邢錫熙，吳紹欽，沈存思，李建香，王益俊，嚴晶

1.南京市江寧區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，江蘇南京211100；2.南京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院中醫(yī)兒科學研究所/江蘇省兒童呼吸疾病（中醫(yī)藥）重點實驗室，江蘇南京210023；3.南京中醫(yī)藥大學附屬南京中醫(yī)院，江蘇南京210001；4.南京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院代謝病中醫(yī)研究重點實驗室，江蘇南京210023

急性腦出血（acute intracerebral hemorrhage，AICH）約占急性腦血管病的10% ～20%，其發(fā)病率、復發(fā)率、病死率和致殘率高，給社會和家庭帶來沉重的負擔［1］。除了急性期顱內(nèi)血腫對腦組織造成壓迫，產(chǎn)生占位效應及其分解產(chǎn)物造成腦組織損傷外，繼發(fā)性的腦水腫和炎癥反應等亦會加重腦損傷［2］。西醫(yī)內(nèi)科多采用脫水、利尿、降顱壓等方法，外科多以清除血腫、去骨瓣降顱壓等治法為主，但會遺留除疾病本身以外手術創(chuàng)傷帶來的合并癥［3］。雖然目前已有一些針對炎癥因子的藥物，如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）抑制劑等，但仍處于試驗階段［4］。中醫(yī)以辨證論治為基礎，復方見長。諸多研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合中藥治療可顯著提高臨床療效［5］。課題組所擬中風1號方具有涼血活血、通腑泄熱、開竅通絡、上下并治之功，聯(lián)合應用后臨床療效顯著。本文主要觀察其對神經(jīng)損傷、腦水腫、血腦屏障、炎癥因子的影響，初步揭示其神經(jīng)保護作用機制。

1 材料

1.1 動物SD雄性大鼠144只，清潔級，體質(zhì)量200～250 g，南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供［動物合格證號:SCXK（蘇）2017-0001］，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學動物實驗中心。室溫23～25℃、相對濕度65% ～70%，飼養(yǎng)環(huán)境清潔、安靜。大鼠自由飲水、飲食，適應性飼養(yǎng)1周后再進行實驗。

1.2 藥物及試劑中風1號方由生大黃10 g，生地黃10 g，牡丹皮12 g，三七3 g，全瓜蔞15 g，石菖蒲10 g組成。購于南京市江寧區(qū)中醫(yī)醫(yī)院中藥房，按傳統(tǒng)方法煎煮熬制，濃縮至含0.54 g·mL-1生藥的藥液，調(diào)整pH至7.0，無菌操作過濾除菌后，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ廖乃妓{（Evans Blue，EB）（Solarbio，貨號:E8010）；大鼠TNF-αELISA試劑盒（福麥斯生物，貨號:ELR010）；大鼠IL-1βELISA試劑盒（福麥斯生物，貨號:ELR002）。

1.3 儀器腦立體定位儀（北京智鼠多寶，型號:DB053）；微量進樣器（上海高鴿，50μL）；酶標儀（優(yōu)利特，型號:URIT-660）；電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司，型號:WGL-125B）。

2 方法

2.1 AICH模型的建立采用自體尾部血液注入法造模。0.4%的戊巴比妥鈉（1 mL·100 g-1）腹腔注射麻醉后斷尾取血，用微量進樣器（預先用1‰肝素鈉沖洗）抽取自體不凝血50μL備用。將大鼠以俯臥位用立體定位儀固定在操作臺上，使前后囟處于同一平面，門齒溝的水平與耳間線比較低2.4 mm。沿頭皮正中縱行切開約10 mm，暴露顱骨，依據(jù)《腦立體定位圖譜》定位尾殼核。將微量進樣器固定在立體定位儀上，將微量進樣器尖端垂直于矢狀縫右側(cè)旁開3.0 mm，前囟前0.2 mm處，用三棱針在正對針尖下方鉆一直徑約1.0 mm的小孔，深度達硬腦膜表面，調(diào)整上下坐標尺，以顱骨外板為零點，使微量進樣器進針深度為6.0 mm。按照5μL·min-1的速度，緩慢勻速地將大鼠自體血加50μL注入至尾殼核內(nèi)，注血完成留針約15 min后再緩慢地退針，用骨蠟對鉆孔進行封閉后縫合手術切口，進行常規(guī)消毒后將大鼠側(cè)臥位放置于單獨的鼠籠。假手術組只行進針，不注入自體血，手術操作同其余各組。以上操作均遵守無菌原則。

