秦雯，楊建宇，黃夏寧，賴曉玉，朱小東

(廣西醫(yī)科大學附屬武鳴醫(yī)院 a.病理科，b.腫瘤科，南寧 530199)

胰腺癌是一種侵襲性疾病，缺乏早期生物標志物、轉移能力強、化療效果差，也是導致全球癌癥死亡的五大主要原因之一[1-2]。胰腺癌生存率低與其高侵襲性、固有的化療耐藥和缺乏有效的靶向治療藥物有關。有證據(jù)表明，高侵襲性和耐藥性與腫瘤微環(huán)境的改變關系密切，腫瘤微環(huán)境的特征是通過自分泌、旁分泌或細胞間直接接觸來實現(xiàn)細胞間的通訊[3]。然而，細胞間也可以通過其他機制進行通訊，如外泌體。腫瘤分泌的外泌體是腫瘤浸潤、轉移的關鍵媒介[4]。癌細胞的外泌體含有更多的微RNA(microRNA，miRNA)，其中也包括與RNA誘導沉默復合物相關的miRNA[5-8]。上述研究提示，腫瘤細胞可能通過外泌體途徑調(diào)控局部腫瘤微環(huán)境甚至遠隔組織中靶細胞的行為。有研究證實，外泌體在腫瘤的局部侵襲、遷移、血管生成、免疫逃避和治療耐藥中均發(fā)揮重要作用[9-12]。此外，由于大多數(shù)細胞能分泌外泌體，使外泌體在血液和其他體液中廣泛存在，因此在腫瘤領域關于外泌體的臨床應用研究也越來越多，包括用微創(chuàng)取樣手段獲取外泌體RNA作為診斷和判斷腫瘤預后的潛在生物標志物、利用外泌體作為蛋白質(zhì)和核酸的天然載體進行治療[13-14]等。有學者通過生物信息學的方法進行分析發(fā)現(xiàn)，與胰腺癌相關的外泌體miRNA主要有19個：miR-100、miR-10b、miR-125B1、miR-145、miR-155、miR-196A1、miR-200A、miR-200C、miR-203A、miR-21、miR-210、miR-212、miR-221、miR-222、miR-23B、miR-126、miR-141、miR-373和miR-375[15]。現(xiàn)就外泌體miRNA在胰腺癌中的研究進展予以綜述，以期為胰腺癌的診斷和治療提供新思路。

1 外泌體miRNA的概述

在人類幾乎所有細胞類型中均存在囊泡內(nèi)或與囊泡相關的功能RNA，這引起了人們對細胞外囊泡，尤其是外泌體的廣泛關注。外泌體是脂質(zhì)雙分子層結合形成的納米囊泡。外泌體通常以其大小(40～100 nm)來描述，代表其起源的表面標志物和分子內(nèi)容物是其本質(zhì)所在[16-17]。Pan和Johnstone[18]在綿羊網(wǎng)狀細胞的體外實驗中觀察核內(nèi)體的出芽，第一次描述了外泌體，并發(fā)現(xiàn)由此產(chǎn)生的多泡體通過與質(zhì)膜融合形成在細胞外釋放的外泌體，而這一生物過程可將外泌體與胞外囊泡家族的其他成員區(qū)分開來[19]，并且外泌體的組裝和運輸是在核內(nèi)分選復合體的嚴格控制下進行的[20]。此外，不同外泌體所含的分子物質(zhì)(即外泌體內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)成分)與外泌體所在的母細胞明顯不同，表明外泌體有獨特的生理功能[21-23]。其中外泌體中的核酸性質(zhì)較穩(wěn)定且具有特異性，在疾病的研究中具有重要意義。這些核酸包括信使RNA、miRNA、轉運RNA、小干擾RNA等，其中比較重要的是miRNA[24-25]，外泌體中的miRNA參與干細胞分化、細胞遷移、血管形成、蛋白修飾等過程，因此與腫瘤的發(fā)生和轉移密切相關。

