楊凱,張碩,崔康平，黑生強(qiáng),呂學(xué)敏,宋廣清,張弦,黃霞*

1.合肥工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院 2.環(huán)境模擬與污染控制國(guó)家重點(diǎn)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院

活性污泥法是污水處理中最常用的技術(shù)，主要利用活性污泥的生物凝聚、吸附和氧化作用去除水中污染物。胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)是活性污泥的主要成分之一，對(duì)活性污泥的結(jié)構(gòu)、絮凝性、沉降性、表面電荷和脫水性能等均具有重要影響[1-2]。EPS的組成主要包括蛋白質(zhì)、碳水化合物、腐殖質(zhì)、DNA及其他小分子物質(zhì)[3-5]。其中，蛋白質(zhì)被認(rèn)為與EPS的結(jié)構(gòu)和功能均有重要聯(lián)系[6-8]，Wu等[9]研究認(rèn)為污泥絮凝體的結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性與EPS中蛋白質(zhì)濃度和種類(lèi)有關(guān);Felipe等[10]研究認(rèn)為活性污泥沉降性能的改變與EPS中蛋白質(zhì)濃度變化有關(guān)。因此，EPS中蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確定量對(duì)研究活性污泥性質(zhì)具有重要意義。目前EPS中蛋白質(zhì)的量化存在較大差異，一方面與EPS的提取方法有關(guān)[11]，另一方面與EPS中蛋白質(zhì)的不同定量方法有關(guān)。

蛋白質(zhì)的定量方法較多，包括凱氏定氮法、熒光分析法、雙縮脲法、Lowry法、Modified Lowry法、BCA法、Bradford法等[12-18]，其中，Modified Lowry法、BCA法、Bradford法具有測(cè)試操作簡(jiǎn)便，測(cè)試準(zhǔn)確性較高等優(yōu)勢(shì)，已被廣泛用于廢水中蛋白質(zhì)的定量[19-21]。但這3種方法的測(cè)試范圍、準(zhǔn)確度、精密度均存在差異。此外，這3種方法可能受到EPS中部分組分的干擾，如Shen等[22]報(bào)道了Ca2+和Mg2+對(duì)Modified Lowry法的準(zhǔn)確性存在影響；Felz等[23]報(bào)道了活性污泥中存在還原性糖將影響B(tài)CA法的測(cè)試結(jié)果；Le等[24]認(rèn)為腐殖酸會(huì)對(duì)BCA法和Bradford法的測(cè)試產(chǎn)生干擾。但目前對(duì)上述3種方法的測(cè)試范圍、準(zhǔn)確度、精密度和針對(duì)活性污泥EPS中不同組分的抗干擾能力的系統(tǒng)評(píng)價(jià)鮮見(jiàn)報(bào)道。筆者評(píng)價(jià)了Modified Lowry法、BCA法和Bradford法的測(cè)試范圍、準(zhǔn)確度、精密度及對(duì)活性污泥中Ca2+、Mg2+、還原性糖和腐殖酸的抗干擾性，以期為EPS中蛋白質(zhì)定量方法的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 Modified Lowry法

Modified Lowry法是由Fr?lund等[15]在Lowry法基礎(chǔ)上針對(duì)腐殖酸干擾提出的改進(jìn)方法。Lowry法的原理是在堿性介質(zhì)中蛋白質(zhì)將Cu2+還原成Cu+，產(chǎn)生Cu+-蛋白復(fù)合物。該復(fù)合物與Folin試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，采用比色法在750 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A)[24]。

為減少M(fèi)odified Lowry法測(cè)試時(shí)間，對(duì)Shen等[22]提出的測(cè)試流程和試劑用量進(jìn)行了改進(jìn)，提出如圖1所示的測(cè)試步驟，蛋白質(zhì)吸光度的計(jì)算公式見(jiàn)式(1)～式(3)，試劑的配制見(jiàn)表1。

圖1 Modified Lowry 法的測(cè)試步驟Fig.1 Test procedure for Modified Lowry method

A加CuSO4=A蛋白質(zhì)+A腐殖酸

(1)

A不加CuSO4=0.2×A蛋白質(zhì)+A腐殖酸

(2)

A蛋白質(zhì)=1.25×(A加CuSO4-A不加CuSO4)

(3)

