黃云帆，林 婧，謝曉靜，盧 俊，勞繼紅，王 璐

(東華大學(xué) a. 紡織學(xué)院；b. 紡織面料技術(shù)教育部重點實驗室，上海 201620)

前交叉韌帶(anterior cruciate ligament，ACL)是膝關(guān)節(jié)內(nèi)重要的韌帶結(jié)構(gòu)，其主要功能是防止股骨后移或脛骨過度前移，維持膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定并協(xié)助控制膝關(guān)節(jié)旋轉(zhuǎn)和側(cè)方運動[1]。據(jù)報道[2-3]，美國每年有20萬例前交叉韌帶損傷病例，且由于關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜液的存在以及ACL本身的低血管化，其損傷時無法形成血凝塊，因而難以發(fā)生內(nèi)源性愈合，需要手術(shù)介入治療。目前，臨床使用最廣泛的治療方法為自體移植、同種異體移植以及人工韌帶重建。然而，自體移植受供體部位并發(fā)癥與來源的限制，同種異體移植面臨免疫排斥、疾病傳播的風險[1-2, 4-6]。而人工韌帶的臨床應(yīng)用更為廣泛，且其需求日益增加。

人工韌帶在20世紀七八十年代開始出現(xiàn)并逐步興起[6]，其第一代產(chǎn)品包括原材料為聚四氟乙烯的Gore-Tex韌帶，原材料為聚丙烯的Polyflex韌帶，以及以碳纖維為基材的Proplast韌帶，但這些產(chǎn)品因植入人體后出現(xiàn)關(guān)節(jié)腔周圍組織發(fā)育不良、并發(fā)癥高等問題而逐步退出市場。隨后Dacron、Pro-Flex和Kennedy等人工韌帶面世，其短期療效較佳，但中遠期組織無法向內(nèi)生長且滑膜異物反應(yīng)嚴重[7]。目前，臨床受用最廣泛的人工韌帶是法國的LARS人工韌帶，其強度較高，并且其經(jīng)編結(jié)構(gòu)賦予韌帶織物以一定的孔隙率，可促進細胞的生長[8]，短中期修復(fù)效果良好，但長期隨訪結(jié)果表明，LARS人工韌帶所使用的不可吸收聚酯材料長期存在于膝關(guān)節(jié)內(nèi)，材料與骨界面、材料與材料之間磨損產(chǎn)生的碎屑將引發(fā)關(guān)節(jié)炎等疾病，并且LARS人工韌帶在服役期持續(xù)的高強度對新生組織存在應(yīng)力遮擋效應(yīng)，而且無法誘導(dǎo)再生形成完整的自體韌帶[9-11]。

本文擬制備一種可吸收人工韌帶，通過探究可吸收材料不同組分配比以及人工韌帶編織結(jié)構(gòu)對其力學(xué)性能與降解性能的影響，研發(fā)一種高強度、多組分、核殼結(jié)構(gòu)的可吸收人工韌帶，使其在植入初期具有較高的強度，并且隨著材料的逐步降解以及新生組織的長入，使自體韌帶承受適當強度的負荷但無斷裂風險，以確保服役期移植物的力學(xué)性能。

1 材料與方法

1.1 纖維材料的選擇

文獻[12-13]指出：前交叉韌帶重建術(shù)后6周內(nèi)，移植物將經(jīng)歷無血管化壞死和新生血管形成兩個階段，可觀察到少量無序膠原纖維；6～24周，新生韌帶重塑，基本恢復(fù)其原有功能。由此可見，人工韌帶需要在6周內(nèi)保持優(yōu)良的力學(xué)性能，6～24周，為組織長入提供空間同時維持一定的力學(xué)強度。故本文選用3種可吸收材料，即PPDO(polydioxanone)、PGCL(poliglecaprone)和PGLA(polyglactin)(蘇州邁緹康醫(yī)療科技有限公司)。紗線規(guī)格及其力學(xué)性能如表1所示，每根PGLA復(fù)絲由300根直徑為5 μm的單絲組成。其中，紗線拉伸性能參照GB/T 3916—2013進行測試，紗線直徑采用SMZ745T型立體顯微鏡(上海尼康儀器有限公司)測試。

