呂佳譽(yù)，崔向?qū)?，蘇文革

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南250014；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院，北京100053；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東濟(jì)南250014

生脈散由人參、麥冬、五味子三味藥組成，最早載于《醫(yī)學(xué)啟源》，后世亦稱(chēng)之為生脈湯、參麥散、生脈飲、定肺湯等。生脈散具有益氣生津、斂陰復(fù)脈之效，是治療氣陰兩虛證的經(jīng)典方劑［1］。心律失常是心血管系統(tǒng)常見(jiàn)病癥，嚴(yán)重者可危及生命。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞電生理學(xué)技術(shù)的發(fā)展，心律失常的機(jī)制逐漸明晰，如KCND3鉀離子通道基因與心肌早期復(fù)極化有關(guān)［2］，SCN5A鈉離子通道蛋白與進(jìn)行性惡性心律失常及擴(kuò)張型心肌?。?］相關(guān)，連接蛋白43（Connexin-43，Cx43）脫磷酸作用會(huì)導(dǎo)致缺血/再灌注損傷心臟的心律失常和心肌細(xì)胞凋亡［4］，巨噬細(xì)胞的極化通過(guò)縫隙連接和KCa3.1激活導(dǎo)致心肌梗死后心律失常和異構(gòu)復(fù)極化［5］，氧化應(yīng)激可能導(dǎo)致心臟的結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)，在心房顫動(dòng)的發(fā)病機(jī)制中具有潛在作用［6］。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)展為藥物的大數(shù)據(jù)管理、中藥分子機(jī)制研究提供方便［7］，且能夠預(yù)測(cè)中藥復(fù)方治療臨床疾病的作用機(jī)制，篩選藥物有效成分，節(jié)約藥物研發(fā)費(fèi)用［8］。生脈散在心血管疾病治療中的運(yùn)用和研究較多。Ma等［9］發(fā)現(xiàn)生脈散可對(duì)急性心肌梗死所致心力衰竭房顫大鼠通過(guò)腫瘤壞死因子-β1（tumor necrosis factor-β1，TGF-β1）途徑抑制肌成纖維細(xì)胞分化、減少房顫的傳導(dǎo)率和縮短房顫持續(xù)時(shí)間，Wu等［10］實(shí)驗(yàn)表明，生脈散可通過(guò)改善心肌梗死后心臟結(jié)構(gòu)和減少Cx43的表達(dá)，降低心肌梗死大鼠心室顫動(dòng)閾值等。為了深入探討生脈散治療心律失常的分子機(jī)制，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，分析生脈散治療心律失常的潛在靶點(diǎn)及相關(guān)通路，為進(jìn)一步研究提供思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 生脈飲藥物成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）和中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（Traditional Chinese Medicines Integrated Database，TCMID）檢索生脈散的化學(xué)成分，根據(jù)成分毒藥物動(dòng)力學(xué)（absorption and distribution and metabolism and excretion，ADME）參數(shù)篩選生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似性（drug likeness，DL）≥0.18的主要活性成分，并對(duì)主要活性成分在TCMSP和STITCH網(wǎng)站中進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，在Uniprot網(wǎng)站確定靶點(diǎn)的簡(jiǎn)稱(chēng)及編號(hào)。

1.2 心律失常疾病靶點(diǎn)檢索在TTD、DRUGBANK及DisGeNET 3個(gè)常用疾病數(shù)據(jù)庫(kù)中以“arrhythmic”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，在DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出分值較高的靶點(diǎn)，與另外兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出的靶點(diǎn)合并，去掉重復(fù)值，獲得心律失常疾病靶點(diǎn)。

1.3 生脈飲、心律失常共同靶點(diǎn)獲取及關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選將生脈飲的作用靶點(diǎn)和心律失常的疾病靶點(diǎn)錄入VENNY2.0網(wǎng)站并繪制韋恩圖（Venn diagram），獲得心律失常疾病與生脈飲藥物的共同靶點(diǎn)。將所得的共同靶點(diǎn)輸入STRING平臺(tái)，建立靶點(diǎn)間的相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出最高置信度（得分0.900）的靶點(diǎn)作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，得出關(guān)鍵成分。

