耿金華，龍志軍，張 煒

（佛山職業(yè)技術學院，廣東 佛山 528137）

1 引言

共聚焦激光掃描顯微鏡是生物成像領域中被廣泛使用的成像設備[1-2]，能夠在熒光樣品（細胞或組織）成像時獲取到層析圖像。在成像過程中，使用單個激光焦斑對樣品進行逐點掃描，再利用針孔有效地去除離焦信號。這種逐點掃描方法限制了成像速度，難以用來觀測活體標本的動態(tài)變化。相比之下，MSIM通過快速投射多個離散的光斑進行掃描，使用CCD相機捕捉多焦點圖像，從而獲得更高的成像速度[3-5]。通過對這些多焦點圖像添加數字針孔、重定位運算及疊加處理，MSIM可以在1 Hz的幀速下獲得空間分辨率大幅提升（超過衍射極限）的層析圖像[3]。在傳統(tǒng)的MSIM系統(tǒng)中，通常使用針孔陣列來抑制散射光和離焦熒光信號，但是無法消除深層的離焦信號，導致成像結果中出現明顯的背景信號[6]。DUSSAUX等人為了抑制這種離焦信號而提出一種多點掃描差分共焦成像技術[7]。該方法采用圖像差分的方式消除背景信號，在抑制離焦信號的同時也會降低成像結果的信噪比（SNR）。

針對現有MSIM技術中使用針孔陣列無法濾除深層離焦信號的問題，本文將層析能力更強的方差層析成像方法與重定位算法結合，實現MSIM層析-超分辨成像。這種改進的MSIM方法將具有較高分辨率的重定位圖像和具有層析效果的方差層析圖像結合起來，在分別提取方差層析圖像的低頻頻域分量和重定位圖像的高頻頻域分量之后進行疊加，可以得到同時具有這兩種圖像優(yōu)勢（高分辨率及層析能力）的層析-超分辨圖像。

2 成像原理

2.1 重定位算法

MSIM在成像過程中采集多焦點掃描圖像。由于熒光分子的實際位置在激發(fā)點標稱中心和探測位置的中央區(qū)域，因此可讓每個像素的熒光強度信息向光斑中心移動一半的距離，并將位移后的圖像疊加，獲得突破衍射極限的橫向分辨率[8-9]。使用重定位算法獲得超分辨圖像之后，圖像的光學傳遞函數（OTF）可以簡單地描述為：

如（1）式所示，重定位圖像的OTF支撐范圍約是普通寬場圖像OTF的兩倍。這意味著重定位圖像具有兩倍的橫向分辨率。具有兩倍分辨率的理想顯微鏡OTF可以表示為。相比之下，重定位圖像OTF中的高頻分量幅值較低。針對這個問題的直接解決方案是使用權重函數進行加權處理，進而獲得理想的圖像OTF分布。使用的權重函數如下所示：

式中，ε為一個數值較小的歸一化參數，它應該比最大頻域幅值小一個或多個數量級，可以防止在傅里葉空間放大高頻圖像噪聲。

2.2 方差層析成像方法

使用針孔陣列進行并行探測，在掃描厚樣品時會產生明顯的圖像背景。筆者針對該問題提出了一種方差層析成像方法[6]。該方法充分利用MSIM原始多焦點圖像的統(tǒng)計特性，可以有效地抑制深層離焦熒光信號。利用移位的多點照明模板pi照射樣本，采集到的對應MSIM圖像Ii可以表示為：

式中，Iin和Iout分別為聚焦熒光信號和離焦熒光信號分量；μ1和μ2為調制深度；x為圖像平面上的位置。

通常情況下，離焦熒光分子的發(fā)射光會在焦平面上占據更大的面積，但是熒光強度比位于聚焦層面上熒光分子的發(fā)射光要弱。即使對一組相同的位移照明圖案進行照射，聚焦層面熒光分子在焦平面上的強度波動也可能比離焦熒光分子的發(fā)射光要更大。因此，可以通過計算MSIM原始多焦點圖像的方差來得到有效抑制離散熒光信號Iout的方法。如下所示：