表1 紗線規(guī)格及其力學(xué)性能

1.2 高強度、多組分、核殼結(jié)構(gòu)全可吸收人工韌帶的結(jié)構(gòu)設(shè)計與制備

根據(jù)PPDO、PGCL與PGLA紗線的力學(xué)性能以及其在體內(nèi)完全吸收的時間(分別為180、90～120和56～70 d[14-15])，設(shè)計了2種組分配比，即PPDO、PGCL和PGLA紗線的根數(shù)分別為6∶4∶2和4∶6∶2，對應(yīng)的配比編號依次為A和B。由于中空結(jié)構(gòu)不利于細胞貼附增殖，無法為組織生長提供載體[16]，影響韌帶修復(fù)速度與質(zhì)量，故本文設(shè)計了一種核殼管狀結(jié)構(gòu)，其殼層為單層(Ⅰ)或雙層(Ⅱ)，核層由不同股數(shù)的PPDO、PGCL和PGLA編織紗組成。核層與殼層編織結(jié)構(gòu)中，紗線呈軸向螺旋型上升排列，更適用于模擬人體ACL[17]，且可以為細胞的長入提供空間，有利于物質(zhì)交換和細胞增殖。試樣組分配比與核殼結(jié)構(gòu)設(shè)計參數(shù)如表2所示，核殼管狀人工韌帶結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。

表2 試樣組分配比與核殼結(jié)構(gòu)設(shè)計參數(shù)

在東華大學(xué)自主設(shè)計研發(fā)的一體成型編織機上進行核層編織紗的織造成型，再將其作為內(nèi)芯引入殼層進行一體化管狀織物編織成型。在DHG-9055A型電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器股份有限公司)中進行熱定型，定型溫度為80 ℃，時間為40 min，制得直徑為3.5 mm的管狀試樣。

1.3 結(jié)構(gòu)參數(shù)測試

采用SMZ745T型立體顯微鏡觀察人工韌帶的結(jié)構(gòu)特征，包括人工韌帶中紗線的分布。根據(jù)顯微鏡照片，使用MB-Ruler軟件測得人工韌帶的直徑、相鄰?fù)N紗線間的距離(節(jié)距)以及編織角。

1.4 力學(xué)性能測試

前交叉韌帶重建術(shù)后早期，韌帶斷裂是其面臨的主要風險。而在康復(fù)階段的中后期，人工韌帶需在突然且快速的生理活動后恢復(fù)原長[18]，且具有一定的抗疲勞強度[19]。采用YG(B) 026G-500型醫(yī)用紡織品多功能強力儀(溫州大榮紡織儀器有限公司)測試人工韌帶的拉伸性能、彈性回復(fù)性能以及循環(huán)拉伸疲勞性能。每項測試中，試樣樣本數(shù)均為5，取平均值并計算標準偏差。

1.4.1 拉伸性能

將試樣以24 mm/min(2%/s)的速率拉伸直至斷裂，拉伸初始隔距為20 mm[20-21]。試樣斷裂強度的計算方法如式(1)所示。選取試樣應(yīng)力-應(yīng)變曲線線性部分計算彈性模量[22]，如式(2)所示。

(1)

式中：σ為斷裂強度，MPa；F為斷裂強力，N；S為試樣橫截面積，mm2。

(2)

式中：E為彈性模量，MPa；ε為應(yīng)變。

1.4.2 彈性回復(fù)性能

一定次數(shù)的循環(huán)拉伸預(yù)處理可以提高試樣的模量，減小殘余形變，使應(yīng)力-應(yīng)變曲線穩(wěn)定[18]。因此，所有試樣在進行彈性回復(fù)測試前均進行預(yù)處理，初始隔距為20 mm，預(yù)處理載荷為30 N，拉伸速度為120 mm/min，循環(huán)次數(shù)為10次。預(yù)處理后，進行極限載荷下的單次彈性回復(fù)測試，極限載荷為46.8 MPa(接近但略小于人體ACL斷裂強度)，加載與卸載速度均為120 mm/min，停留時間為1 s[18]。單次加載-卸載循環(huán)曲線如圖2所示。