2.2 分組及給藥將造模成功的大鼠隨機分成3組，每組各36只，即模型+生理鹽水組、模型+中風1號方低劑量組、模型+中風1號方高劑量組，假手術組共36只。并按照指標檢測的時間不同分為24 h、72 h兩個亞組，每亞組隨機分配18只大鼠，用于檢測不同指標。給藥劑量根據(jù)體表面積折算，低劑量相當于成人每日等效劑量（75 g·0.018·0.2 kg-1＝6.75 g·kg-1），低、高劑量比為1∶2。假手術組、模型組（24 h、72 h）均予以等量生理鹽水，灌胃容積均為10 mL·kg-1，低劑量組每日1次，高劑量組每日2次。各組的灌胃療程均以各亞組的時間（24 h、72 h）為準。

2.3 檢測指標

2.3.1 神經(jīng)行為學評分造模結(jié)束及各時間點給藥結(jié)束后，均參照Longa 5級評分法評估神經(jīng)功能損傷程度［6］。評分標準為:0分，無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分，提尾倒掛時血腫對側(cè)前肢緊貼胸壁不能伸展；2分，行走時向血腫對側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，行走或站立時向血腫對側(cè)傾倒；4分，意識障礙，不能行走。評分為1～3分認為造模成功，0分則認為造模失敗，4分和死亡大鼠均被剔除實驗并根據(jù)分組進行相應補充。

2.3.2 腦水腫檢測采用干濕重法檢測腦含水量。分別于24 h、72 h，每組隨機選擇6只大鼠予0.4%戊巴比妥鈉（1 mL·100 g-1）腹腔注射麻醉后斷頭，用鉗剝開硬腦膜，取出整個大腦濾干。沿中線將腦組織切成兩半，再沿穿刺針眼縱切一刀見到水腫，取血腫周圍腦組織約150 mg（濕重），置于100～110℃的干燥箱中，24 h后體質(zhì)量恒定稱重（干重）。

腦組織含水量（%）＝（濕重-干重）/濕重×100%

2.3.3 血腦屏障通透性檢測每組隨機選擇6只大鼠按上法麻醉后，由尾靜脈注入4 mL·kg-1的2%EB溶液，當大鼠眼球結(jié)膜、四肢變藍時，說明EB注入成功。2 h后，開胸通過左心室灌注生理鹽水，直到右心房流出無色液體為止。大鼠斷頭取腦之后，取血腫周圍組織，稱重后加入3 mL的甲酰胺，置于54℃的恒溫水浴箱中孵育24 h。對溶有EB的甲酰胺溶液進行過濾，用分光光度計（λ＝632 nm）測其吸光度值。根據(jù)EB標準曲線計算腦組織EB的含量。

2.3.4 ELISA法檢測TNF-α、IL-1β水平每組剩余的6只按上述方法麻醉后，用鉗剝開硬腦膜，取出待測出血周圍腦組織，檢測TNF-α、IL-1β水平。在酶標儀上測450 nm波長處吸光度（OD值），計算樣本濃度。

2.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，原始數(shù)據(jù)用±s表示，符合正態(tài)分布采用One-Way ANOVA檢驗，不符合正態(tài)分布用Wilcoxon秩和檢驗。以P＜0.05作為有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 中風1號方對AICH模型大鼠神經(jīng)功能的影響與假手術組相比，模型組大鼠24 h、72 h神經(jīng)行為學評分均顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比，中風1號方低、高劑量組大鼠24 h神經(jīng)行為學評分有降低的趨勢（P＞0.05）；中風1號方低、高劑量組大鼠72 h神經(jīng)行為學評分降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。

表1 中風1號方對各時間段AICH模型大鼠神經(jīng)行為學評分的影響（分，±s）

表1 中風1號方對各時間段AICH模型大鼠神經(jīng)行為學評分的影響（分，±s）

注：與同時段假手術組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與同時段模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

24 h 72 h假手術組組別0.00±0.00 0.00±0.00模型組2.50±0.55##1.83±0.41##中風1號方低劑量組2.33±0.52 1.16±0.41△中風1號方高劑量組2.17±0.41 1.00±0.63△△

