李彥霖，郁葉，郭婷莉，易鑫堯，張萌，陳莉娜

(西安交通大學(xué) a.第一臨床醫(yī)學(xué)院， b.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，西安 710061)

核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是體內(nèi)一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)多種抗炎和抗氧化基因的表達(dá)，在機(jī)體的損傷應(yīng)答反應(yīng)中居核心地位；血紅素加氧酶(heme oxygenase，HO)-1是血紅素分解代謝過(guò)程中的限速酶，可降解血紅素為一氧化碳(carbon monoxide,CO)、膽綠素和鐵離子(Fe2+)，是Nrf2發(fā)揮抗炎和抗氧化作用的重要媒介[1-2]。Nrf2與HO-1構(gòu)成的信號(hào)通路參與多種組織器官的炎癥相關(guān)病理過(guò)程。而促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是細(xì)胞外信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者，可被氧化應(yīng)激及多種促炎因子激活，廣泛參與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)傳遞過(guò)程，對(duì)Nrf2/HO-1通路具有激活和表達(dá)調(diào)節(jié)的作用[3]。目前國(guó)內(nèi)外已有大量關(guān)于Nrf2/HO-1與MAPK相互作用的研究，但由于細(xì)胞和組織類型的不同以及損傷和保護(hù)性藥物的不同而呈現(xiàn)多樣化的結(jié)果。盡管Nrf2/HO-1與MAPK信號(hào)通路存在相互作用，但不同的MAPK與Nrf2/HO-1之間、Nrf2的多種細(xì)胞內(nèi)作用與MAPK之間以及一些其他分子在MAPK與Nrf2/HO-1信號(hào)通路間所起的作用目前尚不明確。現(xiàn)就氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)中Nrf2/HO-1與MAPK的相關(guān)性予以綜述。

1 Nrf2/HO-1信號(hào)通路概述

1.1Nrf2的結(jié)構(gòu)和功能 Nrf2是一種廣泛存在于各種組織細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子，具有氧化還原敏感性，可調(diào)控多種細(xì)胞保護(hù)性基因的應(yīng)激誘導(dǎo)激活[4-5]。Nrf2主要有7個(gè)高度保守的環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白同源結(jié)構(gòu)域(Nrf2 epichlorohydrin homology，Neh)：Neh1區(qū)與核內(nèi)小肌腱膜的纖維肉瘤(small musculo aponeurotic fibrosarcoma，Maf-S)蛋白形成異二聚體，識(shí)別并結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)上的相關(guān)序列；Neh2區(qū)是Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1)依賴的調(diào)節(jié)區(qū)，而Neh6區(qū)是非Keap1依賴的調(diào)節(jié)區(qū)；Neh3區(qū)是一個(gè)反式激活結(jié)構(gòu)域；Neh4和Neh5區(qū)結(jié)合環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白參與Nrf2轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控；Neh7參與類視黃醇X受體α的結(jié)合[6]。Keap1是一種富含硫醇的蛋白質(zhì)，錨定在細(xì)胞骨架的肌動(dòng)蛋白上，被親電分子修飾后失活，生理狀態(tài)下，Keap1可促進(jìn)Nrf2的泛素化和最終降解[4,6]。

1.2HO-1的結(jié)構(gòu)和功能 在哺乳動(dòng)物中，HO家族由兩種酶組成，即HO-1基因編碼的HO-1和HO-2基因編碼的HO-2[2]。HO基因家族可保護(hù)細(xì)胞免受多種應(yīng)激刺激損傷(病原體、傷害、壓力和功能失調(diào)等)，是重要的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制之一[7]。HO-1的表達(dá)受多種內(nèi)源性和外源性因素誘導(dǎo)，包括血紅素、紫外線照射、細(xì)菌脂多糖、氧化應(yīng)激、缺氧、多種促炎因子及人工誘導(dǎo)劑(如血晶素)等，主要功能是降解血紅素為CO、膽綠素和Fe2+[2,8]。血紅素具有潛在的促炎和促氧化作用，而CO等酶解產(chǎn)物普遍具有抗炎和抗氧化作用[9]。

