袁鐵超，陳國忠，彭振西，易志忠，歐智海

1.廣西中醫(yī)藥大學，廣西南寧530001；2.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣西南寧530023

胃癌是全世界最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，由于其發(fā)病機制復雜，缺乏有效的治療措施，導致患者治療效果不佳，死亡率高［1］。腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移歷經(jīng)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）、定向侵襲、侵入血液循環(huán)等過程［2］。其中EMT是指上皮細胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)型細胞的生物過程。該過程中原屬上皮型細胞經(jīng)過形態(tài)和骨架結(jié)構(gòu)的改變而逐漸舍去細胞極性及胞間連接，獲得間質(zhì)型細胞的特性，且獲得侵襲和遷移能力［3］。而腫瘤患者致死率高的主要原因則是癌細胞的遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移［4］，因此，阻止或抑制EMT的產(chǎn)生，可以克制腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，對患者的預后及治療有著積極作用。七方胃痛顆粒的功效以益氣健脾為主，消積導滯、清肝降逆、活血化瘀為輔。前期研究發(fā)現(xiàn)，七方胃痛顆?？梢砸种迫宋赴┘毎鲋巢⒋倨涞蛲觯?-7］，但其能否影響人胃腺癌AGS細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有待進一步證實。因此，本研究就七方胃痛顆粒對人胃腺癌AGS-EMT細胞進行干預，觀察干預后對胃癌細胞ZEB2、E-cad及Vimentin的影響，以闡明其對人胃腺癌AGS細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的干預作用及機制，為七方胃痛顆粒在臨床上推廣使用提供有力的依據(jù)。

1 材料

1.1 人胃腺癌AGS細胞與動物人胃腺癌AGS細胞系購于上海慧穎生物科技有限公司，貼壁生長，置于37℃和5%CO2條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。雄性SPF級健康Wistar大鼠40只，體質(zhì)量100～150 g，購于湖南省長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，實驗動物使用許可證:SCXK（湘）2014-0011。在廣西中醫(yī)藥大學實驗中心（SYXK桂2019-0001）飼養(yǎng)。實驗涉及動物的飼養(yǎng)和實驗過程嚴格遵守廣西中醫(yī)藥大學實驗動物管理與保護的有關(guān)準則，并且嚴格按照實驗動物使用的3 R原則給予人道主義的關(guān)懷照顧，且通過廣西中醫(yī)藥大學醫(yī)學倫理委員會審查，倫理審批號:DW20190920-34。

1.2 藥品和試劑七方胃痛顆粒為江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的免煎中藥顆粒，由廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑室提供，其組成為生黃芪30 g，白術(shù)10 g，茯苓10 g，炙甘草9 g，紅參10 g，白芍30 g，炒雞內(nèi)金9 g，枳實10 g，木香6 g，黃連6 g，吳茱萸3 g，丹參6 g，中藥顆粒被混合攪勻并按每袋8 g的規(guī)格滅菌包裝。胎牛血清（上海依科賽生物制品有限公司，貨號:FCS500）；檸檬酸鹽緩沖液（10 mM pH 3.0）（深圳欣博盛生物科技有限公司，貨號:NP-1510-03）；TGF-β1［美國PeproTech（派普泰克）公司中國代表處，貨號:100-21］；TGF-β/Smad抑制劑LY2109761［Selleck（中國）公司，貨號:S2704］；凍存液（北京索萊寶科技有限公司，貨號:D8371）；胰蛋白酶-EDTA消化液（北京索萊寶科技有限公司，貨號:T1300）；青鏈霉素混合液（100X）（北京索萊寶科技有限公司，貨號:P1400）；DMEM高糖培養(yǎng)基［賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司，貨號:11965092］；PBS緩沖液（凱基生物，貨號:KGB5001）；Trizon Reagent（CWBIO康為世紀，貨號:CW0580S）；Ultrapure RNA超純RNA提取試劑盒（CWBIO 康為世紀，貨號:CW0581M）；HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒（CWBIO康為世紀，貨號:CW2569M）；UltraSYBR Mixture（CWBIO康為世紀，貨號:CW0957M）；RIPA裂解液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，貨號:C1053）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（康為世紀，貨號:CW0014S）；Marker（Thermo，貨號:26617）；PVDF膜（Millipore，貨號:IPVH00010）；封閉專用脫脂奶粉（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，貨號:P1622）。引物（蘇州金唯智生物科技有限公司）。

