邢婉麗，劉瑩瑩，王會(huì)麗，李尚霖，林勇平，陳蕾，趙艷，晁爽，黃小蘭，葛少林，鄧濤，趙添，李寶蓮，王瀚博，王磊，宋云鵬，金榮華，何建行，趙秀英，劉鵬，李為民，程京a,,*

a Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, Beijing 100084, China

b National Engineering Research Center for Beijing Biochip Technology, Beijing 102206, China

c CapitalBio Technology, Beijing 101111, China

d CapitalBio Corporation, Beijing 102206, China

e Department of Basic Medical Sciences, School of Medicine, Tsinghua University, Beijing 100084, China

f Department of Laboratory Medicine, First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510120, China

g Department of Neurology, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China

h Clinical Laboratory Center, Beijing Youan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100069, China

i Department of Pediatrics, Beijing Tsinghua Changgung Hospital, School of Clinical Medicine, Tsinghua University, Beijing 102218, China

j Experiment Center, Capital Institute of Pediatrics, Beijing 100020, China

k President’s Office, Beijing Youan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100069, China

l Department of Cardiothoracic Surgery, State Key Laboratory of Respiratory Disease, China Clinical Research Center for Respiratory Disease, Guangzhou Institute of Respiratory Health, First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510120, China

m Department of Clinical Laboratory, Beijing Tsinghua Changgung Hospital, School of Clinical Medicine, Tsinghua University, Beijing 102218, China

n Department of Respiratory and Critical Care Medicine, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China

1. 引言

由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）引起的新冠病毒肺炎（COVID-19）正在全球范圍內(nèi)迅速傳播[1]。盡管很多國(guó)家采取了嚴(yán)格的控制措施，截至2020年6月26日，仍有188個(gè)國(guó)家和地區(qū)報(bào)道了共947萬(wàn)COVID-19確診病例和約48萬(wàn)死亡病例。目前針對(duì)COVID-19尚無(wú)有效的藥物或疫苗，因此，對(duì)感染SARS-CoV-2的患者進(jìn)行快速診斷和隔離被認(rèn)為是抑制大流行繼續(xù)發(fā)展的最有效的方法。不幸的是，COVID-19與流感和感冒有許多共同癥狀，如發(fā)燒、干咳、肌痛或疲勞[2]。因此，在抵抗COVID-19的過(guò)程中，急需能夠?qū)⑿鹿诓《九c其他常見(jiàn)呼吸道病毒區(qū)分開(kāi)來(lái)的可靠的診斷工具。到目前為止，大量基于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法的核酸檢測(cè)試劑盒被開(kāi)發(fā)出來(lái)，它們?cè)贑OVID-19的臨床診斷中發(fā)揮著核心作用[3,4]。但是，這些基于RT-PCR方法的檢測(cè)通常耗時(shí)長(zhǎng)，且只能檢測(cè)SARS-CoV-2，并且有時(shí)會(huì)出現(xiàn)由于采樣或靈敏度問(wèn)題導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。在臨床治療中，如果對(duì)使用RT-PCR試劑盒測(cè)試結(jié)果為SARS-CoV-2陰性，但持續(xù)帶有COVID-19癥狀的患者治療不當(dāng)，不但會(huì)消耗大量寶貴的醫(yī)療資源，而且會(huì)極大地增加交叉感染風(fēng)險(xiǎn)。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)一款診斷工具，該工具不僅可以快速檢測(cè)SARS-CoV-2，而且還可以準(zhǔn)確檢測(cè)其他常見(jiàn)的呼吸道病毒，如流感病毒、人副流感病毒（HPIV）等[5–7]，以便在SARS-CoV-2檢測(cè)陰性時(shí)可以知道引起癥狀的確切原因。

多重RT-PCR可通過(guò)在單個(gè)試管中加入全部引物實(shí)現(xiàn)對(duì)多種類型病毒的檢測(cè)。但是，由于混合引物之間不可避免的相互干擾作用以及用于檢測(cè)的熒光基團(tuán)的數(shù)量有限，開(kāi)發(fā)魯棒的多重檢測(cè)系統(tǒng)非常困難，且每個(gè)反應(yīng)中能夠檢測(cè)的靶標(biāo)數(shù)量通常少于10個(gè)[8]。最有希望打破此限制的方法之一是通過(guò)物理隔離將不同的引物對(duì)加入指定的腔室中，從而將多重PCR轉(zhuǎn)換為多個(gè)單重PCR。在過(guò)去幾十年中，微流控技術(shù)已發(fā)展成實(shí)現(xiàn)樣品分配而不引入其他人工操作的最常用方法之一。在各種微流控技術(shù)中，相比親疏水結(jié)構(gòu)化修飾技術(shù)[9,10]、滑動(dòng)芯片技術(shù)[11–14]和電介質(zhì)上電潤(rùn)濕技術(shù)（EWOD）[15,16]，基于離心操作的微流控技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、微結(jié)構(gòu)完全封閉、易于集成其他微流控功能[17,18]。我們課題組之前開(kāi)發(fā)了一種基于離心操作的、適用于單通道緊湊型儀器的碟式微流控芯片（每次運(yùn)行僅測(cè)試1個(gè)樣本），并結(jié)合使用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）實(shí)現(xiàn)了對(duì)13種呼吸道致病菌的檢測(cè)，證明了該系統(tǒng)出色的多重檢測(cè)能力[19]。然而，當(dāng)涉及病毒檢測(cè)時(shí)，由于熱循環(huán)和引物設(shè)計(jì)困難，RT-PCR和LAMP都不適合在微流控芯片上使用。盡管其他微流控系統(tǒng)，如FilmArray?和Verigene?也可用于多重病原體檢測(cè)，并具有與樣本處理集成的優(yōu)勢(shì)[20–22]，但是目前還沒(méi)有可以區(qū)分SARSCoV-2與其他呼吸道病毒的微流控系統(tǒng)被報(bào)道。

