鐘森杰，李靜，李琳，黃淑敏，楊夢(mèng)，邱宏，程彬，胡志希

湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所，湖南長(zhǎng)沙410208

參麥注射液的主要成分為紅參和麥冬的提取物，是治療心腦血管疾病的常用中藥制劑。本課題組的前期研究證據(jù)表明，參麥注射液能有效改善高血壓心力衰竭的心功能參數(shù)、心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和內(nèi)源性代謝紊亂，展現(xiàn)出多層次、多靶點(diǎn)的治療效果［1-5］。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)高血壓心力衰竭的血液代謝組學(xué)特征及參麥注射液干預(yù)后的血液代謝組學(xué)變化進(jìn)行分析，建立代謝圖譜，鑒定出與疾病、藥物干預(yù)相關(guān)聯(lián)的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物［4-5］。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，運(yùn)用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）、HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)（The Human Metabolome Database）和MetaboAnalyst通路分析軟件等生物信息學(xué)研究工具，進(jìn)一步解讀代謝圖譜，全局性地觀察生物信息學(xué)的變化，以期從生物學(xué)角度闡釋高血壓心力衰竭的病理機(jī)制及參麥注射液的干預(yù)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 代謝產(chǎn)物信息代謝產(chǎn)物信息來源于本課題組前期的血液代謝組學(xué)研究結(jié)果，共納入20種代謝產(chǎn)物［5］。前期運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)，篩選出對(duì)高血壓心力衰竭具有較強(qiáng)解釋能力的19種代謝產(chǎn)物:丙氨酸（L-Alanine）、蘇氨酸（L-Threonine）、甲基半胱氨酸（S-methyl-Cysteine）、蘇糖酸（Threonic acid）、尿素（Urea）、半胱氨酸（L-Cysteine）、色氨酸（L-Tryptophan）、花生四烯酸（Arachidonic acid）、膽固醇（Cholesterol）、亮氨酸（L-Leucine）、蘇糖醇（Threitol）、鳥氨酸（Ornithine）、木糖醇（Xylitol）、丙酮酸（Pyruvic acid）、核糖醇（Ribitol）、焦谷氨酸（Pyroglutamic acid）、4-羥基-脯氨酸（4-Hydroxyproline）、丙二酸（Malonic acid）、天冬酰胺（L-Asparagine）。篩選出10種代謝產(chǎn)物為參麥注射液治療高血壓心力衰竭的有效靶點(diǎn):亮氨酸、鳥氨酸、丙氨酸、4-羥基-脯氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、蘇糖醇、丙酮酸、尿素、異亮氨酸。

1.2 生物信息學(xué)分析運(yùn)用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.genome.jp/kegg/）和HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.hmdb.ca/）手動(dòng)檢索代謝產(chǎn)物信息，注釋ID號(hào)、相關(guān)的酶及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、參與通路條數(shù)等信息。運(yùn)用MetaboAnalyst 4.0通路分析軟件（https://www.metaboanalyst.ca/）對(duì)代謝通路進(jìn)行可視化分析，設(shè)置參數(shù):通路庫(kù)（Pathway Library）設(shè)置中選擇Homo sapiens（KEGG）；路徑拓?fù)浞治觯≒athway Topology Analysis）中選擇Relative-betweeness Centrality；其余參數(shù)均為默認(rèn)值。最終以通路拓?fù)浞治龅腞aw P＜0.05為條件，篩選出顯著富集的通路［6］。

2 結(jié)果

2.1 代謝產(chǎn)物檢索情況納入研究的20種代謝產(chǎn)物在KEGG與HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，獲得對(duì)應(yīng)ID號(hào)及相關(guān)信息，具體見表1。

表1 20種代謝產(chǎn)物基本信息注釋表

2.2 代謝路徑概要分析MetaboAnalyst 4.0網(wǎng)絡(luò)軟件的代謝通路分析顯示，與高血壓心力衰竭相關(guān)的19種代謝產(chǎn)物參與了27條代謝通路，與參麥注射液干預(yù)機(jī)制相關(guān)的10種代謝產(chǎn)物參與了16條代謝通路，具體概要見圖1。通路分析概要圖以直觀方式展示整體情況，圖中每一點(diǎn)代表一條代謝通路，橫坐標(biāo)是由拓?fù)浞治鏊玫拇x通路影響值，縱坐標(biāo)是由代謝通路富集分析所得的顯著性值。影響值與顯著性值越大，則表示不同組間代謝差異的相關(guān)性越高，所對(duì)應(yīng)的圓點(diǎn)就越大。

