王思遠(yuǎn)，顧佳鑫，周毅

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科，哈爾濱 150001； 2.開灤總醫(yī)院血液內(nèi)科，河北 唐山 063000)

近年來，乳腺癌已經(jīng)成為中國女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類健康。腫瘤細(xì)胞通過血液循環(huán)向遠(yuǎn)處擴(kuò)散是乳腺癌患者轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的重要途徑。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)是來源于原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移腫瘤，獲得脫離基底膜的能力并入侵，通過組織基質(zhì)進(jìn)入血管的腫瘤細(xì)胞，是惡性腫瘤血運轉(zhuǎn)移的重要研究指標(biāo)，早在1869年，Ashworth首次提出了CTCs的概念[1]。通常血行轉(zhuǎn)移發(fā)生在癌癥晚期，但有些早期乳腺癌已有血行轉(zhuǎn)移，其癌細(xì)胞可經(jīng)淋巴途徑進(jìn)入靜脈[2]。因此，及時、有效地發(fā)現(xiàn)和干預(yù)CTCs的產(chǎn)生是減少乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、提高患者生存率和生存質(zhì)量的關(guān)鍵。目前，傳統(tǒng)的病理學(xué)檢查是腫瘤確診的金標(biāo)準(zhǔn)，但病理學(xué)檢查為有創(chuàng)操作，需通過手術(shù)或穿刺等手段實施。與傳統(tǒng)病理學(xué)檢查相比，CTCs僅需檢測外周靜脈血液便可達(dá)到活檢的目的，原則上實現(xiàn)了“無創(chuàng)活檢”，可更加方便地監(jiān)測患者的無進(jìn)展生存期、總生存期和生活質(zhì)量。然而，外周血中的乳腺癌CTCs數(shù)量稀少，Lee等[3]研究表明，乳腺癌患者外周血中大約每10億個有核細(xì)胞中僅可見1枚CTC。因此，如何快速、精準(zhǔn)地檢測CTCs十分重要?，F(xiàn)就CTCs在乳腺癌診治中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 CTCs的生物學(xué)特性及檢測方法

1.1CTCs的生物學(xué)特性 CTCs是存在于外周血中的各類腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱，主要分為4類，即單個上皮性CTCs、干細(xì)胞性CTCs、間質(zhì)性CTCs和CTCs簇。探究乳腺癌CTCs的生物學(xué)特征有助于了解腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，指導(dǎo)臨床研究新的抗癌策略。CTCs產(chǎn)生的機(jī)制目前尚不明確，可能與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)相關(guān)。腫瘤細(xì)胞在進(jìn)入血液循環(huán)時可能發(fā)生EMT，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，在EMT過程中，上皮細(xì)胞擺脫了細(xì)胞間黏附性、平面-頂部基質(zhì)極性及缺乏運動性等分化特征，上皮相關(guān)基因下調(diào)，間充質(zhì)基因上調(diào)，獲得了間充質(zhì)的特性[4]，并進(jìn)入血液循環(huán)。在血液循環(huán)中，CTCs不僅以游離的單個細(xì)胞形式出現(xiàn)，也可聚集成團(tuán)形成CTCs細(xì)胞簇。盡管每天有大量的腫瘤細(xì)胞由原位脫落入血形成CTCs，但僅有極少的CTCs可以存活，并發(fā)展成新的轉(zhuǎn)移灶，其中大多數(shù)CTCs在外周血循環(huán)過程中被免疫系統(tǒng)殺傷或凋亡。調(diào)控CTCs凋亡的相關(guān)通路及機(jī)制尚不清楚，Bonnomet等[5]研究表明，乳腺癌細(xì)胞通過EMT增強(qiáng)CTCs的侵襲、遷移能力誘導(dǎo)相關(guān)蛋白酶參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)、侵襲組織。

在臨床上，關(guān)注CTCs特殊的生物學(xué)特征有助于早期診斷原發(fā)腫瘤及轉(zhuǎn)移灶。研究表明，CTCs的形成時間早于影像學(xué)和臨床癥狀的出現(xiàn)，CTCs不僅從實體腫瘤病灶脫落進(jìn)入血液循環(huán)，還有可能在影像學(xué)發(fā)現(xiàn)宏觀腫瘤之前就已出現(xiàn)在血液循環(huán)中[6]。因此，與傳統(tǒng)的影像學(xué)檢查和腫瘤標(biāo)志物的檢測相比，檢測CTCs可以更早地發(fā)現(xiàn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。此外，CTCs還可以替代傳統(tǒng)采集腫瘤組織方法行相關(guān)病理實驗及測試，如基因點突變、人類表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)基因擴(kuò)增、拷貝數(shù)的變異、DNA甲基化及蛋白質(zhì)組學(xué)等分析研究[7-11]。

