陳彥宇，關(guān)樺楠，劉雨欣，趙子璇，彭 勃

哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，哈爾濱 150076

酶是由活細(xì)胞產(chǎn)生的、對(duì)其底物具有高度特異性和高度催化效能的蛋白質(zhì)或RNA。酶的催化作用有賴(lài)于酶分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)及空間結(jié)構(gòu)的完整。酶固定化技術(shù)是用物理或化學(xué)手段，將游離酶封鎖住固體材料或限制在一定區(qū)域內(nèi)進(jìn)行活躍的、特有的催化作用，并可回收長(zhǎng)時(shí)間使用的一種技術(shù)。酶的固定化技術(shù)已經(jīng)成為酶應(yīng)用領(lǐng)域中的一個(gè)主要研究方向。經(jīng)固定化的酶與游離酶相比具有穩(wěn)定性高、回收方便、易于控制、可反復(fù)使用、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，在生物工業(yè)、醫(yī)學(xué)及臨床診斷、化學(xué)分析、環(huán)境保護(hù)以及基礎(chǔ)研究等方面發(fā)揮了重要作用[1]。在設(shè)計(jì)生物傳感器時(shí)，根據(jù)生物傳感器的用途選擇合適的固定化方法。固定化方法主要有吸附法[2]、共價(jià)鍵合法[3]、交聯(lián)包埋法[4]和包埋法[5]。吸附法不需要對(duì)酶進(jìn)行化學(xué)改性，因此簡(jiǎn)單、廉價(jià)、可逆，缺點(diǎn)為可能存在鍵合不良和酶漏，穩(wěn)定性差。在共價(jià)固定化中，酶與共價(jià)鍵結(jié)合緊密，可以合理控制酶的用量和微環(huán)境，但這種方法通常很昂貴，且對(duì)酶進(jìn)行化學(xué)修飾會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)體稀釋酶的活性。包埋法的基本原理是，載體與酶溶液混合后，借助引發(fā)劑進(jìn)行聚合反應(yīng)，通過(guò)物理作用將酶限定在載體的網(wǎng)格中，從而實(shí)現(xiàn)酶固定化的方法。包埋法不需要對(duì)酶進(jìn)行化學(xué)修飾，更適合于細(xì)胞。交聯(lián)法，一般適用于高溫有機(jī)溶劑，不需要載體，酶與交聯(lián)劑之間有緊密的結(jié)合，這種方法的主要缺點(diǎn)是酶結(jié)晶的要求高，并且很難控制顆粒的性質(zhì)。

就像所有用來(lái)抑制特定反應(yīng)的藥物一樣，藥物也可以使用基于酶抑制的策略進(jìn)行檢測(cè)[6]。酶抑制可以是可逆的或不可逆的。在可逆抑制中，底物和抑制劑競(jìng)爭(zhēng)酶，稱(chēng)為競(jìng)爭(zhēng)抑制。抑制劑通常是底物的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。在非競(jìng)爭(zhēng)性抑制中，抑制劑從另一個(gè)位點(diǎn)而不是底物結(jié)合位點(diǎn)與酶結(jié)合，導(dǎo)致底物結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生改變。因此，底物不能結(jié)合并發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制。抑制劑可以與游離酶或酶底物復(fù)合物結(jié)合[7-8]。通常用殺蟲(chóng)劑抑制特定的酶，阻止或降低酶的活性[9]。

