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        基于電化學酶生物傳感器的食品和藥物分析的研究進展

        2021-01-21 08:12:38陳彥宇關樺楠劉雨欣趙子璇
        精細石油化工進展 2020年5期
        關鍵詞:黃嘌呤伏安底物

        陳彥宇,關樺楠,劉雨欣,趙子璇,彭 勃

        哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院,哈爾濱 150076

        酶是由活細胞產(chǎn)生的、對其底物具有高度特異性和高度催化效能的蛋白質(zhì)或RNA。酶的催化作用有賴于酶分子的一級結構及空間結構的完整。酶固定化技術是用物理或化學手段,將游離酶封鎖住固體材料或限制在一定區(qū)域內(nèi)進行活躍的、特有的催化作用,并可回收長時間使用的一種技術。酶的固定化技術已經(jīng)成為酶應用領域中的一個主要研究方向。經(jīng)固定化的酶與游離酶相比具有穩(wěn)定性高、回收方便、易于控制、可反復使用、成本低廉等優(yōu)點,在生物工業(yè)、醫(yī)學及臨床診斷、化學分析、環(huán)境保護以及基礎研究等方面發(fā)揮了重要作用[1]。在設計生物傳感器時,根據(jù)生物傳感器的用途選擇合適的固定化方法。固定化方法主要有吸附法[2]、共價鍵合法[3]、交聯(lián)包埋法[4]和包埋法[5]。吸附法不需要對酶進行化學改性,因此簡單、廉價、可逆,缺點為可能存在鍵合不良和酶漏,穩(wěn)定性差。在共價固定化中,酶與共價鍵結合緊密,可以合理控制酶的用量和微環(huán)境,但這種方法通常很昂貴,且對酶進行化學修飾會導致轉(zhuǎn)運體稀釋酶的活性。包埋法的基本原理是,載體與酶溶液混合后,借助引發(fā)劑進行聚合反應,通過物理作用將酶限定在載體的網(wǎng)格中,從而實現(xiàn)酶固定化的方法。包埋法不需要對酶進行化學修飾,更適合于細胞。交聯(lián)法,一般適用于高溫有機溶劑,不需要載體,酶與交聯(lián)劑之間有緊密的結合,這種方法的主要缺點是酶結晶的要求高,并且很難控制顆粒的性質(zhì)。

        就像所有用來抑制特定反應的藥物一樣,藥物也可以使用基于酶抑制的策略進行檢測[6]。酶抑制可以是可逆的或不可逆的。在可逆抑制中,底物和抑制劑競爭酶,稱為競爭抑制。抑制劑通常是底物的結構類似物。在非競爭性抑制中,抑制劑從另一個位點而不是底物結合位點與酶結合,導致底物結合位點發(fā)生改變。因此,底物不能結合并發(fā)生競爭性抑制。抑制劑可以與游離酶或酶底物復合物結合[7-8]。通常用殺蟲劑抑制特定的酶,阻止或降低酶的活性[9]。

        1 電化學酶生物傳感器

        在電化學分析中,伏安法是常用的電分析技術,它記錄電流作為外加電位的函數(shù)[10]。伏安法分為循環(huán)伏安法[11]、階躍脈沖伏安法[12]、交流伏安法[13]、溶出伏安法[14]。安培技術是酶生物傳感器中最常用的電化學技術。Amperometric生物傳感器分為3類即第一代、第二代和第三代酶生物傳感器[15]。第一代酶電極是由一個酶和一個載體組成的系統(tǒng)。在底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的過程中,觀察到氧還原為過氧化氫。在第一代酶電極中,實現(xiàn)了過氧化氫(+0.68 V)的氧化[16]。第一代電極的不利之處在于,在過氧化氫被氧化的電位下,其他物種可被氧化而產(chǎn)生干擾效應。在第二代酶電極中,電子傳遞是由稱為介體的氧化反應物而不是氧提供的。介質(zhì)使輔酶再生,介質(zhì)不應與介質(zhì)中的氧發(fā)生反應,而應與還原的輔酶迅速反應,并具有穩(wěn)定的氧化和還原形式。理想介質(zhì)的性質(zhì)是:與還原酶反應迅速,具有穩(wěn)定的氧化還原形式,在操作條件下穩(wěn)定,在電子傳遞過程中不應參與副反應,其氧化還原電位應低于樣品中其他電活性物質(zhì),不應有毒,其還原形式不應與氧發(fā)生反應。用作介質(zhì)的材料可以加入溶液中,也可以固定在電極上[17]。通過對兩代人的研究發(fā)現(xiàn),當人工介質(zhì)用于復雜介質(zhì)時,它們會導致樣品污染。因此,盡管在復雜介質(zhì)中使用人工介質(zhì)具有優(yōu)勢,必須消除第二代生物傳感器中介體引起的接觸。在第三代酶電極中,酶氧化還原中心和電極表面通過有機導電鹽產(chǎn)生直接的相互作用[18]。