核酸依賴性擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)（NASBA）是一種基于酶的等溫?cái)U(kuò)增方法，該方法所用試劑主要包括逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H（RNase H）、T7核糖核酸（RNA）聚合酶、兩個(gè)特殊設(shè)計(jì)的引物和一個(gè)特殊設(shè)計(jì)的探針[23,24]。在NASBA起始反應(yīng)階段，引物1退火結(jié)合單鏈RNA，合成轉(zhuǎn)錄脫氧核糖酸（cDNA），并形成RNA:DNA雜合體。隨后，RNase H水解RNA鏈形成單鏈DNA。引物2退火結(jié)合單鏈cDNA后，由逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)一步合成帶有可被T7 RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子區(qū)域的雙鏈DNA [23,24]。一旦生成帶有啟動(dòng)子區(qū)域的雙鏈DNA，反應(yīng)就會(huì)進(jìn)入RNA轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄和水解的連續(xù)循環(huán)過(guò)程[23–25]。由于每次轉(zhuǎn)錄可生成10～1000個(gè)RNA轉(zhuǎn)錄本，因此NASBA反應(yīng)過(guò)程比PCR或LAMP反應(yīng)過(guò)程需要更少的循環(huán)周期，從而減少了總反應(yīng)時(shí)間和出錯(cuò)頻率[23,26]。作為一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，NASBA魯棒性好、特異性強(qiáng)且特別適用于單鏈RNA的檢測(cè)，但并不適用于雙鏈DNA的檢測(cè)[23,27]。

在本研究中，我們介紹了一款滿足高通量和多指標(biāo)的核酸等溫?cái)U(kuò)增分析儀（RTisochipTM-W），該儀器基于我們之前開(kāi)發(fā)的碟式微流控系統(tǒng)，進(jìn)行了兩方面的改進(jìn)。首先，我們使用高效且靈敏的NASBA擴(kuò)增技術(shù)代替了不適合在離心式微流控芯片上對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)的PCR技術(shù)和LAMP技術(shù)[23,26,28,29]。其次，為了提高系統(tǒng)的通量，我們對(duì)儀器進(jìn)行了更新，使其由單通道增加到16個(gè)通道。因此，這種全新的RTisochipTM-W系統(tǒng)能夠在90 min內(nèi)一次性檢測(cè)出16份臨床樣本中包括SARS-CoV-2在內(nèi)的19種常見(jiàn)呼吸道病毒。本研究證明了該系統(tǒng)出色的性能，使我們相信此系統(tǒng)能夠在抗擊COVID-19大流行中發(fā)揮重要的作用。

2. 材料和方法

2.1. 樣本收集和RNA 提取

含有靶標(biāo)病毒序列的質(zhì)粒由上海生工生物工程股份有限公司合成。根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明，使用HiScribe?T7高產(chǎn)RNA合成試劑盒（NEB，美國(guó)）通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄制備RNA模板。滅活的病毒保存液由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的鐘南山院士贈(zèng)送。在患者知情并同意下，于2018—2020年，從北京清華長(zhǎng)庚醫(yī)院、首都兒科研究所、廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、四川大學(xué)華西醫(yī)院和首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院收集臨床樣本。

使用DNA口腔采樣拭子（93050，麥瑞科林，中國(guó)）采集咽拭子樣本，具體操作是通過(guò)旋轉(zhuǎn)拭子尖端以收集咽部脫落細(xì)胞，然后將拭子放入病毒采樣管（MT0301，友康，中國(guó)）中，并將拭子前端浸入病毒保存液幾秒鐘之后，折斷拭子末端，樣本保存于?70 ℃的冰箱。

按照試劑盒操作說(shuō)明，使用TRIzolTM試劑（Invitrogen，美國(guó)）或QIAamp?病毒RNA迷你試劑盒（Qiagen，德國(guó)）提取臨床樣本中的總RNA。根據(jù)用戶操作手冊(cè)，使用KingFisherTMFlex純化系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）進(jìn)行RNA的自動(dòng)化提取。將提取的RNA溶于無(wú)核酸酶水中，并使用Nanodrop 2000或Qubit 3.0（均購(gòu)自美國(guó)的Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行定量。使用含1%甲醛的變性凝膠進(jìn)行RNA完整性的電泳檢測(cè)。

2.2. 引物設(shè)計(jì)和NASBA 反應(yīng)