3.2 中風1號方對AICH模型腦組織含水量的影響與假手術組相比，模型組大鼠24 h、72 h腦組織含水量均增加（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組相比，中風1號方低、高劑量組大鼠24 h腦組織含水量有降低的趨勢（P＞0.05）；中風1號方低、高劑量組大鼠72 h腦組織含水量降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表2 中風1號方對各時間段AICH模型大鼠腦組織含水量的影響（%，±s）

表2 中風1號方對各時間段AICH模型大鼠腦組織含水量的影響（%，±s）

注：與同時段假手術組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與同時段模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

24 h 72 h假手術組組別67.75±5.75 68.37±4.97模型組75.44±4.94#81.49±3.02##中風1號方低劑量組72.00±4.94 74.20±4.53△中風1號方高劑量組70.10±1.45 72.38±2.47△△

3.3 中風1號方對AICH模型血腦屏障的影響

與假手術組相比，模型組大鼠24 h、72 h腦組織EB水平均增加（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組相比，中風1號方高劑量組大鼠24 h腦組織EB水平顯著降低（P＜0.01）；中風1號方低、高劑量組大鼠72 h腦組織EB水平均顯著降低（P＜0.01）。見表3。

表3 中風1號方對各時間段AICH模型大鼠腦組織EB水平的影響（μg·g-1，±s）

表3 中風1號方對各時間段AICH模型大鼠腦組織EB水平的影響（μg·g-1，±s）

注：與同時段假手術組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與同時段模型組比較，△△P＜0.01

24 h 72 h假手術組組別9.70±0.37 9.81±0.52模型組20.00±0.98#29.21±1.78##中風1號方低劑量組18.61±0.74 21.37±1.69△△中風1號方高劑量組16.60±0.45△△17.91±1.13△△

3.4 中風1號方對AICH模型大鼠腦血腫旁組織炎癥因子的影響與假手術組相比，模型組大鼠24 h、72 h腦血腫旁組織TNF-α、IL-1β水平均顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比，中風1號方高劑量組大鼠24 h腦血腫旁組織TNF-α、IL-1β水平顯著降低（P＜0.01）；中風1號方低、高劑量組大鼠72 h腦血腫旁組織TNF-α、IL-1β水平顯著降低（P＜0.01）。見表4。

表4 中風1號對AICH模型大鼠腦血腫旁組織TNF-α、IL-1β的影響（pg·mL-1，±s）

表4 中風1號對AICH模型大鼠腦血腫旁組織TNF-α、IL-1β的影響（pg·mL-1，±s）

注：與同時段假手術組比較，##P＜0.01；與同時段模型組比較，△△P＜0.01

組別24 h TNF-αIL-1β 72 h TNF-αIL-1β 5±37.57模型組1146.19±111.04##1209.49±138.93##994.83±159.07##1066.40±175.96##中風1號方低劑量組1073.17±123.71 1051.21±95.94 754.28±119.20△△811.52±61.44△△中風1號方高劑量組930.57±73.72△△832.40±102.58△△660.17±138.30△△619.18±71.14假手術組68.51±15.38 387.44±36.99 73.26±10.37 413.6△△

4 討論

腦出血歸屬于中醫(yī)學“出血性中風”范疇。既往中醫(yī)治法有活血化瘀法、破瘀滌痰法、通腑法、復元醒腦法、解毒活血法、涼血通瘀法等［7］。課題組秉承國醫(yī)大師周仲瑛教授學術思想，認為“離經(jīng)之血便是瘀”“治風先治血，血行風自滅”，因此瘀血證候貫穿于出血性中風整個過程。瘀血日久郁而化熱，而致瘀熱搏結(jié)阻于腦竅，瘀熱搏結(jié)不解，則熱愈熾，瘀益甚，氣機愈壅，進而化火、生風、成痰（水），三者互為因果兼夾，終致風火相煽，痰瘀閉阻于腦竅，而致腦髓受損，神機失用［8，9］。治則當急則治其標，以涼血通瘀為治療大法。所擬中風1號方，以生大黃為君藥，涼血逐瘀，通腑泄熱，實際運用中無論有無腑實證候，均可應用，以下為度；臣以生地黃清熱涼血、養(yǎng)陰生津，以治瘀熱相搏所致之傷陰耗血，牡丹皮、三七涼血活血散瘀，既可阻斷血中之熱煎熬成瘀，又可防瘀熱生風化痰，佐以瓜蔞，清熱化痰，潤腸通便，使以石菖蒲，芳香走竄、開竅豁痰、醒神益智、引藥上行以達巔頂。全方共奏涼血活血、通腑瀉熱、開竅通絡、上下并治之功。