表1 Modified Lowry法試劑的配制

1.2 BCA法

測(cè)試原理：在堿性條件下蛋白質(zhì)將Cu2+還原成Cu+，Cu+與BCA分子結(jié)合生成紫色絡(luò)合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，采用比色法在562 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

測(cè)試步驟：取20 μL樣品置于酶標(biāo)板中，加入200 μL BCA工作液(某品牌試劑盒)，室溫(25±2)℃下靜置120 min，于562 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

1.3 Bradford法

測(cè)試原理：考馬斯亮藍(lán)G-250染料在酸性條件與精氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸殘基相互作用顯色[25]，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，采用比色法在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

測(cè)試步驟：移取5 μL樣品至酶標(biāo)板中，加入250 μL考馬斯亮藍(lán)G-250染色液(某品牌試劑盒)，在室溫下靜置10 min，于595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

1.4 蛋白質(zhì)定量方法測(cè)試性能評(píng)價(jià)

1.4.1濃度測(cè)試范圍評(píng)價(jià)

配制0～1、1～10、10～100、100～2 000 mgL 4組濃度梯度牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察3種方法在不同BSA濃度范圍內(nèi)與吸光度的線(xiàn)性相關(guān)性，每個(gè)樣品設(shè)置3次平行(n=3)。

1.4.2準(zhǔn)確度和精密度評(píng)價(jià)

在濃度測(cè)試范圍評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，選定3種方法相同的BSA濃度范圍，進(jìn)一步考察3種方法共同測(cè)試線(xiàn)性范圍內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度，每個(gè)樣品設(shè)置8次平行(n=8)。準(zhǔn)確度由相對(duì)誤差(relative error, RE)衡量。采用T檢驗(yàn)對(duì)測(cè)試值和真實(shí)值進(jìn)行差異性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)假設(shè)為測(cè)試值和真實(shí)值有顯著性差異，檢驗(yàn)參數(shù)P越大表明測(cè)試值與準(zhǔn)確值差異性越小。精密度由相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)衡量。

◆申請(qǐng)課題時(shí)，無(wú)論自己的知識(shí)儲(chǔ)備如何，皆敢氣吞山河地聲稱(chēng)其成果將有重大創(chuàng)新與社會(huì)影響、理論價(jià)值、國(guó)內(nèi)領(lǐng)先、國(guó)際一流云云.

1.4.3抗干擾性評(píng)價(jià)

分別配制不同濃度的Ca2+(0、1、2、5 mmolL)，Mg2+(0、1、2、5 mmolL)，葡萄糖(0、1、2、5 mmolL)，腐殖酸(0、10、20、50、100 mgL)與BSA的混合溶液，用3種定量方法測(cè)定混合溶液的吸光度，每個(gè)樣品設(shè)置3次平行(n=3)。

1.5 儀器與試劑

吸光度測(cè)定使用MD SpectraMax型多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecuar Devices公司)可見(jiàn)光分光光度模塊。

氯化鈣(CaCl2·2H2O)、氯化鎂(MgCl2·6H2O)、葡萄糖(C6H12O6·H2O)、硫酸銅(CuSO4·5H2O)、酒石酸鈉(Na2C4O6·2H2O)均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；BSA、Folin-酚試劑(2N)購(gòu)自Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司；腐殖酸購(gòu)自MACKLIN(上海)生化科技有限公司；BCA試劑盒和Bradford試劑盒均購(gòu)自某生物技術(shù)公司；試驗(yàn)用水均為超純水。

2 結(jié)果與討論

2.1 測(cè)試范圍評(píng)價(jià)

BSA濃度分別為0～1、1～10、10～100、100～1 000 mgL 4組梯度下蛋白質(zhì)濃度與吸光度的線(xiàn)性相關(guān)性結(jié)果如表2所示。由表2可見(jiàn)，Modified Lowry法在BSA濃度為1～10和10～100 mgL時(shí)有較好的線(xiàn)性相關(guān)性(R2>0.99)，BCA法在BSA濃度為10～100和100～2 000 mgL范圍內(nèi)線(xiàn)性相關(guān)性較好(R2>0.99)，Bradford法在BSA濃度為20～100和100～1 500 mgL范圍內(nèi)線(xiàn)性相關(guān)性較好(R2>0.99)。

表2 3種方法不同BSA濃度范圍的線(xiàn)性相關(guān)性比較(n=3)