除酶解作用外，HO-1還與細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路相互影響，這些信號(hào)通路可上調(diào)或下調(diào)HO-1的表達(dá)水平，同時(shí)HO-1又通過(guò)這些信號(hào)通路發(fā)揮激活抗氧化基因表達(dá)及抑制促炎因子合成等細(xì)胞保護(hù)作用，而這種作用可能是獨(dú)立于其酶解反應(yīng)活性[10-11]。以往研究表明，HO-1與其他多種分子形成的信號(hào)軸在肝、腎、動(dòng)脈等多種器官的炎癥反應(yīng)和纖維化進(jìn)程中扮演重要角色，且這一作用離不開HO-1與巨噬細(xì)胞的密切聯(lián)系[12-14]。

1.3Nrf2對(duì)HO-1表達(dá)的調(diào)控及意義 HO-1是受Nrf2調(diào)節(jié)的最重要的基因之一，在細(xì)胞中發(fā)揮重要的抗炎、抗氧化調(diào)節(jié)作用。通常Nrf2與Keap1結(jié)合于胞質(zhì)內(nèi)并處于抑制狀態(tài)，ARE與Maf-S結(jié)合于核內(nèi)處于失活狀態(tài)；在應(yīng)激條件下，胞外氧化劑刺激使Nrf2磷酸化或Keap1-SH基團(tuán)修飾而促進(jìn)Nrf2與Keap1的解離；Nrf2與Keap1解離后，聚集在核內(nèi)與Maf-S形成異二聚體，并與ARE結(jié)合，Nrf2/ARE導(dǎo)致核基因易位并誘導(dǎo)其下游抗氧化酶(HO-1等)高表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎、抗氧化作用[1,15-16]。在藥物研發(fā)中，Keap1-Nrf2蛋白-蛋白相互作用已成為一個(gè)重要的靶點(diǎn)，多種間接的親電性抑制劑(如姜黃素和蘿卜硫素)和直接的非共價(jià)抑制劑(如一些多肽抑制劑)通過(guò)Keap1-Nrf2蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用上調(diào)ARE控制的細(xì)胞保護(hù)性氧化應(yīng)激反應(yīng)酶的表達(dá)，從而發(fā)揮治療作用[17]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，Nrf2/HO-1級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)肺、腎、肝、結(jié)腸、血管內(nèi)皮等組織器官以及糖尿病、缺血再灌注損傷等病理生理過(guò)程中的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)均具有顯著的抑制效果，當(dāng)Nrf2/HO-1表達(dá)上調(diào)時(shí)，活性氧類、促炎因子等顯著減少[18]。川芎嗪等藥物可通過(guò)增加Nrf2的核轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)HO-1在組織中的表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[19]。Amata等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2/HO-1在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的早產(chǎn)兒肺損傷反應(yīng)中被激活，誘導(dǎo)一定數(shù)量的抗氧化、抗炎信號(hào)分子表達(dá)，從而發(fā)揮抗損傷作用，這可能較激活單個(gè)抗氧化基因更有效。然而，Nrf2/HO-1的抗炎、抗氧化作用并不總是對(duì)機(jī)體有利。有研究表明，Nrf2和HO-1過(guò)量表達(dá)可成為癌癥發(fā)生、發(fā)展的促進(jìn)因素，Nrf2與HO-1作為胰腺癌、前列腺癌、肝癌等多種腫瘤標(biāo)志物的作用已受到關(guān)注[21]。Nrf2/HO-1在癌癥中發(fā)揮的作用可能與HO-1酶解產(chǎn)物的抗氧化、抗凋亡和免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)；同時(shí)，Nrf2/HO-1通路獨(dú)立于酶活性以外的核水平上的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能也起重要作用，該作用可能會(huì)抑制機(jī)體對(duì)癌細(xì)胞的控制和清除[21-22]。

