17](https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)包含960萬(wàn)種蛋白和1 380萬(wàn)種蛋白質(zhì)之間相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)，可應(yīng)用于2 031個(gè)物種。通過STRING構(gòu)建共有靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，然后將其互作數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape[18]，利用Cytohubba插件、Degree法篩選出得分位于前20的靶基因作為關(guān)鍵基因，并將數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.6關(guān)鍵基因與肝癌預(yù)后生存分析 GEPIA[14]是一個(gè)國(guó)人開發(fā)的癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)的可視化在線網(wǎng)站，使用GEPIA[14]數(shù)據(jù)庫(kù)分析關(guān)鍵基因在肝癌組織和正常組織中的表達(dá)水平，繪制關(guān)鍵基因的總生存期(overall survival，OS)和無病生存期(disease free survival，DFS)曲線并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1微陣列數(shù)據(jù)集 檢索PubMed中的文獻(xiàn)得到hsa-miR-335-5p參與肝癌調(diào)控作用，通過篩選后確定GSE30297為研究的目標(biāo)數(shù)據(jù)集，包含97例樣本，其中61例為肝癌患者肝移植后腫瘤復(fù)發(fā)樣本，36例為肝癌患者肝移植后腫瘤未復(fù)發(fā)樣本，平臺(tái)號(hào)為GPL8786，平臺(tái)信息為艾菲矩陣公司多物種miRNA-1陣列(Affymetrix Multispecies miRNA-1 Array)，種屬為人。通過GEO2R分析篩選出miRNA上調(diào)612個(gè)，下調(diào)13個(gè)，見圖1。

圖1 GSE30297數(shù)據(jù)集差異miRNAs火山圖

2.2Hsa-miR-335-5p序列保守性分析 Hsa-miR-335-5p定位在染色體7q32.2，利用PubMed、miRBase、UCSC等工具分別下載并分析人(hsa)、小鼠(mmu)、牛(bta)等10個(gè)物種的hsa-miR-335-5p成熟序列，hsa-miR-335-5p序列中“UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUG”23個(gè)堿基序列在多物種中高度保守，見表1。

表1 Hsa-miR-335-5p在10個(gè)物種中堿基序列

2.3Hsa-miR-335-5p的靶基因預(yù)測(cè) 通過miRTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)hsa-miR-335-5p的靶基因共有2 368個(gè)，TarBase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)共有2 208個(gè)。從GEPIA中篩選出肝細(xì)胞肝癌下調(diào)基因2 207個(gè)，三者取交集后得到185個(gè)差異靶基因，見圖2。

圖2 Hsa-miR-335-5p差異表達(dá)的靶基因韋恩圖

2.4Hsa-miR-335-5p共表達(dá)靶基因的GO分析及KEGG通路分析 GO可分為細(xì)胞組成、生物過程和分子功能。使用Enrichr數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)hsa-miR-335-5p的185個(gè)靶基因進(jìn)行GO和KEGG分析，見圖3。參與的細(xì)胞組成有分泌顆粒腔、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔、液泡腔、質(zhì)膜跨度成分、血小板α顆粒等；生物學(xué)過程涉及炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、內(nèi)皮細(xì)胞遷移、細(xì)胞過程的積極調(diào)控、基因表達(dá)的正調(diào)控等；分子功能參與細(xì)胞因子活性、趨化因子活性、主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類蛋白復(fù)合物結(jié)合、轉(zhuǎn)錄共激活因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活子活性及RNA聚合酶 Ⅱ 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。KEGG通路有過氧化物酶體增殖物激活受體信號(hào)通路、化學(xué)致癌作用、凋亡、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路等。

GO：基因本體；KEGG：京都基因與基因組百科全書；CC：細(xì)胞組成；BP：生物過程；MF：分子功能

2.5Hsa-miR-335-5p靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選 將185個(gè)共表達(dá)靶基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖4)，下載互作數(shù)據(jù)，并導(dǎo)入Cytoscape軟件，篩選出評(píng)分前20個(gè)靶基因即關(guān)鍵基因：VEGFA、CXCL9、CCL20、SPP1、CXCL2、FOS、G6PD、CCL19、SCD、SQLE、CYP7A1、TSLP、PYGB、CYP26A1、NPY1R、GABBR1、ALDOA、ACSL1、CDA、SQSTM1，見表2。

PPI：蛋白互作

表2 20個(gè)關(guān)鍵基因列表

續(xù)表2

2.6Hsa-miR-335-5p的關(guān)鍵基因與肝癌的預(yù)后生存分析 將20個(gè)關(guān)鍵基因通過GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行肝癌相關(guān)的生存分析，結(jié)果顯示：肝癌和正常組織中VEGFA、SPP1、PYGB、G6PD的表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且與肝癌患者的預(yù)后生存顯著相關(guān)(P<0.05)，見圖5～8。