該系統(tǒng)可檢測(cè)的呼吸道病毒包括SARS-CoV-2（S基因和N基因）、甲型流感病毒（influenza A，如H1N1、H1N1 2009、H3N2、H7N9）、乙型流感病毒（influenza B）、呼吸道合胞病毒（RSV）、人偏肺病毒（HMPV）、人副流感病毒（HPIV1、HPIV2、HPIV3、HPIV4）、人鼻病毒（HRV）、腸病毒71（EV71）、柯薩奇病毒A16（CA16）、柯薩奇病毒A6（CA6）和人冠狀病毒（HCoV-229E/NL63、HCoV-OC43/HKU1）。在芯片上，使用等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)NASBA對(duì)病毒RNA進(jìn)行檢測(cè)。使用Primer Premier v.5.0軟件（Premier Biosoft，美國(guó)）設(shè)計(jì)NASBA引物及探針序列，并由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物和探針的序列在附錄A的表S1中列出。針對(duì)每種病毒的引物和探針序列，進(jìn)行進(jìn)一步的覆蓋度分析，結(jié)果列在附錄A中的補(bǔ)充數(shù)據(jù)2中。通過(guò)下載每種病毒的10個(gè)最新發(fā)布的完整全基因組序列，分析引物及探針的覆蓋度。總體而言，系統(tǒng)中所用的引物和探針具有很好的覆蓋率。例如，對(duì)于H1N1 2019，其引物和探針序列與最新發(fā)布的10個(gè)完整的全基因組序列完全匹配，這表明我們選取的用來(lái)設(shè)計(jì)引物和探針的區(qū)域非常保守。

在芯片上進(jìn)行NASBA反應(yīng)時(shí)，將針對(duì)每個(gè)指標(biāo)所設(shè)計(jì)的1 μL引物和探針的自制溶液加入相應(yīng)的反應(yīng)腔室中，并在室溫下使其完全干燥。檢測(cè)起始，將16.5 μL緩沖溶液、13 μL核糖核苷三磷酸（NTP）溶液、5.5 μL酶混合物（均來(lái)自北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司）和20 μL RNA模板在試管中混勻，共得到55 μL NASBA反應(yīng)混合物，然后使用移液器將其轉(zhuǎn)移到芯片中。

2.3. 微流控芯片的設(shè)計(jì)與運(yùn)行

我們小組先前報(bào)道了一種用于檢測(cè)19種呼吸道病毒的微流控芯片[30,31]。簡(jiǎn)而言之，如圖1（a）所示，碟式微流控芯片的直徑為62 mm，厚度為0.6 mm。它由結(jié)構(gòu)層和通過(guò)雙面膠帶連接的薄覆蓋層組成。結(jié)構(gòu)層包含24個(gè)反應(yīng)腔室（每個(gè)腔室直徑為3 mm，深度為0.2 mm，每個(gè)反應(yīng)腔室的體積為1.45 μL）、24個(gè)緩沖池、一個(gè)正弦形主通道（寬度為0.2 mm，深度為0.1 mm）、入口和出口。每個(gè)反應(yīng)腔室通過(guò)緩沖池和短管連接主通道。結(jié)構(gòu)層材料為聚碳酸酯，通過(guò)精密注塑模具制成，表面光滑，粗糙度小于10 μm。如圖1（b）所示，將每套NASBA引物和探針加入指定的反應(yīng)腔室中并在室溫下進(jìn)行干燥。使用人基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）及其對(duì)應(yīng)的引物作為內(nèi)部對(duì)照（IC），使用釀酒酵母的質(zhì)粒及其相應(yīng)的引物和探針作為陽(yáng)性對(duì)照（PC），使用無(wú)菌無(wú)核酸酶水作為陰性對(duì)照（NC）。完成引物預(yù)固定后，用雙面膠帶將結(jié)構(gòu)層和覆蓋層密封在一起，并用壓力機(jī)進(jìn)行沖壓。單獨(dú)對(duì)每個(gè)芯片進(jìn)行真空包裝，并將其存儲(chǔ)于?20 ℃的冰箱中以備使用。

NASBA的機(jī)制如圖1（c）所示。RTisochipTM-W系統(tǒng)的整個(gè)分析過(guò)程如圖1（d）所示。簡(jiǎn)而言之，在接收咽拭子樣本后，使用商業(yè)化的核酸提取試劑盒從臨床樣本中提取RNA，并與不含有引物和探針的NASBA反應(yīng)混合物混合。然后，將55 μL反應(yīng)混合物通過(guò)入口轉(zhuǎn)移到芯片中，使其填充主通道。之后，將入口和出口用膠帶進(jìn)行密封。將芯片裝入儀器托盤后，單擊控制程序中的開(kāi)始按鈕，系統(tǒng)將自動(dòng)執(zhí)行其余過(guò)程。首先芯片將以6000 r·min?1的速度進(jìn)行旋轉(zhuǎn)：先旋轉(zhuǎn)10 s，然后間隔120 s再旋轉(zhuǎn)30 s，以使反應(yīng)試劑從主通道進(jìn)入24個(gè)反應(yīng)腔室中。接下來(lái)對(duì)微流控芯片進(jìn)行孵育，41 ℃孵育35 min。在此期間，由擴(kuò)增產(chǎn)生的熒光信號(hào)將被檢測(cè)出來(lái)并實(shí)時(shí)顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上。

2.4. 用于分析呼吸道傳染病的微流控儀器

RTisochipTM-W由4個(gè)相同的子模塊組成，每個(gè)子模塊都可以控制微流控芯片并對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。可以將4個(gè)分析儀堆疊在一起，形成一個(gè)由一臺(tái)計(jì)算機(jī)控制的16通道系統(tǒng)[圖2（a）]。如圖2（b）、（c）所示，子模塊主要由電機(jī)、控制面板、電源模塊、溫度控制模塊、檢測(cè)模塊和通信模塊組成?？刂泼姘蹇刂齐姍C(jī)的旋轉(zhuǎn)、微流控芯片的進(jìn)入/退出以及所有其他模塊。比例-積分-微分（PID）溫度控制器用于調(diào)控核酸擴(kuò)增所需的溫度。光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)腔室中的熒光信號(hào)。熒光信號(hào)數(shù)據(jù)同時(shí)發(fā)送到計(jì)算機(jī)，該計(jì)算機(jī)通過(guò)通信模塊與路由器連接。