2 MAPK概述

目前研究較多的MAPK有p38、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)和c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)三個(gè)亞群。p38是一種應(yīng)激激活的蛋白激酶，磷酸化p38是其活化狀態(tài)。目前已發(fā)現(xiàn)4種p38異構(gòu)體，分別為p38α、p38β、p38γ和p38δ。p38α在機(jī)體內(nèi)廣泛表達(dá)，其他p38亞型的表達(dá)具有組織特異性，通常p38特指p38α[23-24]。臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，p38信號(hào)通路在炎癥和免疫反應(yīng)中扮演重要角色，下調(diào)p38分子表達(dá)水平可有效抑制脂肪細(xì)胞肥大和炎癥反應(yīng)的發(fā)展，并抑制組織纖維化進(jìn)程，而p38抑制劑可產(chǎn)生相反的作用，但此作用仍存在一定的爭(zhēng)議[24-26]。ERK包含8種亞型，具有相同的活化模體蘇氨酸-谷氨酸-酪氨酸，ERK1/2是ERK八種亞型的原型，在MAPK/ERK1/2催化下，活化模體中的酪氨酸和蘇氨酸被磷酸化而激活，而活化的ERK可磷酸化核內(nèi)多種信號(hào)通路的蛋白質(zhì)[3,27]。JNK又被稱為應(yīng)激活化蛋白激酶，JNK1和JNK2在全身廣泛表達(dá)，JNK3的表達(dá)具有組織特異性[3]。氧化反應(yīng)、滲透壓力以及促炎細(xì)胞因子等均可促進(jìn)JNK活化，活化的JNK介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可以促進(jìn)癌癥的發(fā)生[3,28]。

3 MAPK對(duì)Nrf2/HO-1信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用

3.1p38對(duì)Nrf2/HO-1通路的調(diào)節(jié)作用 p38促進(jìn)Nrf2/HO-1激活和表達(dá)的可能機(jī)制為：p38磷酸化Nrf2，使其與胞質(zhì)中的Keap1分離，從而促進(jìn)Nrf2的活化[29-31]。此外，這一調(diào)節(jié)作用也可能與p38促進(jìn)相關(guān)蛋白質(zhì)的核轉(zhuǎn)移、保護(hù)Nrf2免受降解有關(guān)[32]。p38特異性抑制劑通過(guò)抑制p38磷酸化而阻止Keap1的降解和Nrf2的核易位以及隨后HO-1的誘導(dǎo)表達(dá)[29]。但也有研究表明，抑制p38不改變Nrf2的核豐度以及與DNA結(jié)合的能力，p38和Nrf/HO-1通路在氧化應(yīng)激過(guò)程中可能是平行誘導(dǎo)激活[33]。Sun等[34]發(fā)現(xiàn)，抑制p38活化對(duì)Nrf2表達(dá)的影響不顯著，但對(duì)HO-1的誘導(dǎo)表達(dá)有劑量依賴性的抑制作用，故認(rèn)為p38活化雖不是穩(wěn)定Nrf2所必需，但HO-1的誘導(dǎo)表達(dá)卻與其緊密關(guān)聯(lián)，即p38活化可能是Nrf2轉(zhuǎn)錄激活HO-1所必需的。這些不一致的結(jié)果可能與p38在細(xì)胞內(nèi)扮演多種角色有關(guān)。已知超過(guò)100種蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子等蛋白質(zhì)可以直接被p38磷酸化，即一方面p38可以通過(guò)某些信號(hào)分子通路誘導(dǎo)抗炎、抗氧化因素的上調(diào)，另一方面又通過(guò)其他方式發(fā)揮促進(jìn)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的作用，不同的刺激因素和不同的組織細(xì)胞對(duì)p38和Nrf/HO-1通路平衡的影響不同[24]。同時(shí)還應(yīng)注意，一些藥物在發(fā)揮抗炎特性時(shí)，表現(xiàn)出對(duì)p38活化的抑制以及對(duì)Nrf2核轉(zhuǎn)移和HO-1表達(dá)的促進(jìn)，提示應(yīng)激反應(yīng)中其他通路對(duì)Nrf2/HO-1的調(diào)控也會(huì)影響最終效應(yīng)，甚至在某些情況下較p38更為重要[35]。