VEGFA：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A；OS：總生存期；Precent survival：生存率；Months：月；DFS：無病生存期；LIHC：肝細(xì)胞肝癌；num(T)：肝癌組織的病例數(shù)；num(N)：正常組織的病例數(shù)；5a：VEGFA與OS的關(guān)系；5b：VEGFA與DFS的關(guān)系； 5c：VEGFA在肝癌與正常組織中的表達(dá)

SPP1：分泌型焦磷酸蛋白1；OS：總生存期；Precent survival：生存率；Months：月；DFS：無病生存期；LIHC：肝細(xì)胞肝癌；num(T)：肝癌組織的病例數(shù)；num(N)：正常組織的病例數(shù)；6a：SPP1與OS的關(guān)系；6b：SPP1與DFS的關(guān)系；6c：SPP1在肝癌與正常組織中的表達(dá)

PYGB：糖原磷酸化酶B；OS：總生存期；Precent survival：生存率；Months：月；DFS：無病生存期；LIHC：肝細(xì)胞肝癌；num(T)：肝癌組織的病例數(shù)；num(N)：正常組織的病例數(shù)；7a：PYGB與OS的關(guān)系；7b：PYGB與DFS的關(guān)系；7c：PYGB在肝癌與正常組織中的表達(dá)

G6PD：葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；OS：總生存期；Precent survival：生存率；Months：月；DFS：無病生存期；LIHC：肝細(xì)胞肝癌；num(T)：肝癌組織的病例數(shù)；num(N)：正常組織的病例數(shù)；8a：G6PD與OS的關(guān)系；8b：G6PD與DFS的關(guān)系；8c：G6PD在肝癌與正常組織中的表達(dá)

3 討 論

肝移植是目前有望治愈肝癌的有效手段，但由于復(fù)發(fā)率較高，患者預(yù)后差，肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)成為亟待解決的問題。以往多以原發(fā)腫瘤的數(shù)量級(jí)大小、血管侵犯程度、生物學(xué)分級(jí)、組織學(xué)分級(jí)等粗略預(yù)測(cè)患者的預(yù)后，近年來尋找能夠反映肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)有效、安全且簡(jiǎn)便的生物標(biāo)志物成為研究熱點(diǎn)之一。

隨著對(duì)miRNA研究的深入，人們開始關(guān)注miRNA在各種疾病中的作用，特別是在腫瘤中的作用，使miRNAs成為新的治療方法和檢測(cè)預(yù)后的工具和靶點(diǎn)[6]。miRNA通過與信使RNA(messenger RNA,mRNA)結(jié)合，在細(xì)胞發(fā)育、分化和增殖過程中發(fā)揮核心作用，抑制mRNA翻譯或使其降解。人類肝臟中定量表達(dá)最多的miR-122有望用于肝癌的早期診斷[19]；miR-18a、miR-199a-5p、miR-424表達(dá)水平與肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)[20-21]；Han等[22]認(rèn)為使用miRNA的表達(dá)模式可準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)。有研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-335-5p在肝癌組織中下調(diào)，肝癌組織中其甲基化水平明顯高于癌旁組織，且有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肝癌組織中hsa-miR-335-5p表達(dá)水平降低[23]；circ-0005075是一類新定義的內(nèi)源性非編碼RNA成員之一，在肝癌中表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，hsa-miR-335-5p作為肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制因子，可與circ-0005075相互作用從而影響肝癌細(xì)胞的進(jìn)展[24]；敲除hsa-miR-335-5p能夠減弱肝癌細(xì)胞對(duì)索拉菲尼的敏感性[25]；hsa-miR-335-5p可能參與乙型肝炎病毒相關(guān)肝癌的發(fā)生發(fā)展[26-27]；hsa-miR-335-5p表達(dá)水平低的肝癌患者表現(xiàn)出不良的臨床病理特征(如高甲胎蛋白值、血管侵犯、肝硬化、腫瘤體積大)，且這些患者對(duì)動(dòng)脈栓塞治療反應(yīng)及預(yù)后較差[28]。本研究選取的數(shù)據(jù)集樣本來源是肝癌肝移植術(shù)后患者，運(yùn)用生物信息學(xué)分析得到hsa-miR-335-5p在肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組的表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示hsa-miR-335-5p在肝癌肝移植術(shù)后患者中也發(fā)揮重要作用。為進(jìn)一步了解hsa-miR-335-5p在肝癌肝移植術(shù)后患者中的作用，本研究使用軟件預(yù)測(cè)其靶基因并篩選出20個(gè)關(guān)鍵基因，之后通過GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分別驗(yàn)證這20個(gè)關(guān)鍵基因，發(fā)現(xiàn)VEGFA、SPP1、G6PD、PYGB與肝癌患者術(shù)后生存顯著相關(guān)。