圖1. 碟式微流控芯片設(shè)計(jì)和呼吸道病毒檢測(cè)流程。（a）微流控芯片示意圖。（b）各靶標(biāo)病毒以及對(duì)照在芯片上對(duì)應(yīng)的反應(yīng)腔室分布。（c）NASBA原理圖。在非循環(huán)階段，引物1與靶序列退火形成RNA:DNA雜合體，RNase H水解該RNA:DNA雜合體中的RNA。接下來(lái)，引物2與單鏈DNA（ssDNA）退火并由逆轉(zhuǎn)錄酶合成雙鏈DNA（dsDNA）。在循環(huán)階段，重復(fù)進(jìn)行從dsDNA模板轉(zhuǎn)錄生成RNA、合成cDNA、水解RNA:DNA雜合體中RNA鏈以及形成dsDNA的過(guò)程。（d）病毒檢測(cè)流程。從左到右：收到滅活臨床樣本、從樣本中提取RNA、將試劑轉(zhuǎn)移到芯片中、用膠帶密封芯片、將芯片放入儀器中、將試劑分配到芯片上的反應(yīng)腔室中和使用RTisochipTM-W系統(tǒng)完成擴(kuò)增和檢測(cè)。

3. 結(jié)果

3.1. 優(yōu)化用于RTisochipTM-W 系統(tǒng)的RNA 提取方法

作為檢測(cè)的第一步，從臨床樣本中提取的RNA在整個(gè)分析過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。為了選擇合適的RNA提取方法，我們比較了用于提取咽拭子中病毒RNA的TRIzolTM總RNA提取試劑盒和QIAamp?病毒RNA迷你試劑盒的提取效率。陽(yáng)性值出現(xiàn)時(shí)間（Tp，即指數(shù)放大曲線的二階導(dǎo)數(shù)拐點(diǎn)處的時(shí)間）被用作評(píng)估提取效率的關(guān)鍵因素，Tp值通常與模板濃度呈負(fù)相關(guān)。如圖3（a）所示，通過(guò)TRIzolTM試劑提取法檢測(cè)的Tp值總是比通過(guò)QIAamp?試劑盒提取所檢測(cè)到的Tp值略小。因此，我們推薦采用TRIzolTM提取試劑作為手動(dòng)提取試劑。接下來(lái)，為了進(jìn)一步減少人工操作，我們使用KingFisherTMFlex純化系統(tǒng)來(lái)自動(dòng)提取RNA。圖3（b）、（c）證明，在對(duì)兩個(gè)病毒靶標(biāo)HCoV-229E/NL63和H1N1 2009進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，在以半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)感染量（TCID50，組織培養(yǎng)中值感染劑量）定量的較大模板濃度范圍內(nèi)，該自動(dòng)化操作系統(tǒng)與手動(dòng)TRIzolTM提取方法相比，具有更高的提取效率和更好的重復(fù)性。但是，由于自動(dòng)化系統(tǒng)的成本較高，我們同時(shí)選擇了TRIzolTM提取試劑和KingFisherTM系統(tǒng)進(jìn)行后續(xù)測(cè)試。

圖2. RTisochipTM-W系統(tǒng)的設(shè)計(jì)。（a）由具有16通道的4個(gè)堆疊放置的分析儀組成的RTisochipTM-W系統(tǒng)，每個(gè)分析儀包含4個(gè)子模塊。（b）包含4個(gè)子模塊的分析儀的分解圖。1：鈑金框架；2：右側(cè)面板；3：上面板；4：子模塊；5：前面板；6：后面板；7：交換機(jī)的固定上蓋板；8：交換機(jī)；9：交換機(jī)固定面板；10：網(wǎng)絡(luò)端口安裝面板；11：隔板；12：電源插座安裝面板；13：插座式電源濾波器；14：系統(tǒng)電源；15：芯片加熱器的電源；16：左側(cè)面板；17：橡膠腳。（c）儀器內(nèi)部子模塊的結(jié)構(gòu)示意圖。通過(guò)路由器最多可以將16個(gè)相同的子模塊連接到計(jì)算機(jī)。PMT：光電倍增管；LED：發(fā)光二極管；PID：比例-積分-微分。

3.2. 評(píng)估RTisochipTM-W 系統(tǒng)的靈敏度和重復(fù)性

為了評(píng)估該平臺(tái)的靈敏度，我們將合成的針對(duì)這19種呼吸道病毒的RNA模板進(jìn)行梯度稀釋，形成250拷貝·μL?1、50拷貝·μL?1、25拷貝·μL?1、10拷貝·μL?1的濃度梯度樣本。其中，將SARS-CoV-2N核酸和SARS-CoV-2 S核酸混在一起進(jìn)行稀釋。圖4（a）列出了所有病毒的檢測(cè)限（LOD）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H7N9、CA16、RSV、HPIV1、HPIV2、HPIV3、HPIV4、HCoV-229E/NL63和HMPV的LOD值為50拷貝·μL?1；H1N1、H3N2、乙型流感病毒、EV71、HCoV-OC43/HKU1、CA6、HRV和SARS-CoV-2 N基因的LOD值為25拷貝·μL?1；H1N1 2009和SARS-CoV-2S基因的LOD值可以達(dá)到10拷貝·μL?1。這些指標(biāo)的靈敏度與常規(guī)RTPCR方法相當(dāng)。H1N1 2009和SARS-CoV-2 S基因在不同模板濃度下以及陰性對(duì)照組檢測(cè)的典型擴(kuò)增曲線如圖4（b）和（c）所示。在H1N1 2009和SARS-CoV-2 S基因的Tp值與RNA濃度之間可觀察到良好的線性相關(guān)性。