3.2ERK和JNK對(duì)Nrf2/HO-1通路的調(diào)節(jié)作用 較高的ERK活性往往伴隨促炎基因、過(guò)氧化物酶體脂肪酸氧化以及損傷反應(yīng)自噬通量標(biāo)志物的表達(dá)增強(qiáng)，磷酸化的ERK是ERK的活化形式，下調(diào)磷酸化的ERK和Nrf2的表達(dá)水平可以預(yù)防氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)相關(guān)疾病[36-38]。但也有研究表明，在氧化應(yīng)激中，ERK水平顯著降低，而藥物在改善組織損傷時(shí)表現(xiàn)出促進(jìn)ERK活化和Nrf2核轉(zhuǎn)移的作用，總Nrf2同時(shí)增加，HO-1的表現(xiàn)與Nrf2一致[32,36]。ERK抑制劑和Nrf2小干擾RNA可以顯著逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)，從另一方面支持了以上結(jié)果[39]。ERK1/2抑制劑可顯著抑制槲皮素誘導(dǎo)的Nrf2和HO-1的表達(dá)，表明ERK1/2活化對(duì)于Nrf2的穩(wěn)定及HO-1轉(zhuǎn)錄的后續(xù)激活是必需的[34]。

在心肌細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞以及SH-SY5Y、BV-2等細(xì)胞系中JNK活化，可促進(jìn)Nrf2磷酸化和核轉(zhuǎn)移以及HO-1表達(dá)，發(fā)揮抗炎、抗氧化及抗細(xì)胞凋亡作用，而JNK抑制劑可顯著抑制這一效應(yīng)[32,40-42]。珊瑚木苷可通過(guò)促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)移抑制JNK活性，Nrf2沉默可不完全逆轉(zhuǎn)雷公藤甲素誘導(dǎo)的磷酸化JNK表達(dá)增加，減弱珊瑚木苷對(duì)氧化應(yīng)激的抑制，這與Nrf2調(diào)節(jié)抗氧化酶表達(dá)、抑制活性氧類產(chǎn)生有關(guān)[43]?？梢?，Nrf2與JNK之間具有復(fù)雜的相互作用，可能還有其他分子參與調(diào)節(jié)。目前關(guān)于ERK與JNK對(duì)Nrf2/HO-1信號(hào)通路調(diào)控的研究較少，具體機(jī)制仍不明確。

3.3p38、ERK、JNK三者對(duì)Nrf2/HO-1通路調(diào)節(jié)作用的比較 研究表明，p38、ERK1/2、JNK三者可協(xié)同激活Nrf2/HO-1通路，分別應(yīng)用阻斷劑均可顯著抑制Nrf2核轉(zhuǎn)移并降低HO-1的表達(dá)水平，而Nrf2又可通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)影響JNK活化(圖1)[32,34,41]。然而，在某些情況下，MAPK的作用可能不完全相同，甚至相反。Ahn等[44]研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2核轉(zhuǎn)移增強(qiáng)時(shí)，p38、ERK和JNK的磷酸化均增強(qiáng)，但分別給予三者的抑制劑后，p38抑制劑對(duì)Nrf2的影響最小。仙鶴草內(nèi)酯和去甲基仙鶴草內(nèi)酯雖不改變p38、ERK、JNK的比例，但可促進(jìn)ERK、JNK的磷酸化，抑制p38的磷酸化，并提高Nrf2/Keap1比值以及HO-1的表達(dá)[35]。在(+)-落葉松樹脂醇(lariciresinol，LRSL)抗氧化性能的研究中，將p38和ERK特異性抑制劑用于LRSL處理的細(xì)胞中，p38抑制劑組LRSL誘導(dǎo)的核Nrf2豐度和HO-1表達(dá)增加均受到抑制，而ERK抑制劑組的變化卻不明顯，提示可能只有p38參與了LRSL誘導(dǎo)的Nrf2/HO-1的激活[45]。此外，p38和JNK抑制劑均可顯著抑制砷誘導(dǎo)HO-1表達(dá)的效應(yīng)，ERK抑制劑則無(wú)顯著效應(yīng)[46]。這些結(jié)果提示，刺激因素和應(yīng)答組織不同，可能對(duì)不同MAPK的活化具有不同作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。在漢黃芩素抗軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)中，Nrf2/HO-1被激活，但p38、ERK、JNK均未發(fā)生變化，提示除MAPK外還有其他機(jī)制影響Nrf2和HO-1的表達(dá)[47]。MAPK對(duì)HO-1的影響很可能并非單方面的，而存在反饋?zhàn)饔没蛳嗷プ饔?。血晶素是常用的HO-1誘導(dǎo)劑，鋅原卟啉-Ⅸ是HO-1的抑制劑。在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肺巨噬細(xì)胞炎癥模型中，血晶素組p38 MAPK表達(dá)水平顯著升高，而HO-1抑制劑鋅原卟啉-Ⅸ組的結(jié)果相反；但也有研究得出不一致的結(jié)果，提示不同條件下HO-1對(duì)MAPK的影響也不盡相同[48-49]。目前血晶素和鋅原卟啉-Ⅸ對(duì)HO-1的作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