試樣彈性回復(fù)率按式(3)計算。

(3)

式中：L為總伸長，mm；L′為殘余伸長，mm。

1.4.3 循環(huán)拉伸疲勞性能

循環(huán)拉伸疲勞性能測試的定伸長率為10%，拉伸速度與回程速度均為120 mm/min，反復(fù)次數(shù)為500次，循環(huán)拉伸后，將試樣再以24 mm/min的恒定速率拉伸直至斷裂[22]。試樣斷裂強度衰減率(Δσ)和彈性模量增加率(ΔE)的計算如式(4)和(5)所示。

(4)

式中：σ為循環(huán)拉伸前斷裂強度，MPa；σ′為循環(huán)拉伸后斷裂強度，MPa。

(5)

式中：E0為循環(huán)拉伸前彈性模量，MPa；E1為循環(huán)

拉伸后彈性模量，MPa。

1.5 體外加速降解試驗

人工韌帶的再生誘導(dǎo)性能對于植入效果起著至關(guān)重要的作用，除了生物相容性涂層和生長因子，孔隙也是組織長入的關(guān)鍵因素之一[20]。目前關(guān)于可吸收人工韌帶的研究都采用單一材料，未涉及梯度化降解，且未達到較大的初始強度，結(jié)構(gòu)偏緊密且孔隙較少[23]，故在新生組織長入過程中無法提供足夠的空間。

為快速觀測人工韌帶的降解過程，將試樣浸沒在pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，在恒溫搖床中保持50 ℃、60 r/min的降解條件，每2 d換液一次，取樣時間分別為0、3、6、9、12、18、24、30和36 d，試樣取出后用去離子水清洗，用濾紙擦干表面水分，于-20 ℃冰箱中冷凍24 h后再冷凍干燥24 h。

1.6 細胞毒性試驗

將試樣充分剪碎并混勻，放入酒精缸過夜滅菌，按照0.1 mg/mL的標準[24]加入含血清的完全培養(yǎng)基(90% DMEM+10%胎牛血清+1%雙抗+1%丙酮酸鈉)，在37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中浸提24 h。以每孔105個細胞密度接種在96孔板上，再加入100 μL待測液體(試驗組：100%浸提液；陰性對照組：完全培養(yǎng)基；陽性對照組：10%DMSO溶液)。培養(yǎng)1、3和5 d后取出，使用酶聯(lián)測試儀(美國Thermo公司)測試各孔的吸光度(OD)值，選擇波長450 nm。通過式(5)計算得出細胞的相對增殖率(Rgr)。根據(jù)表3中的分級標準評價細胞毒性[25]。

(5)

式中：ODm和ODn分別為試驗組和陽性對照組的平均OD值。

表3 細胞毒性評級標準

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，用t檢驗法比較樣本間的顯著性差異，置信區(qū)間為[0,0.95]。不同試樣間斷裂強度、彈性模量以及循環(huán)拉伸前后試樣的斷裂強度和彈性模量進行顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 人工韌帶的結(jié)構(gòu)參數(shù)

人工韌帶的結(jié)構(gòu)特征如圖3所示，其中，藍色紗線為PPDO，金色透明紗線為PGCL，白色復(fù)絲為PGLA。由圖3可以看出，在殼層與核層結(jié)構(gòu)中，3種紗線沿軸向螺旋上升排列，彼此交織。6種人工韌帶試樣的結(jié)構(gòu)參數(shù)如表4所示。

表4 試樣的結(jié)構(gòu)參數(shù)