我們選擇H1N1 2009和SARS-CoV-2作為評(píng)估系統(tǒng)重復(fù)性的檢測(cè)靶標(biāo)。首先，使用500拷貝·μL?1的H1N1 2009和SARS-CoV-2 S基因滅活假病毒測(cè)試了三個(gè)批次的微流控芯片（每批次重復(fù)10次）。將提取后的RNA樣本上樣到RTisochipTM-W系統(tǒng)中進(jìn)行測(cè)試。如圖4（d）所示，在每個(gè)批次內(nèi)以及三個(gè)批次之間，這兩個(gè)靶標(biāo)的Tp值均未觀察到顯著差異，表明RTisochipTM-W系統(tǒng)具有極好的重復(fù)性。用模擬樣本進(jìn)行評(píng)估后，進(jìn)一步使用從臨床樣本中提取的RNA對(duì)SARS-CoV-2 S基因和N基因進(jìn)行檢測(cè)，以測(cè)試系統(tǒng)的重復(fù)性。圖4（e）顯示，10次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的S基因和N基因檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)（CV）分別為16.96%和15.91%。這些結(jié)果清晰地表明，微流控平臺(tái)在檢測(cè)多病毒指標(biāo)時(shí)，具有高重復(fù)性和可接受的靈敏度。

3.3. 評(píng)估RTisochipTM -W 系統(tǒng)的魯棒性和特異性

魯棒性是醫(yī)學(xué)診斷平臺(tái)的一項(xiàng)關(guān)鍵性能，尤其針對(duì)傳染病的檢測(cè)，臨床樣本可能以多種形式存在，并且包含多種擴(kuò)增抑制劑，且這些擴(kuò)增抑制劑無(wú)法通過(guò)核酸提取消除。在本研究中，咽拭子或其他類型的樣本可能具有多種干擾物，包括微生物、血液以及患者在采樣前服用的殘留抗菌和抗病毒藥物。因此，使用帶有人工添加的干擾物的樣本來(lái)評(píng)估平臺(tái)的抗干擾能力。首先，如圖5（a）所示，我們發(fā)現(xiàn)，在混合有H1N1 2009、H3N2、乙型流感病毒、RSV、HPIV3和SARS-CoV-2 N基因1000拷貝·mL?1的假病毒溶液中，添加黏蛋白至其終濃度為10 mg·L?1，對(duì)這6個(gè)靶標(biāo)的擴(kuò)增無(wú)負(fù)面影響，表現(xiàn)為Tp值無(wú)顯著變化。接下來(lái)，我們準(zhǔn)備了含有鹽酸羥甲唑啉、地塞米松、干擾素、拉米夫定、金剛烷胺、薄荷醇、氯化鈉和黏蛋白的混合干擾物質(zhì)[圖5（b）]，以便更嚴(yán)格地評(píng)估該平臺(tái)抗干擾能力。如圖5（c）所示，添加這些混合干擾物質(zhì)之后，H1N1 2009、H3N2、乙型流感病毒、RSV、HPIV3和SARS-CoV-2 N基因的Tp值無(wú)顯著變化。總之，這些測(cè)試結(jié)果表明樣本中存在的干擾物質(zhì)對(duì)RTisochipTM-W平臺(tái)無(wú)顯著的負(fù)面影響。

由于RTisochipTM-W平臺(tái)可以同時(shí)檢測(cè)19種不同類型的病毒，因此需要對(duì)這些靶標(biāo)之間的交叉反應(yīng)進(jìn)行詳細(xì)的研究，避免出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況。在這里，我們準(zhǔn)備了各包含一種假病毒模板（P1～P19）的19個(gè)樣本和6個(gè)陰性對(duì)照（N1～N6）樣本對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)試。如圖5（d）的熱圖所示，我們發(fā)現(xiàn)在所有25個(gè)樣本中都沒(méi)有檢測(cè)到由交叉反應(yīng)引起的非特異性擴(kuò)增，表明RTisochipTM-W系統(tǒng)的可靠性。接下來(lái)，我們注意到這19個(gè)不同靶標(biāo)之間的競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)是該平臺(tái)的另一個(gè)潛在風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)單個(gè)樣本中存在多個(gè)靶標(biāo)模板時(shí)，由于來(lái)自非靶標(biāo)RNA的干擾，系統(tǒng)的靈敏度可能不如一次僅檢測(cè)一個(gè)靶標(biāo)的高。為了評(píng)估這種競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)，我們準(zhǔn)備了單一或混合RNA樣本，將其稀釋至終濃度為5000拷貝·μL?1和500拷貝·μL?1。如圖 5（e）所示，對(duì)于H1N1 2009、H3N2、RSV、HPIV3、SARS-CoV-2 S基因和SARS-CoV-2 N基因這6個(gè)靶標(biāo)，分別單獨(dú)檢測(cè)的Tp值與從混合RNA樣本中檢測(cè)的Tp值無(wú)顯著差異。盡管我們確實(shí)觀察到由于非靶標(biāo)RNA的干擾，在低濃度的混合樣本中無(wú)法檢測(cè)到乙型流感病毒，但是可以通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化乙型流感病毒的引物濃度和引物序列以解決此問(wèn)題?？傮w而言，上述結(jié)果證明，RTisochipTM-W系統(tǒng)具有良好的特異性和較強(qiáng)的魯棒性，且可同時(shí)對(duì)16個(gè)臨床樣本中的19種呼吸道病毒進(jìn)行檢測(cè)。

