楊靜，王軍，路紅，任茜，王玉平，關泉林，周永寧

(1.蘭州大學第一臨床醫(yī)學院，蘭州 730000； 2.蘭州大學甘肅省胃腸病重點實驗室，蘭州730000；3.蘭州大學第一醫(yī)院 a.消化科，b.腫瘤外科，蘭州730000)

胃癌是世界上第五大常見的惡性腫瘤，雖然大多數(shù)國家的癌癥發(fā)病率大幅降低，但胃癌仍為全球帶來巨大的健康負擔。在中國每年約有405 000例胃癌新病例確診，占全世界病例總數(shù)的42.5%[1]。胃癌早期患者接受根治術后化療，術后5年生存率為90%[2]，但由于早期胃癌缺乏特異性癥狀和體征，故臨床檢出率較低，大多數(shù)(>70%)患者發(fā)現(xiàn)時已處于晚期[2]，大多數(shù)晚期胃癌患者的預后很差，中位生存期僅為10～12個月[3]。幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是一種革蘭陰性微嗜氧桿菌，定植于人的胃黏膜中，導致受感染個體罹患胃炎，其中10%～20%的人患胃潰瘍，1%～2%進展為胃癌[4]。一項薈萃分析顯示，與感染Hp的細胞毒素相關基因A(cytotoxin-associated gene A，CagA)-菌株人群相比，感染CagA+菌株人群遠期的胃癌發(fā)生風險增加2倍[5]。Hp可通過多種途徑在胃黏膜引起炎癥和嚴重并發(fā)癥(包括腫瘤)，但其引起胃癌發(fā)生的具體機制目前仍不明確。隨著識別、分離和驗證干細胞技術的不斷完善以及胃癌干細胞(gastric cancer stem cells，GCSCs)特異性標志物的初步闡明，有證據(jù)表明，GCSCs參與了胃癌的侵襲、轉移及耐藥過程[6]。因此，Hp可能通過GCSCs誘導胃癌的發(fā)生、轉移?，F(xiàn)就Hp通過GCSCs分子標志物及上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)誘導胃癌發(fā)生的機制予以綜述。

1 Hp感染對胃癌的影響

導致胃癌發(fā)生的危險因素可分為Hp菌株變異、宿主反應、基因型以及環(huán)境因素等類別。雖然Hp感染并非胃癌唯一致病因素，但卻是最重要的可控致病因素。90%的胃癌患者現(xiàn)在或既往感染過Hp[7]。Watanabe等[8]利用蒙古沙鼠模型首次描述了Hp可引起胃癌，Hp感染62周后，約37%(10/27)的蒙古沙鼠發(fā)生了胃癌，而未感染Hp沙鼠中則未發(fā)現(xiàn)胃癌。同時，根除Hp也被確定為一種潛在預防胃癌的策略，Han等[9]提出，可通過根除Hp延緩早期胃癌切除術后患者胃癌的再次發(fā)生，但如果胃黏膜已經(jīng)進展為萎縮或者腸化生，Hp根除和水平檢測對行內鏡下黏膜剝離術患者再次發(fā)生胃癌則無預防作用[10]。大多數(shù)Hp感染患者無特殊癥狀，且Hp傳播途徑廣泛，對根除方案耐藥率高，同時Hp通過影響GCSCs引起胃癌的具體途徑目前尚未明確，故導致根除Hp預防胃癌的方案難以普及。Bessède等[11]研究發(fā)現(xiàn)，感染Hp的人胃上皮CD44+細胞可被誘導呈間充質表型，較未感染Hp的CD44-細胞更易形成球形集落，且在小鼠異種移植模型中更具致瘤性。此外，Hp也可通過Wnt/β聯(lián)蛋白(β-catenin)信號通路影響胃癌的干細胞樣特性[12]。動物實驗表明，Hp引起的胃黏膜慢性炎癥可誘導骨髓干細胞的募集、歸巢和分化，提示GCSCs可能在Hp誘導的胃癌發(fā)生過程中起一定作用[13]。

