李曼，齊大明，王鑫源，李詢，邢冰，楊朝帆，董誠明

河南中醫(yī)藥大學，河南鄭州450046

牛膝（Achyranthes bidentata B1.）為莧科牛膝屬多年生草本植物，以干燥根入藥，為常用大宗藥材品種之一，主產于河南溫縣、河南武陟、內蒙古赤峰、河北安國等地，有較高的藥用價值和經濟價值，繁殖方式主要是種子繁殖，種子分為秋子和蔓薹子?，F(xiàn)有研究表明，不同產地牛膝在化學成分含量方面存在差異［1-4］。近年來，對于牛膝的研究也多集中在化學、藥理等方面［5-9］，關于分子標記研究牛膝遺傳多樣性及遺傳結構的報道較少［10-11］。與其他分子標記技術相比，簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性分子標記（intersimple sequence repeat，ISSR）具有穩(wěn)定、多態(tài)性高、簡便及易操作等優(yōu)點，被視為理想的遺傳標記方法［12］。目前ISSR已在多種動植物的親緣關系、種質鑒定等研究方面得到應用［13］。本研究應用ISSR分子標記法，分析不同產地牛膝的遺傳多樣性及親緣關系，對牛膝規(guī)范化種植及資源開發(fā)等方面提供科學依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗藥材采集內蒙古、河北、河南等地的牛膝種子；牛膝經河南中醫(yī)藥大學董誠明教授鑒定為莧科植物牛膝（Achyranthes bidentata B1.）。采集信息見表1。

表1 采集信息表

1.2 實驗儀器NanoDropTMOne超微量紫外分光光度計（美國賽默飛公司）；超低溫冰箱（青島海爾股份有限公司）；C1000 TouchTM梯度PCR儀（美國伯樂公司）；JW-2018H冷凍高速離心機（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；DYCP-31E型瓊脂糖凝膠電泳儀（北京市六一儀器廠）；GelDoc XR+凝膠成像儀（美國BIO-RAD公司）；LDZM-80KMS型立式蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；BCD-215KS型冰箱（青島海爾股份有限公司）；迷你掌上離心機（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；微量移液槍（德國艾本德有限公司）。

1.3 實驗試劑DNA提取試劑盒（批號:CW0531M）、2×Es Taq MasterMix（Dye）、Gold View I型核酸染色劑、DM2000、DM15000、2×Es Taq MasterMix（Dye）等（康為世紀生物科技有限公司）；瓊脂糖、Tris［三（羥甲基）氨基甲烷］（北京索來寶科技有限公司）；10×Lodding Buffer［寶生物工程（大連）有限公司］。

2 實驗方法

2.1 DNA的提取及檢測取保存的牛膝樣品，采用植物試劑盒方法提取基因組DNA。將所得的DNA溶液分別裝入滅菌后離心管中，于 -20℃保存。將保存的DNA用質量分數(shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓130V，電泳40min。在GelDoc XR+凝膠成像儀上成像，保存DNA檢測結果。

2.2 PCR引物的篩選、ISSR-PCR擴增及檢測

參考牛膝、川牛膝以及莧科植物等［10，14-15］研究文獻中出現(xiàn)的引物，以及加拿大哥倫比亞大學（UBC）公布的100條ISSR引物序列，隨機選取2個牛膝樣品模板DNA，采用最優(yōu)ISSR-PCR體系中的擴增條件，從ISSR引物中篩選出16條反應體系較穩(wěn)定、擴增條帶較清晰且多態(tài)性較多的引物，最優(yōu)引物序列見表2。PCR反應體系總體積為20μL，含有DNA樣品1μL，引物1μL，2×Es Taq MasterMix（Dye）10μL，加ddH2O至體積20μL。反應程序:94℃預變形5 min，95℃變性1 min，52～57℃退火1 min，72℃總延伸5 min，共35個循環(huán)，4℃保存。PCR產物質量分數(shù)2%瓊脂糖凝膠、1×TAE電泳緩沖液中電泳40 min，電壓為130V。Marker為2 000 bp。電泳后，在GelDoc XR+凝膠成像儀上拍照并保存DNA檢測結果。

2.3 數(shù)據(jù)分析根據(jù)樣品ISSR擴增譜帶信息，按照鄒喻萍等［16］制定的標準，以擴增條帶有計為“1”，無計為“0”。用Quantity One軟件對圖譜上的條帶進行人工標記，并導出為0-1矩陣的數(shù)據(jù)。采用POPGENE3.2軟件計算出遺傳特征值:有效等位基因數(shù)（ne）、觀測等位基因數(shù)（na）、多態(tài)性位點比例（P）、香農信息指數(shù)（I）、遺傳分化系數(shù)（Gst）、基因流（Nm）等，進行遺傳多樣性分析。用NTSYS2.10軟件對不同產地牛膝進行個體間的UPGMA聚類分析。