式中，V為信號方差。為避免因樣品本身亮度不均勻對成像結果的影響，在實際成像過程中通過計算標準差來獲得所需的層析圖像IOS。

2.3 層析-超分辨成像方法

現有MSIM技術通常采用數字針孔陣列來抑制離焦熒光信號，隨后對這些處理后的MSIM圖像進行重定位運算，最終得到層析-超分辨圖像。由于針孔陣列很難抑制深層離焦熒光信號，用該方法進行厚樣品成像時會在成像結果中看到明顯的背景信號，增加了分辨目標精細結構的難度。為了克服現有MSIM技術中存在的問題，本文提出了一種改進的MSIM層析-超分辨成像方法。該方法將方差層析成像方法和重定位算法結合，同時具有方差層析方法在層析成像能力上的優(yōu)勢和重定位算法在提升圖像分辨率方面的優(yōu)勢。

在改進的層析-超分辨方法中，通過對同一組采集的MSIM原始多焦點圖像數據進行處理，可以分別計算得到方差層析圖像和重定位超分辨圖像。通過分析可知，超分辨圖像意味著獲得超越衍射極限的高頻信號分量，而層析能力的提高則意味著已經有效去除了低頻離焦背景信號。因此，在頻域內將方差層析圖像的低頻分量與重定位超分辨圖像的高頻分量合并，可以得到增強的MSIM層析-超分辨圖像。結合層析圖像和超分辨圖像頻率信息的計算方法如下所示：

式中，L和H分別為頻域的低通濾波器和高通濾波器，并且可以定義為：

式中，uWide為普通寬場圖像的OTF截止頻率。

這種通過組合頻域分量獲取層析-超分辨圖像的方法首先在結構光顯微成像技術中得到應用[10]。該方法首次在MSIM成像領域應用，用于大深度范圍獲取層析-超分辨圖像。相比于采用結構光顯微成像技術，MSIM技術通過投射稀疏的多焦點圖案激發(fā)樣品，在進行大厚度樣品成像時受離焦熒光信號影響更小，更容易獲得更高對比度的圖像。因此，MSIM技術可以獲得比結構光顯微成像技術（小于10 μm）更高的成像深度（高達 50 μm）[3]。可以看出，本文提出的改進MSIM方法更適合于進行厚樣本三維結構的清晰觀測。改進MSIM方法的詳細步驟如圖1所示。

3 仿真

本文通過數值模擬數據對改進MSIM方法的可行性和性能提升效果進行了驗證。在數字模擬實驗中，在物鏡焦平面和離焦平面分別放置一個薄輪輻狀分布樣品和一個均勻分布樣品，其中焦平面與離焦平面之間的距離為3μm，物鏡的數值孔徑為1.45（NA=1.45），熒光發(fā)射光波長為510nm（λem=510nm），圖像像素大小設置為43nm。為了評估理想條件下的性能改進效果，本文沒有在MSIM原始圖像中引入噪聲。

圖2a-d所示分別為通過數值仿真方式獲取的寬場圖像、方差層析圖像、重定位超分辨圖像和層析-超分辨圖像。由于存在離焦熒光信號，在寬場圖像（圖2a）中可以觀測到明顯的背景信號，該信號導致圖像模糊。相比之下，方差層析方法具有較為理想的層析成像能力，可以有效抑制離焦熒光信號，其成像結果（圖2b）具有更高的圖像對比度。通過比較圖2a-d中的虛線圓半徑可以看出，重定位超分辨圖像和層析-超分辨圖像的分辨率要明顯高于寬場圖像，并且層析-超分辨圖像的對比度要優(yōu)于重定位超分辨圖像。為了能夠量化評估性能、提升效果，本文計算了與波長周期相關的對比度曲線，如圖2e所示。與寬場圖像的空間分辨率（226nm）相比，重定位超分辨圖像和層析-超分辨圖像（136nm）可以將分辨率提升約1.66倍。此外，方差層析圖像的分辨率也有一定的提升（187 nm）。

4 結論

筆者提出了一種改進多焦點結構光顯微成像的方法，該方法在頻域內將方差層析圖像與多焦點結構光超分辨圖像結合，實現多焦點結構光層析-超分辨成像。與現有多焦點結構光技術相比，該方法可以同時獲得理想的離焦熒光信號抑制能力和分辨率成像能力，適用于進行厚樣品的精細三維結構重建。