1.4 構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)生脈散治療心律失常的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG和GO通路富集分析，篩選出P＜0.01的重要通路，將成分、靶點(diǎn)、通路運(yùn)用Excel表格建立對(duì)應(yīng)關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape3.2.1并運(yùn)用Network Analyzer插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，構(gòu)建生脈散-心律失常的“成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)關(guān)鍵參數(shù)自由度（degree）和介數(shù)（betweenness centrlity）進(jìn)一步篩選關(guān)鍵通路。

2 結(jié)果

2.1 生脈飲有效活性成分及靶點(diǎn)使用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索人參、五味子的化合物，從TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索麥冬的有效成分，將所有化合物根據(jù)設(shè)定的ADME參數(shù)篩選入血活性成分。人參22個(gè)，五味子8個(gè)，麥冬55個(gè)，刪除重復(fù)項(xiàng)，生脈散主要成分有84個(gè)；將人參、五味子、麥冬的成分在TCMSP中進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，并在Pubchem網(wǎng)站查找其化合物smile號(hào)，在STITCH網(wǎng)站根據(jù)score值篩選其作用靶點(diǎn)，得到預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，人參99個(gè)，五味子22個(gè)，麥冬59個(gè)，去掉重復(fù)的靶點(diǎn)，故生脈散作用靶點(diǎn)為127個(gè)。

2.2 心律失常疾病靶點(diǎn)結(jié)果分析通過(guò)對(duì)TTD、DRUGBANK及DisGeNET 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行“arrhythmia”關(guān)鍵詞檢索，TTD數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到36個(gè)靶點(diǎn)，DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到108個(gè)靶點(diǎn)，DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到589個(gè)靶點(diǎn)，在DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)選取靶點(diǎn)Score值高于平均值的靶點(diǎn)，共162個(gè)，與前兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中的靶點(diǎn)合并，刪除重復(fù)靶點(diǎn)后共獲得心律失常疾病靶點(diǎn)180個(gè)。

2.3 共同關(guān)鍵靶點(diǎn)獲取結(jié)果

2.3.1 生脈飲、心律失常共同靶點(diǎn)韋恩圖使用VENNY2.1在線網(wǎng)頁(yè)計(jì)算結(jié)果并繪制出韋恩圖，得到人參、麥冬、五味子與心律失常各自共同靶點(diǎn)及各自所占比例，顯示出生脈散與心律失常的共同關(guān)鍵靶點(diǎn)30個(gè)，見(jiàn)圖1。

圖1 生脈散與心律失常交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.3.2 關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選將2.3.1中篩選出的生脈散與心律失常共同靶點(diǎn)輸入String數(shù)據(jù)庫(kù)中，構(gòu)建靶點(diǎn)間相互作用網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2。設(shè)置highest confidence為0.9，分析得到23個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，關(guān)鍵成分19個(gè)，見(jiàn)表1。生脈散有效成分治療心律失常的關(guān)鍵靶點(diǎn)，通過(guò)Cytoscape3.2.1形成網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。

圖2 生脈散治療心律失常靶點(diǎn)功能相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

2.4.1 富集通路分析及重要通路篩選將生脈散治療心律失常的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，做KEGG和GO通路分析，得到64個(gè)信號(hào)通路，根據(jù)P＜0.01篩選出36條重要通路，運(yùn)用E Chart網(wǎng)站制作氣泡圖，見(jiàn)圖4。點(diǎn)的顏色從綠色到紅色代表P值從小到大，顯示生脈散作用于心律失常通路主要富集于鈣離子信號(hào)通路（Calcium signaling pathway）、腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號(hào)通路（adenylate cyclase-activating adrenergic receptor signaling pathway）、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cyclic guanosinemonophosphate，cGMP）-PKG信號(hào)通路、環(huán)腺苷-3′，5′-磷酸（cyclic adenosinemonophosphate，cAMP）信號(hào)通路等，與交感神經(jīng)反射、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子通道等相關(guān)。