圖3. 用于芯片上病毒檢測(cè)的RNA提取方法的比較。（a）通過(guò)對(duì)不同病毒靶標(biāo)的檢測(cè)，比較QIAamp?和TRIzolTM提取試劑的RNA提取效率（n = 3）；（b）通過(guò)對(duì)HCoV-229E/NL63和H1N1 2009的檢測(cè)，比較TRIzolTM提取試劑和自動(dòng)化提取系統(tǒng)KingFisherTM Flex的RNA提取效率（n = 3）。所有誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。

3.4. 使用RTisochipTM-W 系統(tǒng)對(duì)SARS-CoV-2 和另外18種呼吸道病毒進(jìn)行臨床測(cè)試

在SARS-CoV-2暴發(fā)前，我們通過(guò)使用RTisochipTM-W系統(tǒng)分析了大量臨床樣本，以跟蹤18種呼吸道病毒在北京的流行趨勢(shì)。在2019年12月27日至2020年1月16日的流感季節(jié)，我們從北京清華長(zhǎng)庚醫(yī)院共收集了101份兒童咽拭子樣本。與之對(duì)應(yīng)，在2019年9月18日至11月7日非流感季節(jié)期間，我們從首都兒科研究所收集了100份兒童咽拭子樣本。所有臨床樣本均通過(guò)RTisochipTM-W系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果列在附錄A的表S2～S3中。從這201份臨床樣本中，可以看到呼吸道病毒的陽(yáng)性率在不同采樣時(shí)間顯示出很大的差異。如圖6（a）所示，我們發(fā)現(xiàn)收集自流感季節(jié)的臨床樣本中幾乎有71.3%是流感病毒陽(yáng)性，而來(lái)自首都兒科研究所的收集自非流感季節(jié)的臨床樣本中只有2.9%是流感病毒陽(yáng)性。此外，在流感季節(jié)，RSV、HPIV1、HPIV2、HMPV、HCoV-229E/NL63和HCoV-OC43/HKU1的陽(yáng)性比例呈上升趨勢(shì)，而流感季節(jié)的HRV、HPIV3和HPIV4的陽(yáng)性率要低于非流感季節(jié)。呼吸道病毒陽(yáng)性率隨季節(jié)的顯著變化強(qiáng)調(diào)了在臨床中對(duì)呼吸道病毒進(jìn)行多指標(biāo)檢測(cè)的重要性。

圖4. 測(cè)試RTisochipTM-W系統(tǒng)的靈敏度和重復(fù)性。（a）對(duì)19種呼吸道病毒在芯片上的LOD進(jìn)行檢測(cè)；（b）H1N1 2009不同模板濃度下的典型擴(kuò)增曲線以及與Tp值之間的線性擬合（n = 3）；（c）SARS-CoV-2 S基因不同模板濃度下的典型擴(kuò)增曲線以及與Tp值之間的線性擬合（n = 3）；（d）使用三個(gè)批次的芯片對(duì)合成的H1N1 2009和SARS-CoV-2 S基因的RNA模板進(jìn)行重復(fù)性測(cè)試（n = 10）；（e）使用提取的RNA樣本測(cè)試SARS-CoV-2 S基因和SARS-CoV-2 N基因的可重復(fù)性（n = 10）。所有誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖5. 測(cè)試RTisochipTM-W系統(tǒng)的抗干擾能力、交叉反應(yīng)以及模板競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)。（a）在添加或不添加黏蛋白的樣本中，針對(duì)7項(xiàng)所選靶標(biāo)檢測(cè)的Tp值及擴(kuò)增曲線圖；（b）混合干擾物質(zhì)中每種干擾物質(zhì)的終濃度；（c）在添加或不添加混合干擾物質(zhì)的樣本中，針對(duì)7項(xiàng)所選靶標(biāo)檢測(cè)的Tp值；（d）對(duì)RTisochipTM-W系統(tǒng)進(jìn)行交叉反應(yīng)測(cè)試，陽(yáng)性和陰性結(jié)果分別顯示為橙色和藍(lán)色正方形；（e）混合模板的競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)測(cè)試，測(cè)試了兩種不同濃度下的單一模板或混合模板擴(kuò)增情況，乙型流感病毒在500拷貝·μL?1濃度下無(wú)法檢出。ns：無(wú)顯著差異。

圖6. 使用RTisochipTM-W系統(tǒng)對(duì)臨床呼吸道樣本進(jìn)行鑒定。（a）2019—2020年收集的臨床樣本中每種病毒靶標(biāo)的陽(yáng)性率。來(lái)自北京清華長(zhǎng)庚醫(yī)院的臨床樣本（n =101）收集于2019—2020年的流感季節(jié)，來(lái)自首都兒科研究所的臨床樣本（n = 100）收集于2019年的非流感季節(jié)。（b）比較RTisochipTM-W系統(tǒng)和常規(guī)RT-PCR方法對(duì)SARS-CoV-2的診斷結(jié)果。“+”代表陽(yáng)性結(jié)果，“?”代表陰性結(jié)果。（c）使用臨床樣本驗(yàn)證RTisochipTM-W系統(tǒng)的重復(fù)性。陽(yáng)性和陰性結(jié)果分別顯示為橙色和藍(lán)色正方形。（d）使用RTisochipTM-W系統(tǒng)對(duì)614份疑似或確診的COVID-19患者臨床咽拭子樣本進(jìn)行檢測(cè)。