現(xiàn)代醫(yī)學認為，腦部炎癥在血腦屏障受損、腦組織損傷、神經(jīng)細胞凋亡等方面發(fā)揮了重要作用［10］。田婷等進行了腦出血瘀熱機元的生物標志物的研究，發(fā)現(xiàn)“熱”機素主要與炎癥反應有關，TNF-α、IL-1β明顯升高［11］。王昀應用人全基因組表達譜芯片篩選腦出血中風急性期“瘀熱阻竅證”患者和非“瘀熱阻竅證”患者基因的差異表達，發(fā)現(xiàn)34條與炎癥因子相關的信號通路發(fā)生了變化，其中與TNF-α等差異明顯［12］。TNF-α可干擾細胞外谷氨酸星形膠質(zhì)細胞的去除導致繼發(fā)性腦損傷，加劇興奮性毒性，激活小膠質(zhì)細胞，誘導NF-κB活化，加重炎性反應產(chǎn)生級聯(lián)效應，亦能增強炎癥細胞粘附作用，進一步導致腦血管結(jié)構(gòu)、血腦屏障受損［13-14］。IL-1β主要是腦出血后繼發(fā)性腦損傷刺激星形細胞、膠質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞所分泌，且能進一步激活星形膠質(zhì)細胞、巨噬細胞，破壞血腦屏障，促進神經(jīng)細胞凋亡［13，15］；另一方面，IL-1β又誘導免疫細胞產(chǎn)生繼發(fā)性細胞因子等，誘導炎性反應，擴大級聯(lián)效應，造成細胞、腦組織的進一步損傷［16］。兩者在腦出血急性期顯著升高，并與病情嚴重程度呈正相關，能評價腦出血嚴重程度，參與預測急性腦出血的病情惡化［17-19］。

本研究中，中風1號方可不同程度降低不同時間段AICH模型大鼠Longa 5級評分、腦組織含水量、EB含量，72 h更明顯，提示中風1號方可改善急性腦出血大鼠神經(jīng)功能損傷、修復血腦屏障受損，減輕腦水腫。另外，本方亦可不同程度地顯著降低腦出血周圍組織24 h、72 h的TNF-α、IL-1β水平，提示中風1號方緩解急性腦出血的機制與抑制炎癥因子水平密切相關。雖然中風1號方低、高劑量組對24 h大鼠神經(jīng)功能、腦組織含水量的效果不存在明顯差異，但有下降趨勢，且中風1號方高劑量組對大鼠腦組織EB水平、TNF-α、IL-1β水平的效果比低劑量組更明顯，存在劑量依賴性，這可能與給藥療程短等因素有關。藥理研究結(jié)果提示，中風1號方中的中藥單體大黃素可降低鐵過載，抑制小膠質(zhì)細胞激活，降低TNF-α、IL-1β、谷氨酸水平，減輕腦水腫，緩解腦出血［20-21］；牡丹皮通過升高大鼠血清超氧化物歧化酶含量、降低丙二醛、一氧化氮含量，減輕氧化應激、炎癥反應［22］；三七總皂苷可降低腦出血大鼠TNF-α水平，保護損傷腦組織［23］；石菖蒲能減輕缺血腦中風模型大鼠腦水腫、保護腦細胞的作用與抑制腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)細胞凋亡相關［24］。生地黃湯（含生地黃、大黃）可顯著改善AICH模型大鼠神經(jīng)功能，減輕腦水腫及EB外滲，其機制與下調(diào)TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β表達，抑制小膠質(zhì)細胞活化有關［25］。有研究者采用差異mRNA表達結(jié)合網(wǎng)絡藥理學方法，發(fā)現(xiàn)周老所擬涼血通瘀方（含大黃、三七、生地黃、赤芍等）可通過干預AICH模型大鼠7個靶點，涉及5個病理通路來改善AICH，主要包括修復腦功能缺損，改善神經(jīng)功能，保護血腦屏障損傷，減少炎癥因子，抑制細胞凋亡［26］。他們的研究進一步佐證了涼血通瘀法的療效，也為我們課題組進一步深入研究中風1號方的作用機制指引了方向。