1.2CTCs的檢測方法 理想的檢測方案需要有效、準(zhǔn)確、迅速地檢測并分離存在于大量正常細(xì)胞中的腫瘤細(xì)胞。CTCs分選是各種CTCs檢查的第一步，通過陽性或陰性篩查和富集，而后鑒定并區(qū)分CTCs和正常細(xì)胞。應(yīng)用CTCs特異性表達(dá)的上皮型標(biāo)志物[如上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)、上皮鈣黏素、細(xì)胞因子]和間質(zhì)型標(biāo)志物(如神經(jīng)鈣黏素、波形蛋白和鋅指轉(zhuǎn)錄因子蛋白)，不僅可以對CTCs進(jìn)行數(shù)量測定，還可以聯(lián)合多種標(biāo)志物對CTCs進(jìn)行形態(tài)學(xué)或生物學(xué)分析[12]。完善CTCs的檢測手段可以有效地將其應(yīng)用于腫瘤的早期診斷，快速評估腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，為早期乳腺癌針對性治療提供依據(jù)[13]。不同的檢測技術(shù)可以捕獲不同類型的CTCs，并且它們對不同類型腫瘤細(xì)胞的敏感性和特異性也不同。常規(guī)的檢測手段(如CellSearch系統(tǒng))需根據(jù)血液中的細(xì)胞大小分離出所需要的細(xì)胞團(tuán)，然后對這些細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行鑒定，并區(qū)分具有EpCAM+/肌酸激酶(creatine kinase，CK)陽性/4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)陽性/CD45-特征的細(xì)胞和正常細(xì)胞(表1)。

表1 CTCs檢測方法

2 CTCs在乳腺癌中的臨床意義

2.1CTCs在乳腺癌分型中的意義 目前臨床上針對乳腺癌的免疫組織化學(xué)主要評定標(biāo)準(zhǔn)是評估腫瘤中雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)、HER2和Ki67的表達(dá)水平。乳腺癌的分子分型分為Luminal A型、Luminal B型、ERBB2+型和Basal-like型，HER2陽性乳腺癌患者因具有更高的惡性程度、更快的疾病進(jìn)展速度和更早的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)而受到了廣泛的關(guān)注。Schindlbeck等[21]將乳腺癌患者常用的免疫組織化學(xué)標(biāo)志物(如ER、PR和HER2)在CTCs上進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同患者或乳腺癌亞型之間存在很大的差異。腫瘤的異質(zhì)性決定了CTCs不同的分子表型，Ignatiadis等[22]通過熒光原位雜交分析CTCs中HER2的表達(dá)狀態(tài)，并與原位腫瘤進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HER2陰性乳腺癌患者體內(nèi)的CTCs呈HER2過表達(dá)。目前尚不明確HER2表達(dá)的變化是否與對原發(fā)腫瘤中HER2狀態(tài)的評估不準(zhǔn)確有關(guān)，亦可能與HER2陽性的亞基最初被“隱藏”在HER2陰性原發(fā)性腫瘤的轉(zhuǎn)移性生長中有關(guān)。Aktas等[23]對96例乳腺癌患者使用基于聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)的AdnaTest?，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CTCs上的HER2表達(dá)情況可預(yù)測乳腺癌轉(zhuǎn)移灶上HER2的表達(dá)情況，可為制訂個體化治療提供重要信息。然而，隨著對CTCs研究的深入，發(fā)現(xiàn)CTCs上HER2狀態(tài)會隨著時間的推移而改變，并可能取決于治療方法。例如，Bidard等[24]研究調(diào)查了抗HER2抗體——曲妥珠單抗對消除HER2陽性CTCs的作用，認(rèn)為在HER2陽性的乳腺癌中CTCs的總體發(fā)生率較低可能是由于先前接觸過抗HER2治療。同樣，Rack等[25]報道了抗HER2治療可以消除骨髓中HER2陽性擴(kuò)散的腫瘤細(xì)胞，由此推測，抗HER2治療有顯著降低CTCs數(shù)量的作用。因此，監(jiān)測CTCs的數(shù)量及狀態(tài)對HER2陽性的乳腺癌患者具有重要的臨床意義，但目前尚無統(tǒng)一的CTCs診斷標(biāo)準(zhǔn)。另外，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中，CTCs似乎比原位腫瘤存在更大程度的HER2陽性率，表明它們具有惡性潛能(表2)。