SARS-CoV-2暴發(fā)后，我們將SARS-CoV-2 S基因和N基因的檢測(cè)添加到系統(tǒng)中，并使用SARS-CoV-2臨床樣本對(duì)系統(tǒng)性能進(jìn)行評(píng)估。首先，使用RTisochipTM-W系統(tǒng)和商業(yè)RT-PCR試劑盒（BGI，深圳）并行測(cè)試14個(gè)臨床確診的陽(yáng)性樣本和三個(gè)陰性樣本。如圖6（b）和附錄A中的表S4所示，兩種方法顯示出100%的一致性，這表明RTisochipTM-W平臺(tái)的檢測(cè)性能與常規(guī)RT-PCR相當(dāng)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證RTisochipTM-W平臺(tái)在測(cè)試臨床樣本上的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，我們準(zhǔn)備了3批不同批次生產(chǎn)的共25個(gè)微流控芯片來(lái)測(cè)試25個(gè)臨床確診樣本。如圖6（c）的熱圖所示，RTisochipTM-W系統(tǒng)報(bào)道的結(jié)果均與臨床診斷結(jié)果一致，未發(fā)生假陽(yáng)性或假陰性現(xiàn)象。經(jīng)過(guò)這些小規(guī)模測(cè)試后，我們與廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院（380例）、四川大學(xué)華西醫(yī)院（63例）和首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院（171例）合作，從疑似或確診的COVID-19患者中收集了614份臨床拭子樣本（列于附錄A的表S5～S8中）。如圖6（d）所示，我們報(bào)道的SARS-CoV-2、H1N1 2009、H3N2、HPIV、RSV和乙型流感病毒的陽(yáng)性率分別為6.19%（38/614）、10.91%（67/614）、6.19%（38/614）、3.75%（23/614）、12.38%（76/614）和5.21%（32/614）。RTisochipTM-W系統(tǒng)與參考試劑盒（RT-PCR，之江生物科技股份有限公司，上海）在對(duì)SARS-CoV-2、H1N1 2009、H3N2、HPIV、RSV和乙型流感病毒的診斷上的一致性分別為98.15%、98.70%、99.35%、99.57%、97.61%和99.35%。在這些臨床樣本中，一些疑似COVID-19陽(yáng)性患者最終被診斷為甲型流感病毒、乙型流感病毒或RSV陽(yáng)性而非SARSCoV-2陽(yáng)性。例如，四川大學(xué)華西醫(yī)院的1號(hào)病例被診斷為甲型流感病毒陽(yáng)性，這凸顯了該平臺(tái)在精確識(shí)別疾病確切原因方面的價(jià)值。在某些臨床確診的COVID-19病例中，RTisochipTM-W平臺(tái)和常規(guī)RT-PCR方法均無(wú)法檢測(cè)到SARS-CoV-2，這可能是由于樣本的病毒載量低所致。如此大規(guī)模的臨床測(cè)試清楚地證明，RTisochipTM-W平臺(tái)是在臨床環(huán)境中檢測(cè)呼吸道病毒的強(qiáng)大而可靠的診斷工具。

4. 討論

目前針對(duì)COVID-19尚無(wú)有效藥物，因此抗擊COVID-19唯一可行的方法是對(duì)患者進(jìn)行及早診斷、分類和隔離。不幸的是，由于所有呼吸道感染疾病癥狀相似，因此很容易將有咳嗽和發(fā)燒癥狀的SARS-CoV-2陰性患者與其他COVID-19患者一同送入重癥監(jiān)護(hù)室（ICU），在醫(yī)療資源緊張的情況下接受與COVID-19患者同樣的治療。從這個(gè)角度出發(fā)，開(kāi)發(fā)一種可以將COVID-19患者與由其他病毒（如流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒和人偏肺病毒）引起的肺炎區(qū)別開(kāi)來(lái)的核酸檢測(cè)工具是極其有價(jià)值的。RTisochipTM-W系統(tǒng)能夠在一次檢測(cè)中識(shí)別19種常見(jiàn)的呼吸道病毒，且具有以下優(yōu)勢(shì)：一次運(yùn)行時(shí)間少于90 min，可靈活處理1～16個(gè)樣本，以最少的人工操作即可完成多指標(biāo)檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度可與常規(guī)RT-PCR相當(dāng)以及對(duì)于各種干擾物的耐受性高。因此，RTisochipTM-W系統(tǒng)應(yīng)該可以在抗擊COVID-19大流行中發(fā)揮重要作用。