表2 最優(yōu)引物序表

3 結果

3.1 SSR-PCR擴增結果用篩選出的16條引物對6個采集地的39個樣品進行擴增，共擴增出251條條帶，在多態(tài)性條帶中其有效條帶數(shù)為233條，有效條帶數(shù)占總條帶數(shù)的92.83%。16條引物擴增出的條帶數(shù)為8～23條，引物UBC-889擴增出的條帶最多為23條；16條引物在所有樣品中所擴增出的引物有效條帶數(shù)為8～21條；引物在不同產地牛膝中擴增出來的有效條帶數(shù)為0～16條；不同產地牛膝共擴增出196條多態(tài)性條帶。PCR擴增結果見表3，引物UBC-834對牛膝的PCR擴增結果見圖1。

3.2 牛膝遺傳多樣性分析對不同產地牛膝進行遺傳多樣性統(tǒng)計分析，結果見表4。由多態(tài)性位點可知，牛膝的遺傳變異情況由低到高為HJWXM＜HJWZQ＜NMGCF＜HJWXQ＜HNAG＜HJWZM，變化范圍為19.92%～45.02%；由等位基因數(shù)（na）可知，牛膝的遺傳變異情況由低到高為HJWXM ＜HJWZQ＜NMGCF＜HJWXQ＜HNAG＜HJWZM，變化范圍為1.199 2～1.450 2；由有效等位基因數(shù)（ne）可知，牛膝的變異情況由低到高依次為HJWXM＜HJWZQ＜NMGCF＜HJWXQ＜HJWZM ＜HNAG，變化范圍為1.159 0～1.268 5；由Nei′s基因多樣性指數(shù)（h）得出，牛膝的變異情況由低到高依次為HJWXM＜HJWZQ＜NMGCF＜HJWXQ＜HJWZM＜HNAG，變化范圍為0.088 5～0.159 0；依據(jù)香農信息指數(shù)（I），牛膝的變異情況由低到高依次為HJWXM＜HJWZQ＜NMGCF＜HJWXQ＜HJWZM ＜HNAG，變化范圍為0.126 8～0.237 8。

表3 不同采集地ISSR引物擴增條帶結果

圖1 引物UBC-834對牛膝的PCR擴增結果圖

對不同產地牛膝的遺傳多樣性進行分析評價可知，香農信息指數(shù)（I）、Nei′s基因多樣性指數(shù)（h）、有效等位基因數(shù)（ne）、多態(tài)性位點和等位基因數(shù)（na）對牛膝的變異情況基本一致。

表4 牛膝的遺傳變異分析結果（±s）

表4 牛膝的遺傳變異分析結果（±s）

類型 樣本數(shù) 多態(tài)性位點（P）/個（%）等位基因數(shù)（na）有效等位基因數(shù)（ne） Nei′s基因多樣性指數(shù)（h） 香農信息指數(shù)（I ）0.237 8±0.282 1 NMCF 7 93（37.05）1.370 5±0.483 9 1.222 1±0.330 4 0.132 7±0.184 3 0.199 4±0.269 9 HJWZQ 7 87（34.66）1.346 6±0.476 8 1.221 9±0.345 3 0.129 1±0.188 5 0.192 0±0.273 4 HJWZM 9 111（45.02）1.450 2±0.498 5 1.256 4±0.338 1 0.1544±0.1877 0.233 9±0.273 8 HJWXQ 6 95（37.85）1.378 5±0.486 0 1.240 1±0.348 0 0.141 0±0.190 8 0.210 1±0.277 8 HJWXM 3 50（19.92）1.199 2±0.400 2 1.159 4±0.320 2 0.088 5±0.177 9 0.126 8±0.254 7總共39 196（78.09）1.780 9±0.414 5 1.350 9±0.333 3 0.217 0±0.177 1 HBAG 7 109（43.43）1.434 3±0.496 7 1.268 5±0.350 3 0.159 0±0.193 8 0.337 6±0.248 1

3.3 遺傳結構分析對不同產地牛膝的遺傳結構分析可知，牛膝的總遺傳多樣性指數(shù)（Ht）為0.223 7±0.033 7，種內遺傳多樣性指數(shù)（Hs）為0.134 1±0.013 9，基因分化系數(shù)（Gst）為0.400 3，不同種群間的基因流（Nm）為0.749 2，多態(tài)性位點的比例（P）為196（78.09%），香農信息指數(shù)（I）為0.337 6±0.248 1。牛膝種群間的遺傳變異為40.03%，表明不同產地牛膝基因交流程度較高，遺傳分化較小。