2.2 人工韌帶的力學(xué)性能

2.2.1 拉伸性能

試樣的拉伸斷裂測試結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，6種試樣的斷裂強度均大于人自體ACL的斷裂強度(48.24 MPa)，試樣Ab和Bb的彈性模量高于人自體ACL的彈性模量(111 MPa)[17, 26]。

當3種紗線組分配比相同時，3類不同編織結(jié)構(gòu)人工韌帶的斷裂強度與彈性模量間的關(guān)系分別為Ab>Aa>Ac，Bb>Ba>Bc(P<0.05)，即編織結(jié)構(gòu)b的斷裂強度與彈性模量最高，c最低。雖然3種編織結(jié)構(gòu)中PPDO、PGCL和PGLA紗線的總根數(shù)相同，但由于核層編織紗的編織角顯著小于殼層編織結(jié)構(gòu)(P<0.05)，因此，核層為主要承力結(jié)構(gòu)，而殼層起包覆作用。結(jié)構(gòu)b核層的6根6股編織紗間的排列比結(jié)構(gòu)a核層的3根12股編織紗更緊密，抱合力更大；結(jié)構(gòu)b核層編織紗的編織角(Ab和Bb試樣分別為20.60°和24.91°)比結(jié)構(gòu)a核層的編織角(Aa和Ba試樣分別為29.29°和29.82°)小。由此可見，核層編織紗的結(jié)構(gòu)以及紗線根數(shù)的差異導(dǎo)致不同試樣的力學(xué)性能出現(xiàn)差異。因此，當試樣受到軸向拉伸時，有更多的紗線承擔軸向拉伸載荷，提高了試樣的強度與模量。具有結(jié)構(gòu)c的試樣斷裂強度與彈性模量顯著低于結(jié)構(gòu)a和b(P<0.05)。這是由于結(jié)構(gòu)c的核層為2根12股編織紗，其能夠承擔軸向拉力的紗線根數(shù)僅為結(jié)構(gòu)a和b的2/3，這種結(jié)構(gòu)的人工韌帶試樣植入人體后將極易斷裂或失效。因此，本文優(yōu)選試樣Aa、Ab、Ba和Bb做進一步分析全可吸收人工韌帶的彈性回復(fù)性能和疲勞性能。

2.2.2 彈性回復(fù)性能

試樣的彈性回復(fù)率測試結(jié)果如表5所示，加載-卸載單次循環(huán)曲線如圖5所示。由表5可知，各試樣的彈性回復(fù)率無顯著性差異(P>0.05)。文獻[18, 27]研究表明，編織人工韌帶在接近人體ACL斷裂強度(48.24 MPa)時的彈性回復(fù)率為30%～50%。本文所設(shè)計的試樣(Aa、Ab、Ba和Bb)在接近人體ACL斷裂強度時的彈性回復(fù)率均高于上述文獻所述的結(jié)果，表明本文所設(shè)計的人工韌帶具有著優(yōu)異的回縮變形能力，能夠在人體經(jīng)歷生理活動后快速恢復(fù)其原長，從而維持股骨和脛骨的相對位置。

表5 試樣的彈性回復(fù)率

2.2.3 循環(huán)拉伸疲勞性能

人工韌帶植入人體后須能夠承受循環(huán)載荷，并允許膝關(guān)節(jié)在一定范圍內(nèi)運動而不受損傷[22]。在經(jīng)過500次循環(huán)拉伸后，試樣的拉伸斷裂測試結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知：循環(huán)拉伸后，所有試樣的斷裂強度仍顯著大于人自體ACL斷裂強度。試樣Aa、Ab、Ba和Bb的斷裂強度分別降低了10.21%、7.81%、5.33%和4.15%，試樣Ba和Bb的斷裂強度較循環(huán)拉伸前無顯著性下降(P>0.05)。這是因為，與組分配比為A(PPDO∶PGCL∶PGLA=6∶4∶2)的試樣相比，組分配比為B(PPDO∶PGCL∶PGLA=4∶6∶2)的試樣中PGCL紗線根數(shù)多，而PGCL紗線的斷裂強度大于PPDO紗線，因此循環(huán)拉伸對試樣Ba和Bb的拉伸性能影響較小，使得這兩種試樣的強度衰減率較低。所有試樣在循環(huán)拉伸后，彈性模量均有所增加。在拉伸過程中，編織結(jié)構(gòu)中的紗線在循環(huán)載荷的作用下，發(fā)生移動與重排，更多的紗線趨于軸向排列，編織角減小，因此試樣的彈性模量增大[27]。