2.2 準(zhǔn)確度和精密度評(píng)價(jià)

在確定測(cè)試范圍的基礎(chǔ)上，在3種方法共同測(cè)試范圍(20～100 mgL)內(nèi)選定BSA濃度為50和100 mgL，對(duì)比定量方法的準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果見(jiàn)圖2。準(zhǔn)確度和精密度對(duì)比見(jiàn)表3。由表3可知，3種定量方法的準(zhǔn)確度由高到低依次為Modified Lowry法、BCA法和Bradford法；精密度由高到低依次為Modified Lowry法、BCA法和Bradford法。差異性檢驗(yàn)(P)表明，3種方法的測(cè)試值與真實(shí)值的差異程度由低到高依次為Modified Lowry法、BCA法和Bradford法。

圖2 3種方法定量50、100 mgL BSA的測(cè)試數(shù)據(jù)分布(n=8)Fig.2 Distribution of test data by three methods to quantify 50 and 100 mgL BSA (n=8)

表3 3種方法的準(zhǔn)確度和精密度比較(n=8)

2.3 抗干擾性的評(píng)價(jià)

2.3.1Ca2+和Mg2+濃度的影響

圖3 含不同濃度Ca2+時(shí)BSA濃度與吸光度的擬合曲線(xiàn)(n=3)Fig.3 Fitting curves of BSA concentration and absorbance with different concentrations of Ca2+(n=3)

圖4 含不同濃度Mg2+時(shí)BSA濃度與吸光度的擬合曲線(xiàn)(n=3)Fig.4 Fitting curves of BSA concentration and absorbance with different concentrations of Mg2+(n=3)

由圖3(a)可見(jiàn)，Modified Lowry法在Ca2+濃度分別為1、2、5 mmolL時(shí)，擬合曲線(xiàn)較標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)向下偏移較大，即吸光度測(cè)試值偏低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)定量結(jié)果偏低，且干擾程度隨Ca2+濃度增加而增大。此外，Ca2+濃度相同時(shí)，蛋白質(zhì)濃度越低測(cè)試所受干擾越大，如Ca2+濃度為2 mmolL時(shí)，對(duì)濃度為25、50、100 mgL的BSA測(cè)試造成的RE分別為62.84%、29.73%、15.96%。

由圖4(a)可見(jiàn)，Modified Lowry法在Mg2+濃度為1、2、5 mmolL時(shí)，擬合曲線(xiàn)較標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)向下偏移較小。表明Mg2+對(duì)Modified Lowry法的干擾比Ca2+更低。

由圖3(b)、圖3(c)和圖4(b)、圖4(c)可見(jiàn)，BCA法和Bradford法在Ca2+和Mg2+濃度為1、2、5 mmolL時(shí)，擬合曲線(xiàn)較標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)均無(wú)明顯偏移。表明Ca2+、Mg2+對(duì)BCA法和Bradford法的測(cè)試結(jié)果均無(wú)明顯干擾。

BCA法對(duì)Ca2+、Mg2+具有較好的抗干擾能力，原因可能是測(cè)試試劑中酒石酸鈉濃度較高，其可與Ca2+、Mg2+形成絡(luò)合物，從而降低對(duì)蛋白質(zhì)定量的干擾；BCA法樣品與測(cè)試試劑的體積比更低(Modified Lowry法為5∶8，BCA法為1∶10)，工作液對(duì)樣品中的Ca2+、Mg2+稀釋程度更高。Bradford法對(duì)Ca2+、Mg2+具有較好的抗干擾能力，原因可能是測(cè)試試劑顯弱酸性，Ca2+、Mg2+不會(huì)形成沉淀干擾測(cè)試。