3.4 遺傳距離與遺傳一致度對不同產地牛膝進行遺傳距離與遺傳一致度分析，結果見表5。不同產地牛膝之間遺傳一致度為0.789 1～0.950 6、遺傳距離為0.050 7～0.236 9，表明不同產地牛膝間的親緣關系較近，不同繁殖類型牛膝親緣關系也相近。

表5 牛膝的遺傳距離與遺傳一致度

3.5 聚類結果分析

3.5.1 產地聚類分析對不同產地牛膝的遺傳一致度進行聚類分析，聚類結果見圖2。系統(tǒng)聚類時其遺傳一致度為0.79～0.95。由相似系數(shù)0.87處可將牛膝分為2類，第Ⅰ類為HBAG、NMGCF、HJWZQ、HJWZM，第Ⅱ類為HJWXQ和HJWXM。第Ⅰ類繼續(xù)細分，又可分為2個亞類，HBAG 和NMGCF為一個亞類，HJWZQ和HJWZM 為另一個亞類。由聚類分析可知，河北安國、內蒙古赤峰、河南武陟、河南溫縣間的親緣關系較近，秋子與蔓薹子親緣也較近。

3.5.2 個體間聚類分析使用Ntsys2.1軟件對6個采集地的39個樣品基于遺傳相似性系數(shù)進行UPGMA聚類，聚類結果見圖3。聚類結果顯示，從相似系數(shù)0.75處劃分，39個樣品共聚為2類，樣品1-32聚為一類，表明內蒙古赤峰、河北安國與河南武陟牛膝的親緣關系較近；樣品33-39聚為一類，相同產地的牛膝基本聚為一類，也有少數(shù)同一產地的牛膝樣品沒有聚在一類，如樣品13、14交錯于樣品1-7之間，表明內蒙古赤峰與河北安國的親緣關系較近；樣品22、24交錯于樣品12-21之間，說明河南武陟秋子和蔓薹子的親緣關系較近；樣品31-36為河南溫縣的秋子和蔓薹子，其樣品相互交錯著，表明河南溫縣秋子和蔓薹子的親緣關系一致。結合產地聚類和個體聚類結果可知，內蒙古赤峰、河北安國、河南武陟、河南溫縣牛膝親緣關系較近，秋子與蔓薹子親緣較近。

圖2 牛膝遺傳聚類UPGMA聚類圖

圖3 個體間遺傳聚類的UPGMA聚類圖

4 討論

本研究利用ISSR方法對不同產地牛膝進行遺傳多樣性分析。由遺傳多樣性分析可知，不同產地牛膝基因交流程度較高，遺傳分化較小，孔德政等［17］對河南省內8個野生牛膝種群進行遺傳多樣性分析，結果顯示河南省內的野生牛膝種群間的遺傳分化較低，種群間的基因交流較高，遺傳多樣性相對較低，與實驗結果相一致。由遺傳距離進行親緣關系分析，不同產地牛膝之間遺傳一致度為0.789 1～0.950 6、遺傳距離為0.050 7～0.236 9，表明不同產地牛膝間的親緣關系較近；根據(jù)聚類結果分析可知，不同產地的牛膝遺傳結構不嚴格按地理距離劃分，表明不同產地牛膝有較大的基因交流程度，在對產地聚類和個體聚類時發(fā)現(xiàn)，兩者結果相似，河北安國、內蒙古赤峰和河南武陟親緣較近，河北安國和內蒙古赤峰為近年來新興的牛膝主產區(qū)，由河南焦作道地產區(qū)引種栽培，雖已種植多年，但遺傳變異較小。秋子與蔓薹子因種子的繁殖方式不同對牛膝的生殖、產量等造成差異，但其遺傳物質一致，由此遺傳多樣性較小，親緣關系相近。

ISSR分子標記在親緣關系鑒定、遺傳關系、種質鑒定等方面應用較為廣泛。楊正久等［18］采用ISSR分子標記，對21份貴州金錢草資源進行聚類分析，分為2大類群6個亞群，貴州野生金錢草具有豐富的遺傳多樣性。巨秀婷等［19］采用ISSR分子標記對5個新疆野生郁金香品種和19個郁金香栽培品種進行遺傳多樣性分析，結果表明野生品種與栽培品種之間遺傳距離較遠，且大部分栽培品種之間親緣關系較近，為合理利用野生郁金香種質資源提供分子水平的研究基礎。因此，未來可通過分子標記方法對牛膝親緣關系鑒定，結合不同產地牛膝的質量評價，為牛膝規(guī)范化種植及資源開發(fā)等提供科學依據(jù)。