VEGFA屬于血小板源性生長(zhǎng)因子/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。其在肝癌中過表達(dá)，與肝癌患者的臨床病理因素(如增殖、血管侵犯、腫瘤多樣性)有關(guān)，是肝癌細(xì)胞在低氧條件下生存的必要條件之一，還與肝癌患者不良預(yù)后有關(guān)。組蛋白脫乙?；?可預(yù)測(cè)肝癌肝移植術(shù)后患者的無復(fù)發(fā)生存期，敲低組蛋白脫乙?；?在體內(nèi)和體外能夠明顯上調(diào)VEGFA，有利于原發(fā)性肝癌的血管生成[29]。有研究表明，miRNA可以調(diào)控肝癌肝移植術(shù)后患者體內(nèi)的VEGFA表達(dá)，從而影響患者生存狀況[20]，但hsa-miR-335-5p調(diào)控VEGFA與肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系還不明確。

SPP1又稱為骨橋蛋白，能促進(jìn)VEGF依賴的腫瘤生長(zhǎng)和血管生成，可以預(yù)測(cè)肝癌肝移植術(shù)后患者的DFS[30]；其還能作為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后生物標(biāo)志物[31]；Cabiati等[32]研究發(fā)現(xiàn)，SPP1在肝癌組織中高表達(dá)，在血漿和組織中的水平隨著患者臨床嚴(yán)重程度的增加而升高，在肝移植術(shù)后6個(gè)月SPP1的血漿水平下降，由此推測(cè)肝癌肝移植術(shù)后患者體內(nèi)hsa-miR-335-5p上調(diào)引起SPP1表達(dá)水平下降進(jìn)而抑制腫瘤復(fù)發(fā)，但具體機(jī)制還需驗(yàn)證。

Hsa-miR-335-5p的靶基因PYGB是催化糖原降解的決定因素，既往文獻(xiàn)報(bào)道PYGB是人癌相關(guān)抗原的成分之一，在肝癌中高表達(dá)，與肝癌的發(fā)生進(jìn)展有關(guān)[33]；Tashima等[34]研究表明PYGB在結(jié)直腸癌的癌變過程中起重要作用，是結(jié)直腸癌的一種新的早期生物標(biāo)志物；沉默PYGB能夠抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[35]；Zhou等[36]研究發(fā)現(xiàn)miRNA可與PYGB相互作用，影響卵巢腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，可作為未來治療卵巢腫瘤的新靶點(diǎn)。

G6PD在葡萄糖代謝中起關(guān)鍵作用，G6PD缺乏癥被認(rèn)為是活體肝移植的禁忌證，但Reddy等[37]認(rèn)為若G6PD缺乏癥患者的供體適合捐贈(zèng)，圍手術(shù)期溶血的風(fēng)險(xiǎn)低且臨床環(huán)境安全，可以考慮肝移植；G6PD參與肝癌中磷酸戊糖途徑和生物合成的關(guān)鍵調(diào)控步驟，敲除G6PD可抑制肝癌的進(jìn)展，降低肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，還能通過干擾素途徑使乙型肝炎病毒復(fù)制減少500%，G6PD可作為評(píng)估肝癌風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后的新的生物標(biāo)志物[38-39]。G6PD作為hsa-miR-335-5p的靶基因，參與肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

以上研究表明，VEGFA、SPP1、PYGB、G6PD基因低表達(dá)時(shí)可抑制肝癌的進(jìn)展，且VEGFA和SPP1之間還能夠相互影響。4個(gè)關(guān)鍵基因的生存分析結(jié)果顯示，VEGFA、SPP1、PYGB、G6PD低表達(dá)時(shí)肝癌患者的OS和DFS高于高表達(dá)組，且在肝癌和正常組織中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此推測(cè)hsa-miRNA-335-5p調(diào)控VEGFA、SPP1、PYGB、G6PD可作為監(jiān)測(cè)肝癌肝移植預(yù)后的潛在標(biāo)志物，并為研究肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)提供了新思路。

綜上所述，VEGFA、SPP1、PYGB、G6PD是hsa-miRNA-335-5p可靠的靶基因，與肝癌肝移植術(shù)后患者的預(yù)后存在顯著相關(guān)性，是肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)可靠的調(diào)控機(jī)制。雖然本研究選取的數(shù)據(jù)集較少，預(yù)測(cè)miRNA靶基因的工具少，使用的各種數(shù)據(jù)庫(kù)并不是時(shí)時(shí)更新或?qū)蛐畔⒆⑨尣煌晟疲赡茉斐杉訇?yáng)性的結(jié)果，但在一定程度上也能為研究提供初步依據(jù)和新思路。目前miRNA及其靶基因協(xié)同作用與肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)關(guān)系的基礎(chǔ)和臨床研究仍較少，值得進(jìn)一步探究，為臨床監(jiān)測(cè)肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)尋求新的靶點(diǎn)，做出正確的治療決策。