1.3 儀器熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；5810R臺式冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；371高溫滅菌CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）。

2 方法

2.1 人胃腺癌AGS細胞EMT模型建立細胞生長密度高達80%時，須分植至新的培養(yǎng)皿或瓶中，一般稀釋比例為1∶3。當細胞傳代達一定數(shù)量后，用10μg·L-1的TGF-β1處理AGS細胞，連續(xù)培養(yǎng)3代，建立EMT模型［8］。

2.2 實驗分組將細胞分為3組，空白組（無處理的EMT模型）、七方胃痛顆粒（含藥血清+EMT模型）組、LY2109761（TGF-β1/Smad抑制劑+EMT模型）組。

2.3 藥物制備TGF-β/Smad抑制劑LY2109761，體外實驗給藥時濃度稀釋為10μmol·L-1。TGFβ1，體外實驗給藥時濃度稀釋為10μg·L-1。實驗前稱取七方胃痛顆粒所需的藥物。

2.4 藥物血清制備將大鼠隨機分為藥物組、空白組，每組20只。分別給予七方胃痛顆粒（給藥劑量＝臨床常用劑量×動物等劑量系數(shù)×培養(yǎng)液內(nèi)稀釋濃度［9］）和生理鹽水灌胃。先將藥物用生理鹽水稀釋，配置成2 g·mL-1的藥物混懸溶液給大鼠灌胃，方案按照1 mL·100 g-1給藥，每日給藥2次，連續(xù)7天。于末次給藥后1 h腹主動脈采血，血樣置于10 mL離心管，靜置2 h以上，離心半徑8 cm，3 000 r·min-1離心15 min，無菌分離血清。將血清置于56℃水浴30 min滅活，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，置于-20℃下保存?zhèn)溆谩？瞻捉M大鼠除給予生理鹽水代替七方胃痛顆粒灌胃之外，余同七方胃痛顆粒含藥血清制備方法。實驗前將EMT模型AGS細胞傳代培養(yǎng)，將其接種于含DMEM培養(yǎng)基的96孔板中培養(yǎng)，約12 h后，待細胞貼壁，換上凍存融化的含藥血清作用細胞24 h、48 h、72 h后觀察其生長情況。

2.5 RT-PCR法檢測ZEB2、E-cad及vimentin的表達提取細胞的總RNA，遵守操作說明對其進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參［10］，采取實時熒光定量PCR法檢測目的基因mRNA的表達，再進行定量PCR擴增，其反應條件為:95℃預變性5 min進入循環(huán)，95℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃1 min，共33個循環(huán)后，最終測定不同樣本的Ct值，以公式2-△△Ct計算反映各樣品目的基因相對表達量的差異。見表1。

表1 引物信息

2.6 W estern blot法檢測ZEB2、E-cad及Vimentin的表達提取細胞總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液按1∶4比例加入蛋白中煮沸5 min，取50μg蛋白在12%的SDS-PAGE凝膠中電泳，100 mA恒流電轉(zhuǎn)70 min，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶非特異性封閉1 h，加入一抗抗體4℃過夜，加入二抗室溫孵育1 h，ECL顯影5～10 min。圖像結(jié)果用Quanty-one分析軟件進行分析，以目的蛋白/內(nèi)參的灰度比值表示相對目的蛋白水平。

2.7 統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 七方胃痛顆粒對EMT模型中ZEB2 m RNA、Vimentin m RNA表達的影響與空白組比較，七方胃痛顆粒組和LY2109761組作用24 h、48 h、72 h后均能明顯下調(diào)ZEB2 mRNA、Vimentin mRNA表達（P＜0.05）；與七方胃痛顆粒組相比，LY2109761組ZEB2 mRNA的表達明顯下調(diào)（P＜0.05），而Vimentin mRNA下調(diào)在相同時間下相近（P＞0.05）。該結(jié)果提示七方胃痛顆粒中藥血清具有抑制EMT模型AGS-EMT細胞ZEB2 mRNA、Vimentin mRNA的表達，且其抑制ZEB2作用不如TGF-β1的抑制劑LY2109761。見圖1、圖2。