圖3 生脈散重要成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 生脈散抗心律失常的通路富集分析

表1 生脈散治療心律失常重要靶點(diǎn)及成分

2.4.2 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將篩選出的藥物關(guān)鍵成分19個(gè)，共同關(guān)鍵靶點(diǎn)23個(gè)，關(guān)鍵通路35個(gè)，使用Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖5A。使用軟件中的“Network Analyzer”插件進(jìn)行分析，根據(jù)節(jié)點(diǎn)度值和介數(shù)值顯示ADRB2、ADRA1B、ADRA1A、PTGS2、ADRA1D、ADRB1、CHRM3、CHRM1等靶點(diǎn)度值較高，根據(jù)度值、介數(shù)制作圖5B，以節(jié)點(diǎn)大小代表度值大小，以顏色深淺代表介數(shù)大??；并將其中度值較高的10個(gè)關(guān)鍵通路列于表2。

表2 生脈散治療心律失常重要通路

3 討論

3.1 中醫(yī)理論探討中醫(yī)學(xué)本無(wú)心律失常病名，因其臨床常見(jiàn)心悸、胸悶、氣短、驚慌不安等不能自主的自覺(jué)癥狀，并結(jié)合脈象的參伍不調(diào)，可參照中醫(yī)的“心悸、怔忡”辨證論治［11］。其病因多為外感六淫、七情內(nèi)傷、飲食勞倦、失治誤治、藥物影響等。病機(jī)現(xiàn)虛實(shí)兩端，虛者為心臟或兼有其他臟腑的氣血陰陽(yáng)虧虛而致心神失養(yǎng)，實(shí)者為風(fēng)、寒、熱、痰、濕、氣滯和血瘀致心神受擾［12］。生脈散中“人參之甘補(bǔ)氣，麥門(mén)冬苦寒，瀉熱補(bǔ)水之源，五味子之酸，清肅燥金”（《內(nèi)外傷辨惑論》），三者合用共奏大補(bǔ)上焦氣陰之功，使得氣充而脈復(fù)，故尤適宜于心悸、怔忡之氣陰兩虛者。臨床統(tǒng)計(jì)表明，生脈散及其加減、合方在治療各種心律失常方面有效，包括快速性心律失常［13］、緩慢性心律失常［14］、室性早搏［15］、房性早搏［16］、房顫［17］等及合并冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、心力衰竭、風(fēng)濕性心臟病、心肌炎等疾病。

3.2 多成分-多靶點(diǎn)-多通路治療機(jī)制本研究通過(guò)TCMSP和TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出生脈散有效活性成分84個(gè)，可能治療靶點(diǎn)127個(gè)，使用TTD、DRUGBANK及DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出心律失常疾病靶點(diǎn)共180個(gè)，將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行韋恩圖繪制，獲得兩者共同靶點(diǎn)30個(gè)。共同靶點(diǎn)輸入String中，得到生脈散治療心律失常靶點(diǎn)間相互作用網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)置信度篩選出生脈散治療心律失常的關(guān)鍵靶點(diǎn)，如ESR2、SCN5A、CYP1A2、CYP2C19、MAOB、ADRA1A、MAOA、ADRB1、TNF、CHRM2、CHRM1、DRD1等共23個(gè)，關(guān)鍵成分19個(gè)，對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)使用DAVID網(wǎng)站中的KEGG和GO通路富集進(jìn)行分析，獲得64條信號(hào)通路，根據(jù)P值篩選，得到鈣離子信號(hào)通路（Calcium signaling pathway）、腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號(hào)通路（adenylate cyclase-activating adrenergic receptor signaling pathway）、心肌細(xì)胞的腎上腺素能信號(hào)通路（Adrenergic signaling in cardiomyocytes）等35條重要通路。通過(guò)使用Cytoscape 3.2.1構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，顯示生脈散具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的復(fù)方作用特點(diǎn)，不同靶點(diǎn)和通路共同發(fā)揮藥效，具有治療心律失常的重要潛力。