2 Hp感染對GCSCs的影響

GCSCs的鑒定、分離是研究其潛在機制以及明確 Hp感染對GCSCs影響的關鍵。目前的研究中有兩種方式鑒定腫瘤干細胞：①體外球形克隆實驗，由于球形細胞具有干細胞特性，因此被認為是一種較為簡便的方法[14]，但由于缺乏微環(huán)境的刺激，干細胞的特性可能在球體形成過程中發(fā)生變化；②將癌組織移植到免疫缺陷小鼠皮下或特定組織體內的成瘤實驗[15]。1997年，有學者最先在急性髓系白血病中證實了標志物為CD34+CD38-亞群的腫瘤干細胞的存在[16]。2003年，Al-Hajj等[17]報道在人乳腺癌中分離鑒定出表面標志物為CD24-/lowESA+的乳腺癌干細胞；隨后，在腦和其他類型實體瘤中也證實了腫瘤干細胞的存在[18]，包括胃腸道腫瘤。關于GCSCs的起源,通常存在兩種假設。一種假設認為，GCSCs的來源可能與胃干細胞的來源密切相關，胃黏膜上皮系統(tǒng)的完整性由干細胞維持，胃黏膜上皮更新速度較快，幾天或幾個月內不足以形成惡變，而干細胞壽命較長,更容易累積突變[19]。自我更新是胃干細胞的基本特性，在胃腺體的自我更新和動態(tài)平衡中以及在損傷后的上皮修復中均起著至關重要的作用。慢性Hp感染與胃干細胞直接或間接相互作用，可能影響胃干細胞分化并在胃腺體細胞及上皮細胞中引入分子損傷[20]，進一步支持了胃癌起源于胃干細胞的觀點。另一種假設認為，GCSCs來源于骨髓間充質干細胞，骨髓間充質干細胞是一種成體干細胞，具有遷移、再生、多重分化的潛力，骨髓間充質干細胞分化主要依賴于局部微環(huán)境，當Hp感染引起胃損傷時，可誘導趨化因子和細胞因子釋放以及骨髓間充質干細胞的富集來修復胃黏膜[12]，但是這些分化的細胞并不正常，生長速度開始加快，進而形成早期胃癌。

3 Hp感染與GCSCs相關的分子標志物

只有對腫瘤細胞進行深入研究，才能使胃癌的精確靶向治療成為可能。但由于目前許多研究的結果并不一致，因此許多可能是GCSCs的特異性標志物均存在不確定性。部分與Hp相關的GCSCs表面標志物在胃中的位置以及在胃癌中的功能見表1。

3.1CD44 CD44是一種在白細胞、內皮細胞、肝細胞和間充質細胞上表達的跨膜糖蛋白，具有多種生理功能，包括基質黏附、細胞遷移和分化[27]。CD44是第一個被發(fā)現(xiàn)的GCSCs表面標志物，在多種實體腫瘤干細胞中表達，在腫瘤細胞對Hp、缺氧等微環(huán)境的反應中起關鍵作用[28]。CD44被認為是致癌通路信號轉導的中介體，在蒙古沙鼠胃癌模型中，CD44通過介導Hp引起胃黏膜萎縮及過度增殖，并通過抑制CD44阻斷上皮細胞的增殖，從而抑制Hp感染引起的腫瘤進展[29]。Takaishi等[30]首次提出細胞表面標志物CD44可用于識別GCSCs,他們將富含CD44的胃癌細胞系體外培養(yǎng)產(chǎn)生的球形克隆移植于重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠皮下，形成了胃癌移植瘤，用短發(fā)夾RNA敲除CD44后，重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠形成的球形集落顯著減少、CD44胃癌細胞系的體外和體內致瘤能力均顯著降低。此外，CD44胃癌細胞還表現(xiàn)出較強的致瘤性、耐化療和耐輻射能力[31]，因此可作為研究胃癌預后的重點。然而，由于CD44在多種癌干細胞中表達水平較高，故缺乏特異性。

表1 GCSCs常見分子標志物

3.2CD133 CD133存在于質膜突起中(如上皮微絨毛)，常用于分離和標記前列腺腫瘤干細胞、胰腺腫瘤干細胞、結直腸腫瘤干細胞、頭頸部腫瘤干細胞等，但目前關于CD133作為腫瘤標志物在胃癌中的作用仍存在爭議。有研究表明，CD133的表達在胃癌進展階段(正常黏膜、炎癥/化生、低度異型增生和胃腺癌)差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但在Hp陽性組和陰性組表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)[32]。CD133的表達與腫瘤的轉移和復發(fā)呈正相關，多因素分析表明，CD133陽性是腫瘤復發(fā)的獨立預后因素[22]。此外，一項薈萃分析表明，CD133過表達與淋巴結轉移、胃癌的遠處轉移、TNM分期有關，CD133陽性的胃癌患者預后更差[33]。