2 外泌體miRNA與胰腺癌的診斷

盡管在發(fā)展成浸潤性癌前有一個潛伏期，但目前仍未在此“潛伏期”內(nèi)找到特異性生物標志物用于胰腺癌的早期篩查和診斷。大多數(shù)患者確診時已為胰腺癌晚期或已發(fā)生轉移，喪失了最佳的治療時機。因此，尋找適合胰腺癌早期診斷的生物標志物具有重要意義。近年來，外泌體miRNA成為許多學者尋找胰腺癌早期診斷生物標志物的著眼點。外泌體具有以下優(yōu)點：①體內(nèi)游離分子在細胞外會迅速分解，而外泌體能以一種相對穩(wěn)定的形式在體內(nèi)轉運細胞內(nèi)的生物分子。②廣泛存在于體液中，取樣簡單、價廉且為非侵入性，基本上無風險。③外泌體是反映腫瘤細胞獨特分子機制的窗口，其內(nèi)攜帶大量核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)成分，均可能成為潛在的生物標志物用于胰腺癌的早期篩查和診斷。這些成分中核酸性質(zhì)較穩(wěn)定且具有特異性，其中miRNA適宜作為候選生物標志物。④外泌體中的miRNA高度富集。

Goto等[26]將29例胰腺中重度導管不典型增生患者、32例胰腺癌患者和22例正常人血清中的外泌體miRNA進行對比研究，用二代測序的方法分析三組人群外泌體miRNA的變化。結果顯示，在胰腺中重度導管不典型增生和胰腺癌患者中血清外泌體miR-191、miR-21、miR-451a水平均顯著升高，說明這三項指標在胰腺癌及其癌前病變中均呈升高趨勢，可能成為胰腺癌早期診斷的候選生物標志物。但上述研究發(fā)現(xiàn)三組人群間循環(huán)miR-191、miR-21、miR-451a水平比較差異無統(tǒng)計學意義，表明在胰腺癌的早期診斷中外泌體miRNA可能較循環(huán)miRNA更適合作為生物標志物。目前公認的胰腺癌診斷的生物標志物只有癌胚抗原和糖類抗原19-9，然而兩者僅在晚期胰腺癌中升高。上述研究中的三組人群以血清癌胚抗原和糖類抗原19-9水平作為參照，利用受試者工作特征曲線分別分析外泌體miR-191、miR-21和miR-451a的診斷效能，發(fā)現(xiàn)這3種外泌體miRNA均可能成為胰腺癌早期診斷的生物標志物。

2.1外泌體miR-191 miR-191是一種由22個堿基組成的非編碼RNA。miR-191及其宿主基因含反密碼子結合域3在人類第3號染色體短臂上，基因定位為3p21.31。外泌體miR-191在多種惡性腫瘤中表達上調(diào)，被認為是致癌基因。在肝癌中，miR-191可抑制T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3的表達，促進上皮-間充質(zhì)轉化的過程，進而促進肝癌的發(fā)生[27]；在胃癌中，miR-191可作用于靶基因N-去乙?；?N-磺基轉移酶1，從而促進胃癌細胞的生長并抑制其凋亡。在胰腺癌慢性缺氧條件下，缺氧誘導因子-1α在胰腺癌細胞中高表達，可在miR-191的5′端側面區(qū)域與缺氧反應元素5結合并啟動miR-191的轉錄，使miR-191在胰腺癌組織中的表達明顯升高，使胰腺癌細胞外泌體中的miR-191隨之升高。外泌體miR-191可以調(diào)控細胞的侵襲和分化，誘導細胞外基質(zhì)的形成，促進胰腺癌的發(fā)生與轉移，其表達水平與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結轉移、神經(jīng)浸潤密切相關，可能成為胰腺癌早期診斷的生物標志物[28]。