1 電化學(xué)酶生物傳感器

在電化學(xué)分析中，伏安法是常用的電分析技術(shù)，它記錄電流作為外加電位的函數(shù)[10]。伏安法分為循環(huán)伏安法[11]、階躍脈沖伏安法[12]、交流伏安法[13]、溶出伏安法[14]。安培技術(shù)是酶生物傳感器中最常用的電化學(xué)技術(shù)。Amperometric生物傳感器分為3類(lèi)即第一代、第二代和第三代酶生物傳感器[15]。第一代酶電極是由一個(gè)酶和一個(gè)載體組成的系統(tǒng)。在底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的過(guò)程中，觀察到氧還原為過(guò)氧化氫。在第一代酶電極中，實(shí)現(xiàn)了過(guò)氧化氫(+0.68 V)的氧化[16]。第一代電極的不利之處在于，在過(guò)氧化氫被氧化的電位下，其他物種可被氧化而產(chǎn)生干擾效應(yīng)。在第二代酶電極中，電子傳遞是由稱(chēng)為介體的氧化反應(yīng)物而不是氧提供的。介質(zhì)使輔酶再生，介質(zhì)不應(yīng)與介質(zhì)中的氧發(fā)生反應(yīng)，而應(yīng)與還原的輔酶迅速反應(yīng)，并具有穩(wěn)定的氧化和還原形式。理想介質(zhì)的性質(zhì)是：與還原酶反應(yīng)迅速，具有穩(wěn)定的氧化還原形式，在操作條件下穩(wěn)定，在電子傳遞過(guò)程中不應(yīng)參與副反應(yīng)，其氧化還原電位應(yīng)低于樣品中其他電活性物質(zhì)，不應(yīng)有毒，其還原形式不應(yīng)與氧發(fā)生反應(yīng)。用作介質(zhì)的材料可以加入溶液中，也可以固定在電極上[17]。通過(guò)對(duì)兩代人的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)人工介質(zhì)用于復(fù)雜介質(zhì)時(shí)，它們會(huì)導(dǎo)致樣品污染。因此，盡管在復(fù)雜介質(zhì)中使用人工介質(zhì)具有優(yōu)勢(shì)，必須消除第二代生物傳感器中介體引起的接觸。在第三代酶電極中，酶氧化還原中心和電極表面通過(guò)有機(jī)導(dǎo)電鹽產(chǎn)生直接的相互作用[18]。

2 酶生物傳感器在食品藥品工業(yè)中的應(yīng)用

近年來(lái)，基于電化學(xué)酶的生物傳感器的食品和藥物分析應(yīng)用越來(lái)越廣泛。CHAWLA等[19]開(kāi)發(fā)了一種基于固定在鎳納米粒子、羧化多壁碳納米管和聚苯胺中的漆酶修飾電極的安培生物傳感器。

這種修飾是在金電極上進(jìn)行的，并在pH為5.5和0.1 M(M=mol/L，下同)的醋酸鹽緩沖液中，在35 ℃下進(jìn)行測(cè)量。線(xiàn)性響應(yīng)在0.1～10 μM之間，檢測(cè)限為0.05 μM，靈敏度為0.694 μA·μm-1·cm-2。將所設(shè)計(jì)的生物傳感器應(yīng)用于10種果汁中酚類(lèi)物質(zhì)的測(cè)定，并與分光光度法進(jìn)行了比較。在果汁中添加已知量的愈創(chuàng)木酚進(jìn)行回收研究，回收率為95.61%。Lac/NiNPs/cMWCNT/PANI在4個(gè)月內(nèi)使用了200次，失去了15%的初始活性。漆酶可用于測(cè)定多種草藥、茶葉、醇類(lèi)中的酚類(lèi)物質(zhì)，有許多不同的應(yīng)用領(lǐng)域。與其他最近的研究相比，此研究的檢出限較低。此外，從研究中可以看出，傳感器的改性和納米材料的使用非常重要，充分利用了金屬納米顆粒與碳基納米顆粒和聚合物相結(jié)合的優(yōu)勢(shì)。