2.3 體外降解性能

選取斷裂強度與彈性模量最高的試樣Ab、Bb進行體外加速降解試驗。不同降解周期時的人工韌帶試樣的表觀形態(tài)如圖7所示。

由圖7可以看出：降解前，人工韌帶試樣的3種紗線緊密交織；降解12 d后，試樣Ab和Bb中PGLA紗線發(fā)生斷裂，PGCL紗線表面出現(xiàn)縱向裂紋；降解36 d后，人工韌帶中的PGLA與PGCL紗線已完全降解脫落，剩下降解周期較長的PPDO組分維持人工韌帶的骨架。在降解前期，3種紗線共同支撐人工韌帶的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，隨著PGLA與PGCL紗線的降解，人工韌帶出現(xiàn)更多的孔隙，PPDO紗線螺旋纏繞組成其基本框架，提供力學(xué)性能，同時為后續(xù)原位植入后組織的長入提供足夠的空間。

體外加速降解試驗于50 ℃下進行，升溫加速降解過程中，聚合物材料未發(fā)生相變，即材料降解機制不變。文獻[28]指出，50 ℃下材料的降解速率約為人體內(nèi)環(huán)境溫度(37 ℃)下降解速率的4.67倍。即試樣在體外50 ℃環(huán)境下降解12和36 d分別相當于在體內(nèi)降解8和24周，此時人工韌帶的纖維與纖維間的空隙逐漸增大，允許新生組織沿剩余纖維爬行生長，形成自體韌帶。由此可見，人工韌帶的梯度化降解周期與前交叉韌帶修復(fù)術(shù)后細胞增殖和組織長入的時間基本匹配，與韌帶愈合周期基本吻合，即基本滿足臨床對于人工韌帶可控梯度化降解的需求。

2.4 細胞毒性

試樣細胞相對增殖率測試結(jié)果如圖8所示。由圖8可知，細胞在試樣Ab和Bb浸提液中培養(yǎng)5 d后的相對增殖率分別為101.65%和96.74%。相比第1 d，試樣Ab和Bb第5 d的細胞相對增殖率分別下降2.89%和1.15%，兩種試樣的細胞相對增殖率無顯著性下降(P>0.05)。試樣Ab和Bb的細胞毒性評級分別為0和1[25]，無細胞毒性，表明由本文所選用的3種可吸收材料制備的不同結(jié)構(gòu)的人工韌帶均具有良好的細胞相容性。

3 結(jié) 語

本文設(shè)計并制備了6種核殼結(jié)構(gòu)的全可吸收人工韌帶，研究了組分配比和編織結(jié)構(gòu)(核層和殼層)對人工韌帶力學(xué)性能、降解性能以及細胞相容性的影響。結(jié)果表明，試樣Ab(組分配比PPDO∶PGCL∶PGLA=6∶4∶2，編織結(jié)構(gòu)為6×6+Ⅰ)與Bb(組分配比PPDO∶PGCL∶PGLA=4∶6∶2，編織結(jié)構(gòu)為6×6+Ⅰ)的拉伸性能和彈性回復(fù)性能更為優(yōu)異，循環(huán)拉伸后仍滿足人工韌帶的力學(xué)要求，且具有較好的抗疲勞強度。體外加速降解試驗結(jié)果表明，本文所設(shè)計的人工韌帶試樣的降解時間與組織長入時間基本匹配，符合人工韌帶的臨床功能性要求，且所有試樣均無細胞毒性。后續(xù)有待于進一步開展動物試驗以研究全可吸收人工韌帶的原位降解性能與組織再生匹配性。