3.2 七方胃痛顆粒對EMT模型中E-cadmRNA表達的影響與空白組比較，七方胃痛顆粒組和LY2109761組作用24 h、48 h、72 h后均能明顯上調(diào)E-cad mRNA表達（P＜0.05）；隨著干預時間延長，其表達有差異，在48 h、72 h時間段均出現(xiàn)促進。與七方胃痛顆粒組相比，LY2109761組在24 h、48 h、72 h均能明顯上調(diào)E-cad mRNA表達（P＜0.05）。該結(jié)果提示七方胃痛顆粒中藥血清具有促進AGSEMT細胞E-cad mRNA的表達，但其促進作用不如TGF-β1抑制劑LY2109761。見圖3。

圖1 七方胃痛顆粒對EMT模型中ZEB2 mRNA表達的影響

圖2 七方胃痛顆粒對EM T模型中Vimentin m RNA表達的影響

圖3 七方胃痛顆粒對EMT模型中E-cad m RNA表達的影響

3.3 七方胃痛顆粒對EMT模型中ZEB2、vimentin、E-cad的蛋白表達的影響與空白組相比，七方胃痛顆粒和LY2109761組分別干預AGS-EMT細胞24 h、48 h、72 h后，ZEB2、Vimentin的蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），E-cad的蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與七方胃痛顆粒組相比，LY2109761組在24 h、48 h、72 h均能明顯下調(diào)ZEB2表達（P＜0.05）。提示七方胃痛顆粒與LY2109761作用相近，且隨之干預時間增加對于Ecad作用更明顯，進一步確認了七方胃痛顆粒在調(diào)控EMT方面的作用。見圖4。

圖4 七方胃痛顆粒對EMT模型中ZEB2、vimentin、E-cad的蛋白表達的影響

4 討論

胃癌在我國引起的死亡約占全球的一半，對人民的身體健康造成極大危害［11］。其發(fā)病機制尚不明確，研究表明其發(fā)生涉及多信號、多基因的復雜過程［12］。胃癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移是影響胃癌療效的主要原因［13］，而在腫瘤細胞的遷移及侵襲過程中，EMT這一過程則起著不容忽視的關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，EMT的形成與TGF-β/smad信號通路的ZEB2、E-cad、Vimentin等因子關(guān)系密切，它們與胃癌的侵襲深度、淋巴轉(zhuǎn)移及分期密切相關(guān)。TGFβ1作為TGF-β主要存在形式在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用［14］。TGF-β可抑制E-cad的表達并促發(fā)EMT［15］，也可促進腫瘤EMT發(fā)生，增強腫瘤細胞的侵襲和遷移能力，促進腫瘤轉(zhuǎn)移［16］。研究證實TGF-β1可誘導人胃癌細胞發(fā)生EMT，并增強其侵襲和遷移能力［17］。而TGF-β/smad為TGF-β促進腫瘤EMT發(fā)生的重要信號通路，TGF-β/smad信號通路可誘導snail、slug、ZEB1、ZEB2、Twist等與EMT密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子表達，從而抑制E-cad表達，促進EMT發(fā)生［18］。E-cad是EMT過程中的重要分子，E-cad在EMT過程中表達降低，使細胞間黏附破壞，增加細胞能動性和推進癌癥向晚期進展。在腫瘤中，E-cad的低表達可以活化誘導致癌因子，激活TGF-β、EGF、NF-κB、Wnt、HIF-1α等傳導途徑，從而促進EMT的形成［19］。ZEB2作為Snail超家族的重要成員可直接或間接下調(diào)E-cad表達并誘導EMT，ZEB2直接結(jié)合并抑制近端CDH1啟動子處的E-cad并重塑細胞間粘附［20］。有報告顯示，ZEB2除了能抑制其他上皮標志物，激活間充質(zhì)基因［21］，還能重組上皮極性分子，阻礙基底膜形成以促進侵入性［22-24］。有研究顯示ZEB與臨床預后有關(guān)，靶向調(diào)節(jié)胃癌組織中ZEB2的表達可以增強SGC7901/DDP細胞對順鉑的敏感性，提示ZEB2高表達與人類癌癥的較差預后密切相關(guān)［25］。Vimentin在胃癌中的表達已被作為胃癌預后價值評定標準多年，其表達量的上調(diào)，可使細胞失去細胞極性，細胞間連接被破壞，細胞粘附能力下降，運動能力增加，從而使細胞的遷移和侵襲能力增強［26］。最新的涉及1 598例樣本的薈萃分析顯示，Vimentin陽性表達與胃癌患者較差的整體存活率顯著相關(guān)，且亞組分析顯示Vimentin對中國患者的整體存活率有不利影響。