以黃嘌呤氧化酶為生物組分的酶生物傳感器也可用于魚(yú)類(lèi)新鮮度檢測(cè)。DERVESEVIC等[20]將黃嘌呤氧化酶固定在多壁碳納米管和氧化還原無(wú)規(guī)共聚物中。對(duì)于黃嘌呤檢測(cè)，進(jìn)行了pH和溫度的反應(yīng)性研究，在pH 7.0和45 ℃下獲得了最佳響應(yīng)。所設(shè)計(jì)的生物傳感器的線(xiàn)性范圍為2～28 μM、28～46 μM和46～86 μM黃嘌呤，檢測(cè)限為0.12 μM。利用自行設(shè)計(jì)的黃嘌呤生物傳感器，從當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)購(gòu)買(mǎi)的魚(yú)肉樣品中成功檢測(cè)出黃嘌呤。該研究發(fā)現(xiàn)，碳基納米材料與一種方便的聚合物相結(jié)合，形成了一個(gè)高效的固定化平臺(tái)，具有良好的協(xié)同效應(yīng)。

PORTACCIO等[26]利用硫堇導(dǎo)電聚合物和炭黑納米復(fù)合物建立了一種測(cè)定番茄汁中雙酚A的漆酶生物傳感器。從酶負(fù)載、pH和應(yīng)用電位范圍等方面對(duì)所設(shè)計(jì)的生物傳感器進(jìn)行了優(yōu)化。在0.5～50 μM范圍內(nèi)，檢測(cè)限為0.2 μM。對(duì)番茄汁進(jìn)行了實(shí)際應(yīng)用研究，回收率在95%到120%之間。這樣的研究證明漆酶不僅可以用于酚類(lèi)化合物的測(cè)定，而且可以用于農(nóng)藥的測(cè)定。表1總結(jié)了酶基生物傳感器在食品工業(yè)中的其他最新應(yīng)用。在最近的一項(xiàng)研究中，WANG等[27]基于交聯(lián)戊二醛固定化漆酶和石墨烯修飾玻碳電極，提出了一種檢測(cè)天然甾體17β-雌二醇的新型電化學(xué)酶?jìng)鞲衅?。研究了電聚合循環(huán)、賴(lài)氨酸用量、漆酶濃度等因素對(duì)傳感器的選擇性、重復(fù)性和穩(wěn)定性的影響。在最佳條件下，17β-雌二醇在0.4～57 pM之間檢測(cè)，檢出限為0.13 pM。以人尿?yàn)閷?shí)驗(yàn)對(duì)象，驗(yàn)證了酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)人尿中17β-雌二醇的有效性和可行性。該研究中使用的尿樣表明，生物傳感器可直接用于臨床。

表1 酶生物傳感器在食品和藥物工業(yè)中的應(yīng)用進(jìn)展

3 結(jié)論與展望

大多數(shù)生物傳感器都利用了納米材料在傳感器設(shè)計(jì)中的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗鼈兙哂休^高的導(dǎo)電性，有助于電子從酶的氧化還原位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到傳感器，這對(duì)于快速響應(yīng)非常重要。許多生物傳感器由于其應(yīng)用范圍廣，檢測(cè)限低，有可能用于實(shí)驗(yàn)室的早期疾病監(jiān)測(cè)和食品控制，因此，它們具有巨大的商業(yè)化潛力。酶基生物傳感器的主要挑戰(zhàn)仍然是固定化平臺(tái)，因?yàn)樗鼘?duì)生物傳感器的穩(wěn)定性、貨架期、重復(fù)性和重復(fù)性能力至關(guān)重要。因此，新的固定化平臺(tái)仍然需要有效的基于酶的生物傳感器。生物傳感器作為高質(zhì)量食品加工和藥物分析的重要工具，其需求量不斷增加，這就要求在生物傳感器中使用先進(jìn)的技術(shù)。電化學(xué)酶生物傳感器是一種可靠的、靈敏度高的食品和藥品分析儀器。同時(shí)考慮環(huán)境樣品和生物樣品時(shí)，現(xiàn)場(chǎng)生物傳感器的應(yīng)用可確保在最長(zhǎng)幾分鐘內(nèi)獲得分析結(jié)果。從數(shù)據(jù)庫(kù)中可以看出，酶電化學(xué)生物傳感器在智能器件、納米傳感器、智能材料生物傳感器等方面的研究將越來(lái)越受到重視。