        2 酶生物傳感器在食品藥品工業(yè)中的應用

        近年來,基于電化學酶的生物傳感器的食品和藥物分析應用越來越廣泛。CHAWLA等[19]開發(fā)了一種基于固定在鎳納米粒子、羧化多壁碳納米管和聚苯胺中的漆酶修飾電極的安培生物傳感器。

        這種修飾是在金電極上進行的,并在pH為5.5和0.1 M(M=mol/L,下同)的醋酸鹽緩沖液中,在35 ℃下進行測量。線性響應在0.1~10 μM之間,檢測限為0.05 μM,靈敏度為0.694 μA·μm-1·cm-2。將所設計的生物傳感器應用于10種果汁中酚類物質(zhì)的測定,并與分光光度法進行了比較。在果汁中添加已知量的愈創(chuàng)木酚進行回收研究,回收率為95.61%。Lac/NiNPs/cMWCNT/PANI在4個月內(nèi)使用了200次,失去了15%的初始活性。漆酶可用于測定多種草藥、茶葉、醇類中的酚類物質(zhì),有許多不同的應用領域。與其他最近的研究相比,此研究的檢出限較低。此外,從研究中可以看出,傳感器的改性和納米材料的使用非常重要,充分利用了金屬納米顆粒與碳基納米顆粒和聚合物相結合的優(yōu)勢。

        以黃嘌呤氧化酶為生物組分的酶生物傳感器也可用于魚類新鮮度檢測。DERVESEVIC等[20]將黃嘌呤氧化酶固定在多壁碳納米管和氧化還原無規(guī)共聚物中。對于黃嘌呤檢測,進行了pH和溫度的反應性研究,在pH 7.0和45 ℃下獲得了最佳響應。所設計的生物傳感器的線性范圍為2~28 μM、28~46 μM和46~86 μM黃嘌呤,檢測限為0.12 μM。利用自行設計的黃嘌呤生物傳感器,從當?shù)厥袌鲑徺I的魚肉樣品中成功檢測出黃嘌呤。該研究發(fā)現(xiàn),碳基納米材料與一種方便的聚合物相結合,形成了一個高效的固定化平臺,具有良好的協(xié)同效應。

        PORTACCIO等[26]利用硫堇導電聚合物和炭黑納米復合物建立了一種測定番茄汁中雙酚A的漆酶生物傳感器。從酶負載、pH和應用電位范圍等方面對所設計的生物傳感器進行了優(yōu)化。在0.5~50 μM范圍內(nèi),檢測限為0.2 μM。對番茄汁進行了實際應用研究,回收率在95%到120%之間。這樣的研究證明漆酶不僅可以用于酚類化合物的測定,而且可以用于農(nóng)藥的測定。表1總結了酶基生物傳感器在食品工業(yè)中的其他最新應用。在最近的一項研究中,WANG等[27]基于交聯(lián)戊二醛固定化漆酶和石墨烯修飾玻碳電極,提出了一種檢測天然甾體17β-雌二醇的新型電化學酶傳感器。研究了電聚合循環(huán)、賴氨酸用量、漆酶濃度等因素對傳感器的選擇性、重復性和穩(wěn)定性的影響。在最佳條件下,17β-雌二醇在0.4~57 pM之間檢測,檢出限為0.13 pM。以人尿為實驗對象,驗證了酶傳感器檢測人尿中17β-雌二醇的有效性和可行性。該研究中使用的尿樣表明,生物傳感器可直接用于臨床。

        表1 酶生物傳感器在食品和藥物工業(yè)中的應用進展

        3 結論與展望

        大多數(shù)生物傳感器都利用了納米材料在傳感器設計中的優(yōu)勢,因為它們具有較高的導電性,有助于電子從酶的氧化還原位點轉(zhuǎn)移到傳感器,這對于快速響應非常重要。許多生物傳感器由于其應用范圍廣,檢測限低,有可能用于實驗室的早期疾病監(jiān)測和食品控制,因此,它們具有巨大的商業(yè)化潛力。酶基生物傳感器的主要挑戰(zhàn)仍然是固定化平臺,因為它對生物傳感器的穩(wěn)定性、貨架期、重復性和重復性能力至關重要。因此,新的固定化平臺仍然需要有效的基于酶的生物傳感器。生物傳感器作為高質(zhì)量食品加工和藥物分析的重要工具,其需求量不斷增加,這就要求在生物傳感器中使用先進的技術。電化學酶生物傳感器是一種可靠的、靈敏度高的食品和藥品分析儀器。同時考慮環(huán)境樣品和生物樣品時,現(xiàn)場生物傳感器的應用可確保在最長幾分鐘內(nèi)獲得分析結果。從數(shù)據(jù)庫中可以看出,酶電化學生物傳感器在智能器件、納米傳感器、智能材料生物傳感器等方面的研究將越來越受到重視。

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