在COVID-19大流行的背景下，應(yīng)重視RTisochipTM-W系統(tǒng)在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用。在本文中，我們通過(guò)綜合考慮所有分子診斷方法的利弊，提出了COVID-19檢測(cè)指南。如圖7所示，當(dāng)有COVID-19癥狀的患者到達(dá)發(fā)熱門診時(shí)，首先可以進(jìn)行常規(guī)的RT-PCR檢測(cè)以快速確定患者（及其親密接觸者）是否感染了SARS-CoV-2。在大流行背景下，RT-PCR技術(shù)由于成本較低、通量較高，再輔以自動(dòng)化技術(shù)，適合用來(lái)對(duì)大量臨床樣本進(jìn)行篩查。如果患者被診斷為COVID-19，則可以將其轉(zhuǎn)移到COVID-19定點(diǎn)醫(yī)院。最新研究結(jié)果表明，患者體內(nèi)的病毒載量可反映治療結(jié)果[32–34]。因此在治療過(guò)程中，可以使用可對(duì)病毒進(jìn)行絕對(duì)定量的數(shù)字PCR技術(shù)（dPCR）密切監(jiān)測(cè)患者的病毒載量。如果患者的狀況惡化，則可以使用RTisochipTM-W系統(tǒng)來(lái)識(shí)別是否發(fā)生由呼吸道病毒和細(xì)菌引起的醫(yī)院獲得性感染（HAI）。這種測(cè)試策略應(yīng)該可以提高COVID-19患者的生存率。其次，如果發(fā)熱門診患者在SARS-CoV-2測(cè)試中為陰性，RTisochipTM-W系統(tǒng)可以很快識(shí)別出其癥狀是否是由該系統(tǒng)所能檢出的其他病毒和細(xì)菌所引起。一旦確診，可以將患者轉(zhuǎn)移到醫(yī)院的呼吸科，并通過(guò)RTisochipTM-W系統(tǒng)進(jìn)行密切監(jiān)測(cè)。再次，如果通過(guò)RTisochipTM-W系統(tǒng)檢測(cè)后，結(jié)果仍為陰性，則可以使用第二代DNA/RNA測(cè)序技術(shù)來(lái)鑒定是否感染未知或罕見(jiàn)的病原體。然后，在呼吸科對(duì)患者進(jìn)行相應(yīng)的治療，同時(shí)通過(guò)RTisochipTM-W系統(tǒng)監(jiān)測(cè)是否有HAI的跡象。最后，康復(fù)的患者應(yīng)在出院前再接受一輪RT-PCR測(cè)試。同時(shí)，考慮到RT-PCR可能產(chǎn)生假陰性結(jié)果，應(yīng)按照《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》[35]的建議，聯(lián)合使用基于免疫球蛋白M（IgM）和免疫球蛋白G（IgG） 的檢測(cè)，以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

根據(jù)此指南，RTisochipTM-W系統(tǒng)可用于以下情況：①快速診斷出引起類似于COVID-19癥狀的確切原因，防止發(fā)生誤診和交叉感染；②密切監(jiān)測(cè)由大流行所造成的醫(yī)療狀況的惡化進(jìn)而導(dǎo)致在治療期間發(fā)生的HAI。RTisochipTM-W系統(tǒng)與其他體外診斷工具協(xié)同使用，將使我們更加高效和精準(zhǔn)地戰(zhàn)勝COVID-19。未來(lái)可以通過(guò)以下幾個(gè)方面對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步改進(jìn)：引入更多的病原體檢測(cè)指標(biāo)，集成樣本處理過(guò)程使其成為一個(gè)“樣本進(jìn)-結(jié)果出”的系統(tǒng)，結(jié)合自動(dòng)化操作進(jìn)一步提高該系統(tǒng)的檢測(cè)通量。

5. 結(jié)論

總之，我們成功開(kāi)發(fā)了一款高通量核酸等溫?cái)U(kuò)增系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠在90 min內(nèi)從16個(gè)臨床樣本中檢測(cè)出包括SARS-CoV-2在內(nèi)的19種常見(jiàn)的呼吸道病毒。通過(guò)大量臨床試驗(yàn)證明了該檢測(cè)系統(tǒng)具有靈敏度高、特異性好、魯棒性強(qiáng)和重復(fù)性出色等特點(diǎn)，因此在急需知道導(dǎo)致肺炎的確切原因的發(fā)熱門診、ICU、醫(yī)療檢疫區(qū)和其他場(chǎng)所，該系統(tǒng)是一個(gè)強(qiáng)大的可用作診斷和篩選包括SARS-CoV-2在內(nèi)的呼吸道病毒的工具。

圖7. COVID-19檢測(cè)指南。NGS：第二代測(cè)序技術(shù)。

致謝

感謝廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的鐘南山院士及其同事提供滅活的病毒樣本。感謝北京清華長(zhǎng)庚醫(yī)院的趙秀英醫(yī)生及其同事，以及首都兒科研究所的崔小岱醫(yī)生及其同事提供臨床樣本。本研究受科技部國(guó)家重點(diǎn)研究發(fā)展計(jì)劃（2020YFC0847400）與清華大學(xué)（20201080055）和廣州呼吸健康研究院（2020GIRHHMS02和2020GIRHHMS03）預(yù)防與控制COVID-19科學(xué)技術(shù)應(yīng)急響應(yīng)項(xiàng)目的資助。

Compliance with ethics guidelines

Wanli Xing, Yingying Liu, Huili Wang, Shanglin Li,Yongping Lin, Lei Chen, Yan Zhao, Shuang Chao, Xiaolan Huang, Shaolin Ge, Tao Deng, Tian Zhao, Baolian Li, Hanbo Wang, Lei Wang, Yunpeng Song, Ronghua Jin, Jianxing He, Xiuying Zhao, Peng Liu, Weimin Li, and Jing Cheng declare that they have no conflict of interest or financial conflicts to disclose.

Appendix A. Supplementary date

Supplementary data to this article can be found online at https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.07.015.