3.3CD24 作為P選擇素的配體，CD24是一種由糖基磷脂酰肌醇錨定的小分子細胞表面唾液蛋白，存在于活化的內皮細胞和血小板上的黏附分子中[34]。研究發(fā)現(xiàn)，CD24的表達與胃癌的分期、侵襲性和淋巴轉移有關，CD24的沉默顯著減少了細胞的轉移和侵襲[23]，但在進展為胃癌的多階段過程中CD24很少出現(xiàn)。CD24可介導胃癌的發(fā)生，并可通過抑制細胞凋亡、促進侵襲來促進胃癌的進展，而信號轉導及轉錄激活因子3(signal transduction and activator of transcription 3，STAT3)的激活起著至關重要的作用；且Hp CagA可在體內外激活STAT3信號通路，促進胃癌的發(fā)生、發(fā)展，提示Hp感染和STAT3信號通路可能在CD24誘導胃癌的發(fā)生中起重要作用[35]。此外，CD24與CD44在胃癌中的陽性率均較高,兩者共表達與胃癌的預后不良密切相關[36]。因此，有研究認為可將CD24作為胃癌靶向治療的新靶點[35]。

3.4富含亮氨酸重復序列的G蛋白偶聯(lián)受體(leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor，Lgr)5 Lgr5是一類G蛋白受體，Lgr5標記的胃干細胞在新生兒中主要位于胃體和胃竇部，但在成人中僅限于胃竇部；Lgr5過表達是來源于腸黏膜、結腸、胃、毛囊、腎臟和乳腺的干細胞的標志[37]。研究發(fā)現(xiàn)，表達Lgr5的小腸上皮細胞具有干細胞特性，結直腸腫瘤干細胞表達Lgr5，表現(xiàn)出干細胞的多能性和自我更新能力，被認為是腫瘤轉移的種子[38]。免疫染色發(fā)現(xiàn)，Lgr5細胞可以在胃癌發(fā)展的不同階段遷移，與非腫瘤組織相比，食管、胃、肝臟、胰腺、結腸和直腸腫瘤組織均顯示Lgr5細胞顯著增多[39]。Wang等[40]證明，Lgr5可通過Wnt/β-catenin信號通路促進胃腺癌的增殖、侵襲和遷移，解釋了Lgr5在腫瘤發(fā)生過程中過表達的分子機制。與其他部位腫瘤的研究一致，Lgr5在癌細胞轉移過程中的表達可歸因于Lgr5+和Lgr5-，Lgr5+在腫瘤轉移中的表達是Lgr5-的6～10倍[41]。在胃癌術前化療后Lgr5表達增加與腫瘤進展、化療效果差、生存期短等因素密切相關；此外，上調Lgr5表達可能增加胃癌細胞的化療耐藥性，而下調Lgr5表達則能使胃癌細胞對化療敏感[42]。Lgr5標記的癌細胞可以向黏膜內的不同方向增殖，表明Lgr5的表達與癌細胞的侵襲生長特性有關[39]。未來需進一步研究Lgr5+和Lgr5-在胃癌發(fā)生過程中的作用，尤其是在慢性Hp感染環(huán)境中的作用。

3.5三葉因子家族(trefoil factor family，TFF)2 TFF(TFF1、TFF2、TFF3)的功能主要包括穩(wěn)定黏液屏障、調節(jié)切口愈合過程中的細胞遷移、促進胃細胞分化、增殖和凋亡以及抑制胃癌形成等[43]。TFF2主要用于標記胃上皮祖細胞，起源于胃底，稱為解痙多肽表達性化生，TFF2與Hp依賴的胃底腺萎縮有關[25]，TFF2的表達水平降低可能是胃癌的前兆。使用免疫組織化學檢測法發(fā)現(xiàn)，TFF2在萎縮性胃炎和低級別上皮內瘤變中表達，與低級別上皮內瘤變相比，TFF2在萎縮性胃炎中的表達強度更高，提示TFF2的表達水平可能與胃黏膜的損傷程度呈負相關[44]。TFF2在胃腸道潰瘍病理中的表達水平迅速升高，尤其是再生上皮或非甾體抗炎藥治療后[45]。TFF2可負調控胃癌前病變和腫瘤的進展，但這一作用被Hp感染啟動的甲基化所破壞[46]。關于TFF2作為腫瘤干細胞的功能仍需進一步研究,同時未來需了解TFF2在炎癥環(huán)境中胃腺體更新和分化中的作用。