2.2外泌體miR-21 miR-21定位于17q23.2染色體FRA17B脆性區(qū)域上，部分與液泡膜蛋白1基因存在重疊編碼，因此其表達水平增高與腫瘤的發(fā)生有一定關系。此外，17q染色體區(qū)域的擴增與多種惡性腫瘤密切相關。外泌體miR-21在乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、彌漫大B細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、髓母細胞瘤、胰腺癌等惡性腫瘤中被證實為致癌基因，其表達增加將促進腫瘤細胞的增殖、浸潤和轉移[29]。外泌體miR-21常以腫瘤抑制基因為靶基因，通過下調(diào)靶基因的表達而促進腫瘤的發(fā)展[30]。這些靶基因包括異質(zhì)核糖核酸蛋白K、程序性死亡蛋白4、金屬蛋白酶組織抑制物-3、腫瘤相關蛋白63等。在胰腺癌中，外泌體miR-21通過下調(diào)靶基因程序性死亡蛋白4、金屬蛋白酶組織抑制物-3等腫瘤抑制基因，促進細胞的增殖，導致胰腺癌的惡化。反之，在小鼠移植瘤模型中，抑制miR-21的表達不利于腫瘤細胞的存活和腫瘤的生長。臨床研究發(fā)現(xiàn)，miR-21水平在侵襲性的胰腺腫瘤組織中最高，非侵襲性的胰腺腫瘤組織中次之，正常胰腺組織中最低，三者比較差異有統(tǒng)計學意義。因此，外泌體miR-21可能成為胰腺癌早期診斷的生物標志物。

2.3外泌體miR-451a miR-451a定位于染色體17q11.2上。目前miR-451a在人類惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚不明確。大部分研究(如對卵巢癌、胃癌、非小細胞肺癌、頭頸部鱗癌的研究)提示miR-451a是抑癌基因[31-32]，少數(shù)研究(如對膠質(zhì)瘤等的研究)提示其有促癌作用[33]。如低miR-451表達水平與非小細胞肺癌患者較短的總生存期相關；在動物實驗中，miR-451可通過增強細胞凋亡，顯著抑制裸鼠非小細胞肺癌細胞體外增殖、集落形成和腫瘤的發(fā)生[31]。而在膠質(zhì)瘤中結論相反，miR-451促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖和遷移。因此，miR-451a對胰腺癌的作用及其是否適合作為胰腺癌早期診斷的生物標志物還需要更多的研究進行驗證。

3 外泌體miRNA與胰腺癌的治療

細胞毒素常規(guī)用于可手術切除或不可手術切除胰腺癌患者的治療，然而僅有少數(shù)患者對治療有反應；對其他治療方法進行大量探索后仍難以找到對胰腺癌行之有效的治療方法。如吉西他濱和基于吉西他濱的聯(lián)合化療是胰腺癌的標準療法，但僅對24%的患者有效，且中位生存時間僅5～7個月[34-36]。深入研究外泌體miRNA可能為胰腺癌的治療提供新思路。

3.1外泌體miR-125b miR-125b包括miR-125b-1和miR-125b-2，其中染色體11q23位點形成miR-125b-1，染色體21q2位點形成miR-125b-2。miR-125b能激活免疫細胞，主要表現(xiàn)：①巨噬細胞中若miR-125b過表達，則可抑制干擾素調(diào)節(jié)因子4的表達，從而強化巨噬細胞的免疫能力；②miR-125b可調(diào)控免疫系統(tǒng)中轉錄因子的表達，如調(diào)控T淋巴細胞中ETS-1(ETS proto-oncogene 1)和信號轉導及轉錄激活因子3轉錄因子的表達。Su等[37]使用納米顆粒運載系統(tǒng)將miR-125b-2轉染給胰腺癌細胞株(Panc 1)，并將其與巨噬細胞共培養(yǎng)，結果顯示，胰腺癌細胞株分泌的外泌體成分發(fā)生改變，富于miR-125b-2；外泌體中的miR-125b-2通過細胞間通訊機制作用于共培養(yǎng)的巨噬細胞，導致巨噬細胞由M2型變?yōu)镸1型(也稱為經(jīng)典的活化巨噬細胞)，從而獲得更強的免疫功能，改變腫瘤的微環(huán)境，發(fā)揮抗腫瘤的作用。因此，選擇性調(diào)控胰腺癌細胞外泌體內(nèi)容物中的miRNA(如miR-125b-2)，可能通過免疫途徑實現(xiàn)胰腺癌的基因治療。