MAPK：促分裂原活化的蛋白激酶；Nrf2：核因子E2相關(guān)因子2；HO-1：血紅素加氧酶1

4 HO-1酶解產(chǎn)物CO與MAPK信號(hào)通路的相關(guān)性

HO-1降解血紅素的過(guò)程是體內(nèi)CO的最主要來(lái)源。CO具有調(diào)節(jié)促炎和抗炎細(xì)胞因子表達(dá)的作用，參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[50]。CO可促進(jìn)白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-10等抗炎因子釋放，抑制IL-6、IL-1β等促炎因子釋放，發(fā)揮抗炎、抗氧化作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，HO-1/CO組成機(jī)體重要的內(nèi)源性保護(hù)系統(tǒng)，參與體內(nèi)多種生理和病理過(guò)程，包括調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能、減少活性氧類的產(chǎn)生、減輕細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化損傷等[50]。

CO釋放分子(carbon monoxide-releasing molecule，CORM)是一類可以穩(wěn)定釋放CO的化合物，不同的CORM對(duì)不同MAPK的影響不同。研究發(fā)現(xiàn)，CORM-2通過(guò)激活p38和ERK1/2分子，CORM-3通過(guò)激活JNK/激活蛋白-1通路，最終促進(jìn)HO-1基因的表達(dá)[51-52]。CORM ALF-186可活化p38，抑制ERK1/2磷酸化，對(duì)JNK無(wú)顯著影響；此外，CORM也對(duì)Nrf2有一定的作用[53]。CORM A-1可提高肝中毒模型中Nrf2信使RNA和蛋白水平，并與Keap1的Kech域結(jié)合，最終促進(jìn)Nrf2的核轉(zhuǎn)移和ARE相關(guān)基因的表達(dá)，同時(shí)體內(nèi)產(chǎn)生的CO對(duì)自身Nrf2/HO-1通路可能有一定的正反饋?zhàn)饔肹54]。但體內(nèi)HO-1酶解作用所產(chǎn)生的CO是否具有相同的作用，仍需更為直接的證據(jù)支持。

5 小 結(jié)

氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，影響疾病預(yù)后，是許多疾病治療的關(guān)鍵。MAPK和Nrf2/HO-1信號(hào)通路在機(jī)體的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)關(guān)鍵位置，兩者的相互作用影響氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展。在氧化應(yīng)激或其他損傷作用刺激下，機(jī)體產(chǎn)生IL等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可激活MAPK分子，促進(jìn)Nrf2轉(zhuǎn)移，從而上調(diào)HO-1的表達(dá)，而HO-1降解血紅素的產(chǎn)物CO可能對(duì)多種MAPK具有調(diào)節(jié)作用。通過(guò)這一系列反應(yīng)，機(jī)體內(nèi)最終達(dá)到氧化和抗氧化、促炎和抗炎反應(yīng)的平衡。但在不同刺激因素下和不同的組織細(xì)胞中，這些分子間的作用并不完全一致。雖然目前已有大量研究在探討不同刺激因素和細(xì)胞類型因素影響下這些關(guān)鍵分子的變化，但具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。