2.2CTCs在乳腺癌療效評估中的意義 目前乳腺癌的主要治療手段仍是手術(shù)治療，通過全身治療(術(shù)前新輔助化療、術(shù)后放化療、內(nèi)分泌治療)減慢晚期乳腺癌進(jìn)展，最大限度地提高患者日常生活質(zhì)量并延長總生存期，同時最大限度地降低治療不良反應(yīng)發(fā)生率，CTCs有可能作為液體活檢更好地指導(dǎo)乳腺癌的治療并評估預(yù)后。Maltoni等[31]研究發(fā)現(xiàn)，早期乳腺癌患者體內(nèi)CTCs的陽性率為9.4%～48.6%，并且認(rèn)為血液中CTC≥1個/7.5 mL是一個閾值，可預(yù)示早期復(fù)發(fā)和總生存期降低。Rack等[32]對2 026例乳腺癌患者進(jìn)行常規(guī)輔助化療，發(fā)現(xiàn)CTCs陰性患者的治療效果較好，同時在多因素分析中發(fā)現(xiàn)，CTCs的存在與乳腺癌無病生存率相關(guān)(P<0.001)，CTCs計數(shù)可作為獨立預(yù)后參考。Bredemeier等[33]通過使用多標(biāo)記實時熒光定量PCR芯片對CTCs進(jìn)行全面的分子層面特征描述，通過評估治療干預(yù)過程中CTCs分子譜的變化進(jìn)而評估患者對治療的反應(yīng)。大量數(shù)據(jù)表明，在40%～80%的乳腺癌患者外周血中可檢測到CTCs[24-28]。由此可見，CTCs數(shù)量的變化可能反映某種全身療法的反應(yīng)，同時，由于CTCs是無創(chuàng)的收集方法，較易在治療過程中實現(xiàn)持續(xù)監(jiān)測，為療效評估提供了可靠依據(jù)。但是，由于目前科研進(jìn)展有限，CTCs能否成為臨床獨立判斷療效的因素還有待商榷。Azim等[34]研究發(fā)現(xiàn)，在HER2+早期乳腺癌患者中，CTCs數(shù)值與病理完全緩解發(fā)生率比例較低；Bidard等[35]研究收集了1 574例將進(jìn)行新輔助化療和1 200例將進(jìn)行手術(shù)的早期乳腺癌患者的血液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新輔助化療前25.2%的患者檢測出1個或多個CTCs，但其計數(shù)對病理完全緩解無影響。因此，隨著科研進(jìn)展，對乳腺癌患者采用CTCs檢測可以推測乳腺癌患者的治療效果。

表2 CTCs與乳腺癌免疫組織化學(xué)表達(dá)比例

2.3CTCs在判斷乳腺癌預(yù)后中的意義 通過對乳腺癌患者外周血中CTCs的監(jiān)測，不僅可以預(yù)測放化療的效果和預(yù)后，還可以監(jiān)測術(shù)后腫瘤有無復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。Mikhitarian等[36]對215例T1～T3期乳腺癌患者的外周血樣本進(jìn)行分析，利用EpCAM、CK19、癌胚抗原和乳球蛋白等多種常規(guī)腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行綜合檢測，發(fā)現(xiàn)患者外周血中的CTCs計數(shù)升高與乳腺癌組織學(xué)分期的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.031 5)，CTCs計數(shù)增加可能是患者預(yù)后較差的指標(biāo)。一項多因素前瞻性分析在新治療方案開始前和首次隨訪時檢測了177例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者外周血CTCs的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CTCs數(shù)量與患者生存質(zhì)量相關(guān)，其中CTCs<5個/7.5 mL外周血患者無進(jìn)展生存期和總生存期顯著縮短(無進(jìn)展生存期：2.7個月比7.0個月；總生存期：10.1個月比18個月，P<0.05)，5個CTCs/7.5 mL外周血的閾值水平可用于預(yù)測轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的臨床預(yù)后[30]。梁志洪等[37]對135例乳腺癌患者進(jìn)行CTCs測定，發(fā)現(xiàn)CTCs的陽性率與臨床TNM分期、HER2和Ki-67指數(shù)等常見預(yù)測乳腺癌預(yù)后指標(biāo)具有相關(guān)性。這些研究證實了CTCs計數(shù)與乳腺癌已知不良預(yù)后標(biāo)志物的相關(guān)性，說明將乳腺癌CTCs計數(shù)作為獨立預(yù)后標(biāo)志物具有重要臨床意義。此外，Budd等[38]對138例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者進(jìn)行CTCs檢測，并與影像學(xué)檢查進(jìn)行對比分析，結(jié)果顯示，影像學(xué)陰性而CTCs≥5個/7.5 mL外周血的患者生存率較CTC<5個的患者低(中位生存時間：3個月比25.9個月)，而影像學(xué)陽性但CTCs<5個/7.5 mL外周血的患者生存率較CTCs≥5個/7.5 mL患者高(中位生存時間：19.9個月比6.4個月)。因此，CTCs檢測較常規(guī)影像學(xué)檢查具有更高的敏感性，能及時、有效地判斷乳腺癌的預(yù)后情況。

3 小 結(jié)

高特異性和高敏感性的CTCs檢測可以作為乳腺癌患者的預(yù)后參考，但由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的CTCs分離程序和表征，且技術(shù)手段不足，限制了目前CTCs的研究。此外，CTCs之間仍存有差異，未來需要進(jìn)一步對乳腺癌CTCs進(jìn)行深入研究，特別是在乳腺癌的早期診斷、免疫治療、預(yù)后評估、預(yù)防復(fù)發(fā)等方面，應(yīng)以更加完善的方案監(jiān)測CTCs。另外，CTCs的精準(zhǔn)篩選可以使評估患者的個體化差異、分析耐藥機(jī)制等研究變得簡單而靈活，同時將基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床應(yīng)用相結(jié)合，探索新的抗癌策略，最終提高乳腺癌患者的生存率，改善生活質(zhì)量。