圖1 代謝通路分析概要圖

2.3 代謝路徑拓?fù)浞治鐾ㄟ^通路拓?fù)浞治?，以Raw P＜0.05為納入條件，得到與高血壓心力衰竭及參麥注射液干預(yù)機(jī)制相關(guān)的顯著通路。高血壓心力衰竭有7條代謝通路受擾動(dòng)，分別為氨酰tRNA的生物合成（aminoacyl-tRNA biosynthesis），纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成（valine，leucine and isoleucine biosynthesis），丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝（Alanine，aspartate and glutamatemetabolism），谷胱甘肽代謝（Glutathione metabolism），甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝（glycine，serine and threoninemetabolism），精氨酸和脯氨酸代謝（arginine and proline metabolism），精氨酸生物合成（arginine biosynthesis），詳細(xì)信息見表2。以上述7條代謝通路作為潛在的藥物靶標(biāo)，進(jìn)一步觀察參麥注射液的干預(yù)機(jī)制。

表2 高血壓心力衰竭的顯著代謝通路分析結(jié)果

篩選出7條代謝通路，作為參麥注射液干預(yù)高血壓心力衰竭的有效作用通路，其中6條通路為高血壓心力衰竭的顯著通路，詳細(xì)信息見表3。7條代謝通路信息簡(jiǎn)述如下:氨酰tRNA的生物合成，通路內(nèi)含48個(gè)化合物，天冬酰胺、丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蘇氨酸參與此條通路；纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，通路內(nèi)含8個(gè)化合物，蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸參與此條通路；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，通路內(nèi)含28個(gè)化合物，天冬酰胺、丙氨酸、丙酮酸參與此條通路；精氨酸和脯氨酸代謝，通路內(nèi)含38個(gè)化合物，4-羥基-脯氨酸、鳥氨酸、丙酮酸參與此條通路；精氨酸生物合成，通路內(nèi)含14個(gè)化合物，鳥氨酸、尿素參與此條通路；甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝，通路內(nèi)含33個(gè)化合物，蘇氨酸、丙酮酸參與此條通路；纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解，通路內(nèi)含40個(gè)化合物，異亮氨酸、亮氨酸參與此條通路。

表3 參麥注射液干預(yù)高血壓心力衰竭的顯著代謝通路分析結(jié)果

3 討論

高血壓病常進(jìn)展為心室肥大和心肌纖維化，損害心臟的舒張功能，最終導(dǎo)致慢性心力衰竭［7］。心臟結(jié)構(gòu)與功能的損傷，必然導(dǎo)致體內(nèi)某些代謝功能的失衡。本研究鑒定的7條高血壓心力衰竭顯著代謝通路，均與氨基酸代謝密切相關(guān)，提示氨基酸代謝紊亂是高血壓心力衰竭的主要代謝表征。正常生理?xiàng)l件下，心臟可利用多種底物產(chǎn)生能量以滿足機(jī)體需求，其中糖、脂的有氧氧化為主要能量來源，氨基酸供能僅占心臟耗能的極小部分［8］。機(jī)體心力衰竭時(shí)，糖、脂氧化供能障礙，心臟產(chǎn)能底物發(fā)生轉(zhuǎn)移，此時(shí)動(dòng)員氨基酸代謝以供給能量，故可見高血壓心力衰竭模型的氨基酸水平及其相關(guān)的代謝通路受擾動(dòng)［9］。丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蘇氨酸等氨基酸類物質(zhì)參與了氨酰tRNA的生物合成，氨酰tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸以促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成［10］。氨基酸代謝異常可直接影響氨酰tRNA的生物合成通路，并導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，參麥注射液可促使氨基酸代謝表型向正?；卣{(diào)，從而調(diào)節(jié)氨酰tRNA水平，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。

纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸統(tǒng)稱為支鏈氨基酸，對(duì)心肌組織具有重要的供能作用［11］。隨著高血壓心力衰竭的病程發(fā)展，心肌持續(xù)性缺血缺氧，能量代謝效率低，此時(shí)支鏈氨基酸處于加速分解以供應(yīng)能量的應(yīng)急代謝狀態(tài)，故可見支鏈氨基酸及其通路異常［12］。在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路中，谷氨酰胺在氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用下進(jìn)入細(xì)胞，并在線粒體中經(jīng)谷氨酰胺酶催化的脫氨反應(yīng)轉(zhuǎn)化成谷氨酸，谷氨酸被谷氨酸脫氫酶、丙氨酸、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸［13］。三羧酸循環(huán)是需氧生物獲得能量的關(guān)鍵來源，而α-酮戊二酸是三羧酸循環(huán)的重要中間產(chǎn)物，具有生成氨基酸作用［14］。上述通路異常反映高血壓心力衰竭模型存在能量代謝失衡，參麥注射液可通過調(diào)節(jié)支鏈氨基酸的合成與降解，改善能量代謝的相關(guān)通路紊亂，以增強(qiáng)衰竭心臟的能量供應(yīng)。

精氨酸在一氧化氮合成酶的作用下產(chǎn)生一氧化氮，是合成一氧化氮的關(guān)鍵底物［15］。精氨酸通過一氧化氮的信使分子作用，間接擴(kuò)張血管，改善血液循環(huán)。脯氨酸為生物體內(nèi)膜和酶的保護(hù)物質(zhì)及自由基清除劑，可保護(hù)血管內(nèi)皮免受損傷。精氨酸、脯氨酸與心血管的結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)，兩者在血漿中的水平常因血管內(nèi)膜病變而改變［16］。參麥注射液可調(diào)節(jié)精氨酸和脯氨酸代謝通路、精氨酸生物合成，減輕血管的應(yīng)激損傷，有助于重塑血管的損傷部位。

已有研究證據(jù)表明，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路與炎癥反應(yīng)的關(guān)系尤為密切［17］。本研究所選取的模型是通過持續(xù)高鹽飲食所誘導(dǎo)，高鹽飲食可刺激血管內(nèi)皮，損傷內(nèi)皮細(xì)胞而誘發(fā)血管炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生眾多炎癥反應(yīng)標(biāo)志物，使血管結(jié)構(gòu)與功能持續(xù)性受損，繼而促進(jìn)高血壓病等心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展［18］。本研究表明血管炎癥是高血壓心力衰竭的病理基礎(chǔ)，而調(diào)控炎癥反應(yīng)是參麥注射液干預(yù)高血壓心力衰竭的作用機(jī)制之一。

谷胱甘肽由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成，是一種含有巰基的三肽。谷胱甘肽為細(xì)胞內(nèi)重要的調(diào)節(jié)代謝物質(zhì)，直接參與生物體內(nèi)的TCA、糖代謝等途徑，并能激活巰基酶-輔酶等酶的活性，進(jìn)一步促進(jìn)糖、脂、蛋白質(zhì)代謝［19］。有研究表明，谷胱甘肽的水平紊亂是細(xì)胞凋亡早期激活的潛在信號(hào)，隨后產(chǎn)生的氧自由基可致使細(xì)胞凋亡［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽代謝通路異常參與了高血壓心力衰竭的病理過程，而參麥注射液的有效靶標(biāo)未涉及此條通路。鑒于氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)未能涵蓋生物體內(nèi)的所有內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，參麥注射液對(duì)谷胱甘肽代謝通路是否具有調(diào)控作用，仍有待進(jìn)一步的研究。

生物信息學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展，提供了一個(gè)解讀代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的最佳模式和新工具［21］。在已知代謝產(chǎn)物基礎(chǔ)上，依托生物信息學(xué)研究工具，分析相關(guān)聯(lián)的代謝通路網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)氨基酸代謝紊亂是高血壓心力衰竭的關(guān)鍵病理機(jī)制，氨基酸代謝障礙將逐步影響蛋白質(zhì)合成、谷胱甘肽代謝、心臟能量供應(yīng)和心血管結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致靶器官心臟的損傷和供能不足。以7條受擾動(dòng)的代謝通路作為潛在藥物靶標(biāo)，發(fā)現(xiàn)參麥注射液的有效靶標(biāo)涉及其中6條通路，此外還包括纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解通路，這些關(guān)鍵信息反映了與參麥注射液相關(guān)聯(lián)的生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)改變，揭示參麥注射液對(duì)高血壓心力衰竭的干預(yù)機(jī)制涉及改善氨基酸代謝紊亂、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、優(yōu)化心臟能量供應(yīng)、調(diào)控炎癥反應(yīng)等多個(gè)層面，為疾病的治療和中藥制劑的合理運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。