LY2109761是一種臨床前研究階段的新型ALK5/TGFβRII雙靶點抑制劑［27］，雖然其在細胞研究階段能顯著抑制TGF-β1誘導的L3.6pl/GLT細胞遷移、侵襲和細胞中Smad2蛋白磷酸化水平。但在體外研究中，LY2109761目前只有在與其他藥物聯(lián)用或者聯(lián)合放、化療時才能減小腫瘤體積、降低腫瘤轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤微血管形成，增強放、化療效果，且不良反應明顯。

七方胃痛顆粒是廣西中醫(yī)藥大學羅偉生教授在中醫(yī)經(jīng)典中溯本追源以探尋胃癌之病機后，結(jié)合長期的臨床實踐，取四君子湯、丹參飲、左金丸、逍遙散、枳實芍藥散、枳術(shù)丸、木香檳榔丸等7個不同功效的經(jīng)典方劑加減而成，其健脾益氣針對胃癌之根本病機，扶助脾胃，助其抗邪。用活血化瘀之法消散積瘤瘀滯，促其氣血運行；清熱解毒之法可清散郁熱，攻伐毒邪；理氣化痰和中之法則可助脾胃之升降、運化，促進機體恢復之功效。

近年來，在防治胃癌及癌前病變的研究上，傳統(tǒng)中醫(yī)中藥發(fā)揮其特色，已經(jīng)在臨床研究上取得一定的成果以及較好的療效。中醫(yī)對于腫瘤的認識在古籍里早有描述，大多可歸為“癥瘕”“積聚”之類，同屬于“邪氣”這一范疇。《黃帝內(nèi)經(jīng)》云:“正氣存內(nèi)，邪不可干……邪之所湊，其氣必虛?！薄夺t(yī)宗必讀·積聚》曰:“積之成者，正氣不足，而后邪氣踞之。”這提示腫瘤的形成與人體的正氣密切相關(guān)，人體正氣不足，無力御邪，使得邪氣獨居，以致“寒”“濕”“痰”“瘀”等病理產(chǎn)物形成，阻礙氣血運行，以致氣滯血瘀、痰濕搏結(jié)、寒凝血瘀，聚而成積，其積瘤之形成，阻礙氣機，郁而化熱。“壯火散氣”，郁熱進一步損耗元氣，耗傷津血，氣血津液不能濡養(yǎng)脾胃，從而使脾胃虛損，運化失司。胃為“水谷之?！?，氣血生化之源，胃氣受損，后天之本無以生化正氣，正氣虧虛不能抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移，從而形成惡性循環(huán)。因此，中醫(yī)治療腫瘤，首當扶助正氣，恢復人體抗邪的自衛(wèi)能力。人之正氣充足，則五臟功能協(xié)調(diào)，氣機調(diào)暢不相失宜，“寒濕痰瘀”等病理產(chǎn)物自然祛除，積瘤自消矣。唯有正氣充足，方能抗邪，故而“正虛邪積”為腫瘤之病機，而胃癌的病因主要為“脾胃虛弱”，后天之本生化失司，故“健脾益氣”之法即為胃癌之治則。

本課題組前期動物實驗研究顯示，七方胃痛顆?？勺钄嗦晕s性胃炎癌前病變的進一步發(fā)展，對防治慢性萎縮性胃炎癌前病變有明顯效果［28-29］，并且可以抑制人胃腺癌細胞增殖并促進其凋亡。本研究顯示含七方胃痛顆粒中藥血清可以抑制AGS細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，上調(diào)E-cad表達，下調(diào)ZEB2及Vimentin表達，且隨著作用時間的延長，中藥血清作用于AGS-EMT細胞的效果與TGF-β/Smad抑制劑作用相似。提示七方胃痛顆粒與TGF-β/smad信號通路抑制劑作用一致，能抑制TGF-β/smad信號通路，下調(diào)ZEB2、Vimentin，上調(diào)E-cad，增加細胞黏附，減少細胞破壞，減少細胞遷移和侵襲，且作用效果與時間呈正相關(guān)性。綜上所述，七方胃痛顆粒對人胃腺癌AGS細胞具有抑制作用，其機制可能為抑制TGF-β/smad信號通路，從而抑制胃黏膜上皮的EMT。這體現(xiàn)了七方胃痛顆粒在防治胃癌方面的重大協(xié)同作用。