2.3.2葡萄糖濃度的影響

采用Modified Lowry法、BCA法和Bradford法測(cè)定含不同濃度葡萄糖的BSA溶液的吸光度并建立BSA濃度和吸光度的擬合曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可見(jiàn)，葡萄糖濃度分別為1、2、5 mmolL時(shí)，Modified Lowry法的擬合曲線(xiàn)較標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)向上偏移較大，即吸光度偏高，導(dǎo)致蛋白質(zhì)濃度測(cè)試值偏高，且測(cè)試干擾程度隨葡萄糖濃度增加而增大。葡萄糖濃度相同時(shí)，蛋白質(zhì)濃度越低，測(cè)試所受干擾越大，如葡萄糖濃度為2 mmolL時(shí)，對(duì)BSA濃度為25、50、100 mgL的測(cè)試造成的RE分別為34.7%、18.6%、9.8%。BCA法測(cè)試受葡萄糖的干擾與Modified Lowry法類(lèi)似，但相同濃度葡萄糖對(duì)BCA法的測(cè)試干擾更顯著，如葡萄糖濃度為2 mmolL時(shí)，對(duì)BSA濃度為25、50、100 mgL的測(cè)試造成的RE分別為79.4%、47.6%、20.5%。葡萄糖濃度分別為1、2、5 mmolL時(shí)，Bradford法的擬合曲線(xiàn)較標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)均無(wú)明顯差異，表明葡萄糖對(duì)Bradford法的測(cè)試結(jié)果無(wú)顯著干擾。

葡萄糖對(duì)Modified Lowry法和BCA法的測(cè)試產(chǎn)生干擾的主要原因是：2種測(cè)試方法中Cu+均起重要作用，堿性條件下葡萄糖中的醛基將Cu2+還原，產(chǎn)生更多的Cu+[28]，使顯色加深，吸光度增加，導(dǎo)致蛋白定量結(jié)果偏高。而B(niǎo)radford法試劑中不含Cu2+，因此還原性糖的存在對(duì)Bradford法的測(cè)試無(wú)明顯干擾。

圖5 含不同濃度葡萄糖時(shí)BSA濃度與吸光度的擬合曲線(xiàn)(n=3)Fig.5 Fitting curves of BSA concentration and absorbance with different concentrations of glucose(n=3)

圖6 含不同濃度腐殖酸時(shí)BSA濃度與吸光度的擬合曲線(xiàn)(n=3)Fig.6 Fitting curves of BSA concentration and absorbance with different concentrations of humic acid(n=3)

2.3.3腐殖酸濃度的影響

由于Fr?lund等[15]提出的Modified Lowry法已對(duì)腐殖酸的干擾做出了修正，該方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)和腐殖酸的同步定量。因此，本研究?jī)H考察腐殖酸濃度對(duì)BCA法和Bradford法測(cè)試的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可見(jiàn)，腐殖酸濃度分別為10、20、50、100 mgL時(shí)，BCA法和Bradford法的擬合曲線(xiàn)較標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)向上偏移較大，即吸光度偏高。表明腐殖酸會(huì)對(duì)BCA法的測(cè)試結(jié)果產(chǎn)生干擾，使測(cè)試結(jié)果偏高，且隨腐殖酸濃度的升高，干擾程度增強(qiáng)。腐殖酸濃度相同時(shí)，蛋白質(zhì)濃度越低測(cè)試所受干擾越大。如腐殖酸濃度為50 mgL時(shí)，BCA法對(duì)濃度為25、50、100 mgL的BSA測(cè)試造成的RE分別為93.3%、51.4%、24.8%,Bradford法分別為72.8%、35.1%、4.0%。

腐殖酸濃度由低到高顯色為棕色至黑色，在BCA法和Bradford法所對(duì)應(yīng)的測(cè)試波長(zhǎng)下均有一定吸光度[29]，會(huì)造成樣品吸光度升高，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)定量結(jié)果偏高。

3 結(jié)論

(1)3種方法中蛋白質(zhì)濃度與吸光度的線(xiàn)性相關(guān)性表現(xiàn)：Modified Lowry法在1～10、10～100 mgL濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性相關(guān)性好(R2>0.99)，該方法適合低濃度蛋白質(zhì)的定量；BCA法在10～100、100～2 000 mgL濃度范圍內(nèi)具有較好的線(xiàn)性相關(guān)性(R2>0.99)；Bradford法在20～100、100～1 500 mgL濃度范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性相關(guān)性(R2>0.99)。

(3)Ca2+、Mg2+和葡萄糖干擾Modified Lowry法測(cè)試，葡萄糖和腐殖酸干擾BCA法測(cè)試，腐殖酸干擾Bradford法測(cè)試。

(4)EPS中蛋白質(zhì)定量方法的選擇應(yīng)綜合考慮測(cè)試對(duì)象的蛋白質(zhì)濃度、干擾物質(zhì)種類(lèi)和測(cè)試方法的測(cè)試范圍、準(zhǔn)確度、精密度和抗干擾性。