3.2外泌體miR-146a miR-146a基因定位于第5號染色體LOC285628基因的第二個外顯子區(qū)(Chr.5q34)。前體miR-146a具有典型的莖環(huán)結構，靠近5′端被加工成熟即為has-miR-146a-5p，簡稱miR-146a。miR-146a主要調(diào)節(jié)免疫和炎癥，但也參與腫瘤的調(diào)控。在纖維間質(zhì)比較稠密、成纖維細胞數(shù)目超過上皮細胞數(shù)目的胰腺癌患者中常發(fā)生化療耐藥。這是因為腫瘤相關成纖維細胞對胰腺癌細胞發(fā)揮保護作用，使其免于細胞毒性化療藥物(如吉西他濱)的殺傷。在用吉西他濱進行治療時，腫瘤相關成纖維細胞會產(chǎn)生含有大量miR-146a的外泌體，后者使吉西他濱抵抗蛋白大量產(chǎn)生，因此導致胰腺癌細胞的廣泛耐藥。Massoumi等[38]在體外實驗中，聯(lián)合使用外泌體釋放抑制劑和吉西他濱作用于腫瘤相關成纖維細胞，發(fā)現(xiàn)其無法誘導胰腺癌細胞吉西他濱耐藥，最終導致胰腺癌細胞的存活率降低。因此，局部使用外泌體釋放抑制劑能間接減少來自外泌體的miRNA，可能有助于胰腺癌的治療。

4 外泌體miRNA與胰腺癌的預后

與其他惡性腫瘤一樣，在胰腺癌中，外泌體通過轉運miRNA引起遠隔細胞之間遺傳信息的交流，從而造成受體細胞遺傳信息的變化，促進腫瘤增殖，并進一步引起腫瘤細胞耐藥、免疫逃逸等現(xiàn)象，從而影響胰腺癌預后。例如，化療耐藥胰腺癌細胞可通過外泌體miRNA的轉運，將化療耐藥性從化療耐藥胰腺癌細胞傳播給化療敏感胰腺細胞，從而引起胰腺癌細胞的廣泛耐藥[39]。外泌體miRNA通過阻礙淋巴細胞的活化、降低其功能等多種機制造成胰腺癌細胞的免疫逃逸。

4.1外泌體miR-155 miR-155基因定位于染色體21q21，屬于B細胞整合簇基因，由其第3個外顯子內(nèi)的高度保守區(qū)域編碼。miR-155可由活化的B細胞、T細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等產(chǎn)生，其表達水平主要受B細胞整合簇基因的轉錄情況影響。若B細胞整合簇基因過表達，則miR-155的表達水平也相應升高，從而促進細胞的異常增殖。大量研究表明，miR-155的表達和功能異常與胰腺癌的進展和預后有關[40]。目前認為其可能的機制主要包括：①miR-155可抑制叉頭框蛋白O3a轉錄因子的表達，并降低超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的水平，因此顯著提高胰腺癌細胞的增殖能力；②miR-155可抑制細胞因子信號轉導抑制因子3基因的表達，同時增加Janus激酶2和信號轉導及轉錄激活因子3基因的表達，從而提高胰腺癌細胞的增殖能力、減少胰腺癌細胞的凋亡；③miR-155可以抑制吉西他濱代謝的關鍵酶，并通過外泌體從供體細胞向受體細胞靶向轉運，使其在胰腺癌細胞間交換，從而導致胰腺癌細胞的普遍耐藥[41]。