3.6Musashi-1 目前，Musashi-1被認為是胃腸道干細胞的標志物，而與神經(jīng)祖細胞不對稱分裂相關的RNA結合蛋白被認為是小鼠腸道中干細胞和早期線性的標志[25]。Musashi家族主要在干細胞中表達，與干細胞的分化與增殖密切相關，在維持干細胞狀態(tài)、誘導細胞發(fā)生轉化以及腫瘤發(fā)生中起重要作用[47]。Musashi-1在胃癌前病變和侵襲性胃癌中均有表達，Hp感染可導致Musashi-1在人胃上皮細胞中表達增加[48]。Musashi-1表達水平不僅與腫瘤發(fā)生的位置有關，還與腫瘤分化程度有關，腫瘤分化程度越低，Musashi-1的表達越少；Musashi-1陽性細胞在胃癌發(fā)生的早期事件中起關鍵作用，可能與胃癌的進展及預后不良有關[26]。雙重免疫染色試驗顯示，Musashi-1與Lgr5在正常和胃癌患者組織中均有表達，提示Musashi-1具有調節(jié)正常上皮細胞分化的作用，并可能具有致癌作用[39]。未來需進一步確定Musashi-1作為GCSCs標志物的作用。

4 Hp感染通過EMT影響GCSCs

EMT是指極化上皮細胞失去黏附性和細胞間的連接，同時遷移能力增強對凋亡產(chǎn)生抵抗的發(fā)展過程，主要包括細胞形態(tài)學改變和基因學改變[49]。EMT可發(fā)生在不同的生物學過程中，如切口愈合、腫瘤進展和遷移[50]。非干細胞通過EMT過程以及獲得侵襲性間充質表型向腫瘤干細胞轉變，GCSCs可能是在Hp感染的作用下通過EMT過程以及獲得侵襲性間充質表型向腫瘤干細胞轉變的過程中獲得的[51]。正?；|中含有少量的成纖維細胞，尤其是肌成纖維細胞，肌成纖維細胞在炎癥區(qū)及腫瘤組織周圍反應性基質中的數(shù)量迅速增加[49]。然而，Hp感染是如何引起EMT向GCSCs轉變目前尚不清楚。據(jù)報道，一方面Hp的毒力因子CagA可破壞細胞之間的連接，導致上皮黏附消失，直接激活EMT[52]；另一方面，Hp感染可通過Yes相關蛋白、Notch、Wnt/β-catenin等相關的細胞通路在GCSCs的形成中起重要作用[53-54]。Hp感染時，胃黏膜上皮毒力因子細胞空泡毒素A可促進CagA的累積[55]，CagA可通過觸發(fā)致癌YAP通路促進胃癌發(fā)生過程中的EMT[56-57]。Hp可激活Notch信號通路，在胃癌中表達上調，并可通過影響相鄰細胞間的信號轉導調控細胞的增殖、分化[58]。Bessède等[11]通過Hp的毒力因子CagA證明，Hp在胃上皮細胞系中通過CagA導致了與CD44表達相關的EMT表型。但EMT與GCSCs不是絕對的因果關系，EMT途徑在增強胃癌細胞形成、侵襲和轉移的同時，還可促進GCSCs形成，同時GCSCs也參與了EMT的啟動；GCSCs和EMT同時受到微環(huán)境因素的影響。EMT在GCSCs形成中的作用目前仍不明確，進一步研究兩者的轉化關系，可為胃癌的防治提供新方向。

5 小 結

由于胃癌的發(fā)生、發(fā)展、耐藥和轉移均與GCSCs有關，因此GCSCs靶向治療受到越來越多的關注。與標準治療方案相比，制訂專門消除GCSCs的策略可能更有效且不良反應更小。雖然關于GCSCs分子標志物及通路的研究均取得了初步成就，但更精確的分子標志物及治療靶點仍需進一步實驗證實。目前，Hp的檢測及根除仍不能徹底消除Hp引起的相關胃癌，可能由于Hp在根除前已經(jīng)啟動了體內相關致癌信號通路。因此，進一步研究Hp與GCSCs標志物及相關通路間的聯(lián)系，有助于深入了解胃癌發(fā)生、發(fā)展的機制，可能為胃癌的早期篩查及靶向治療提供新思路。