3.3 重要通路分析房性心律失?？捎赦}離子通路信號(hào)（Calcium signaling pathway）增加導(dǎo)致，心室重構(gòu)亦與Ca2+信號(hào)系統(tǒng)有關(guān)［18］。大量臨床試驗(yàn)研究表明，交感神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)度激活是引發(fā)室性心律失常和心臟性猝死的重要機(jī)制［19］，心肌間質(zhì)中高濃度的腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺可導(dǎo)致心肌細(xì)胞鈣超載和交感神經(jīng)末梢本身的損傷，進(jìn)而增加惡性心律失常的風(fēng)險(xiǎn)［20］。G蛋白家族與心血管疾病密切相關(guān)，G蛋白在心臟表達(dá)的亞型有Gs、Gi/o、Gq/11、G12/13等，參與心肌收縮力、心率、心律等調(diào)節(jié)［21］。腺苷酸環(huán)化酶（adenyl cyclase，AC）是G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPCR）下游的關(guān)鍵信號(hào)分子［22］，可通過(guò)調(diào)節(jié)cAMP的濃度參與多種生理病理過(guò)程，Gsα可激活A(yù)C，通過(guò)ACcAMP-PKA通路介導(dǎo)β-腎上腺素受體的正性頻率作用，還可通過(guò)cAMP直接作用于L型鈣離子通道，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的釋放［23］，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)；Giα介導(dǎo)M2-膽堿受體激動(dòng)劑的鉀離子通道激活，從而參與心率的調(diào)節(jié)。G蛋白偶聯(lián)的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)（regulator of G-protein signaling system，RGSs）為作為治療心律失常的重要靶向途徑［24］。cGMP是細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)一氧化氮和利鈉肽作用的第二信使，細(xì)胞內(nèi)cGMP水平升高，通過(guò)cGMP依賴(lài)蛋白激酶等發(fā)揮生理作用，PKG1亞型可使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低，或使肌肉細(xì)胞對(duì)Ca2+的敏感性降低而導(dǎo)致平滑肌松弛。唾液分泌（Salivary secretion）受自主神經(jīng)末梢釋放的神經(jīng)遞質(zhì)刺激而產(chǎn)生，交感刺激導(dǎo)致腺苷酸環(huán)化酶的激活和細(xì)胞內(nèi)cAMP的積累，副交感神經(jīng)刺激激活磷脂酶C，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高，此通路雖與抗心律失常的治療作用關(guān)系不甚密切，卻提示藥物可能帶來(lái)的不良反應(yīng)?，F(xiàn)在許多抗心律失常藥如普羅帕酮、地爾硫卓等均有口干等不良反應(yīng)。

3.4 有效成分探討通過(guò)Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)及“Network Analyzer”插件進(jìn)行分析，得到度值及介數(shù)值較高的有效成分包括:豆甾醇（Stigmasterol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、蘇齊內(nèi)酯（suchilactone）、山奈酚（kaempferol）、灌木遠(yuǎn)志酮A（Frutinone A）、人參皂苷（ginsenoside rh2）、Fumarine、Inermin、Girinimbin、Gomisin R等，其中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明山奈酚可通過(guò)影響Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白減少應(yīng)激誘導(dǎo)的室性心動(dòng)過(guò)速的發(fā)作［25］，減少炎癥和氧化應(yīng)激，抑制血管緊張素II誘導(dǎo)的心臟纖維化和功能障礙［26］；人參皂苷rh2可通過(guò)清除大鼠心肌組織內(nèi)ROS、提高抗氧化酶活性，從而降低大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平、改善大鼠心肌損傷［27-28］；β-谷甾醇可通過(guò)上調(diào)谷胱甘肽氧化循環(huán)實(shí)現(xiàn)對(duì)雌性大鼠的心肌保護(hù)作用［29］等。有效成分的分子機(jī)制，仍有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究和臨床實(shí)踐。