4.2外泌體miR-212 miR-212基因定位于染色17p13.3，其表達異常與結腸癌、肺癌、胰腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生密切相關。在胰腺癌中，miR-212的表達顯著升高。在胰腺癌中，外泌體miR-212能特異性地下調(diào)樹突狀細胞中的調(diào)控因子X相關蛋白，而調(diào)控因子X相關蛋白是形成主要組織相容性復合體Ⅱ的關鍵轉錄因子。調(diào)控因子X相關蛋白的下調(diào)導致主要組織相容性復合體Ⅱ的轉錄減少，直接影響樹突狀細胞將抗原呈遞給T細胞的能力，即導致樹突狀細胞的抑制[38]和胰腺癌細胞的免疫逃逸。

4.3外泌體miR-203 miR-203位于染色體14q32.33位點，此位點屬于不穩(wěn)定脆性區(qū)域。在RNA聚合酶的作用下，細胞核內(nèi)的RNA首先形成轉錄原始體(pri-miR-203)。該轉錄原始體在Drosha酶的作用下被剪切成發(fā)夾狀的miRNA前體(pre-miR-203)。miR-203前體被miRNA運輸?shù)鞍?轉運到細胞質(zhì)中，隨后經(jīng)過剪切、解離以及不成熟的反義鏈降解消失等步驟，最終形成成熟的miR-203。在胰腺癌中，外泌體來源的miR-203既能降低Toll樣受體4的表達，也能減少細胞因子的表達(如樹突狀細胞產(chǎn)生的腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-12)；而采用miR-203缺失的外泌體進行實驗，則得到相反的結果[39]。說明外泌體miR-203可能導致樹突狀細胞的功能降低，從而進一步引起胰腺癌細胞的免疫逃逸。

4.4外泌體miR-196a miR-196a基因含兩個亞型，其中miR-196a-1基因位于染色體17q21.32上同源盒基因(homeobox genes,HOX)B9和HOXB10基因之間的位點，miR-196a-2基因位于染色體12q13.13上HOXC10和HOXC9之間的位點。位于微小雜合性缺失區(qū)、微小擴增區(qū)、斷點區(qū)等不穩(wěn)定位點的miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切。HOX家族的基因座屬于不穩(wěn)定位點，因此位于其上的miR-196a基因與腫瘤關系密切，可能具有促進腫瘤生長和抗凋亡的功能。外泌體miR-196a的表達與胰腺癌的臨床病理分期和生存期密切相關，使其成為胰腺癌潛在的預后標志物。與Ⅰ、Ⅱ期胰腺癌患者相比，Ⅲ、Ⅳ期胰腺癌患者外泌體中miR-196a升高的比例更高[38]。此外，外泌體miR-196a水平還與胰腺癌患者的生存期呈負相關[15]。

5 結 語

胰腺癌是一種缺乏早期診斷生物標志物、治療難度較大、預后不良的高度惡性腫瘤。近年來對外泌體miRNA的廣泛研究為胰腺癌的診療提供了新思路。外泌體miRNA是體內(nèi)miRNA存在的一種重要形式。由于外泌體中含有高度富集、穩(wěn)定存在的miRNA，使其在胰腺癌的診斷、治療和預后中具有重要的臨床意義。外泌體miRNA一方面可能為胰腺癌的早期診斷提供潛在生物標志物，另一方面可能為胰腺癌的治療提供新方法。如以外泌體為載體攜帶腫瘤抑制性miRNA，或抑制含腫瘤促進性miRNA外泌體的釋放，均有可能達到提高胰腺癌療效的目的。此外，外泌體miRNA還可能通過預測腫瘤的耐藥性和免疫逃逸情況，為胰腺癌的預后提供判斷依據(jù)。