蘭 凱，張光偉，劉樹(shù)義，張旭東，田 甜

（西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710021）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見(jiàn)的慢性微血管并發(fā)癥之一，近年來(lái)我國(guó)糖尿病發(fā)病率不斷增長(zhǎng)。糖尿病腎病初期癥狀不明顯，容易造成漏診，一旦發(fā)展到終末期腎病就必須依靠腎臟替代治療來(lái)維持，因此早期診斷及治療成為學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。有研究顯示[1]，骨化三醇具有減輕糖尿病腎病大鼠蛋白尿及腎臟保護(hù)作用，但具體影響機(jī)制尚不清楚，可能與減輕腎小球系膜基質(zhì)增生有關(guān)，目前這方面的研究較少。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)在腎臟疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中Smad1 蛋白發(fā)揮信號(hào)傳導(dǎo)作用，被認(rèn)為是糖尿病腎病腎損傷的標(biāo)志物，其可直接調(diào)節(jié)腎小球基底膜Ⅳ型膠原等關(guān)鍵纖維化因子的轉(zhuǎn)錄活性，從而可能影響到蛋白尿的發(fā)生[2，3]。本研究擬通過(guò)骨化三醇對(duì)糖尿病腎病大鼠尿液信號(hào)蛋白Smad1 水平的影響及尿蛋白改變情況，探討該藥物對(duì)腎臟保護(hù)作用的可能機(jī)制，為糖尿病腎病的診治提供新的思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 購(gòu)入清潔級(jí)封閉群雄性SD大鼠30 只，體質(zhì)量（200±20）g，均普通飲食喂養(yǎng)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為骨化三醇組（T 組）、DN組（D 組）和對(duì)照組（N 組），每組10 只。大鼠進(jìn)行糖尿病腎病造模，剩余10 只大鼠為健康對(duì)照組（N組）。本研究嚴(yán)格按照我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理的要求進(jìn)行，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照西安醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)的指導(dǎo)方針進(jìn)行，并經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的構(gòu)建 T 組和D 組大鼠禁食10 h后，予鏈脲菌素（美國(guó)Sigma 公司）單次無(wú)菌經(jīng)腹腔注射，60 mg/kg，健康對(duì)照組給予腹腔注射等量的檸檬酸緩沖液，常規(guī)飲食喂養(yǎng)，檢測(cè)血糖。72 h 后T組和D 組分別取大鼠尾靜脈血檢測(cè)空腹血糖（FBG），F(xiàn)BG≥16.65 mmol/L 確定糖尿病大鼠造模成功，正常飲食喂養(yǎng)3 周后留尿檢測(cè)24h 尿蛋白量≥30 mg 確定為糖尿病腎病大鼠。T 組將骨化三醇（上海羅氏制藥公司，規(guī)格0.25 μg/粒，批號(hào)J20190056）溶于花生油，以0.03 μg/（kg·d）的劑量進(jìn)行灌胃治療；D 組和N 組均給予等量的花生油灌胃。

1.2.2 血、尿指標(biāo)檢測(cè) 12 周后所有大鼠代謝籠收集24 h 尿液，記錄24h 尿量和飲水量，進(jìn)食8～10h 后稱重，用10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血4～5 ml，立即送檢。24h 尿蛋白采用雙縮脲法檢測(cè)，依照試劑盒（美國(guó)R&D 公司試劑盒）操作流程，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 測(cè)定大鼠尿液Smad1 蛋白水平；自動(dòng)生化儀（美國(guó)Glamour 生化儀）檢測(cè)空腹血糖（FBG）、血肌酐（Scr）、血鈣、血磷和甲狀旁腺激素（PTH）。

1.3 觀察指標(biāo) 比較治療12 周后各組24h 尿蛋白含量、尿Smad1 蛋白水平、血肌酐、血鈣、血鱗、空腹血糖及PTH。分析尿液Smad1 水平和24h 尿蛋白量相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用（）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSDt檢驗(yàn)。兩變量之間相關(guān)性描述采用直線相關(guān)性分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療12 周后各組大鼠血指標(biāo)比較 T、D 組空腹血糖、肌酐和PTH 均高于N 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；T 組肌酐低于D 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；T 組血鈣、血磷與N 組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 治療12 周后各組大鼠血指標(biāo)比較（）

表1 治療12 周后各組大鼠血指標(biāo)比較（）

注：與N 組比較，aP＜0.05；與P 組比較，bP＜0.05

2.2 治療12 周后各組大鼠尿液Smad1 水平和24h尿蛋白量變化情況 T 組和D 組尿液中的Smad1 水平及24h 尿蛋白高于N 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；T 組尿液中Smad1 水平及24h 尿蛋白低于D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 治療12 周后各組大鼠尿液smadl 水平和24 h 尿蛋白量變化比較（）

表2 治療12 周后各組大鼠尿液smadl 水平和24 h 尿蛋白量變化比較（）

注：與N 組相比，aP＜0.05；與P 組相比，bP＜0.05

2.3 尿液Smad1 水平和24 h 尿蛋白量相關(guān)性 糖尿病腎病大鼠尿液中Smad1 蛋白水平和24h 尿蛋白量呈正相關(guān)（r=0.671，P＜0.05）。

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病病人最為常見(jiàn)的慢性微血管特異性并發(fā)癥，糖尿病腎病發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，已成為導(dǎo)致臨床終末期腎病的主要病因之一[4，5]。由于該病患者機(jī)體存在復(fù)雜的代謝紊亂，往往要比其它腎臟疾病治療起來(lái)更加棘手。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病發(fā)病包括糖的高代謝異常、腎組織氧化應(yīng)激及腎臟血流動(dòng)力學(xué)改變等因素，均可引起腎小球?yàn)V過(guò)膜的損傷，最終導(dǎo)致患者蛋白尿的發(fā)生，而微量蛋白尿被廣泛認(rèn)為就是糖尿病腎病的早期標(biāo)志[6，7]。臨床上患者出現(xiàn)持續(xù)性蛋白尿說(shuō)明腎臟可能已經(jīng)發(fā)生的實(shí)質(zhì)性損害。蛋白尿目前已被證實(shí)是腎臟損傷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，有效控制蛋白尿可以延緩糖尿病腎病腎臟功能減退，是目前研究治療的一個(gè)突破口。

近來(lái)多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)維生素D 具有除調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣磷代謝以外更廣泛的生理作用，其還可能影響免疫、生殖、內(nèi)分泌、神經(jīng)等生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)?；钚跃S生素D 是一種脂溶性維生素，其通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)特異維生素D 受體（vitamin D receptor，VDR）發(fā)揮生物學(xué)活性[8，9]。維生素D 類似物的分子結(jié)構(gòu)同活性維生素D 相似，可以和VDR 結(jié)合通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾改變產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，具有與活性維生素D相似的生物學(xué)活性，目前主要包括骨化三醇、帕立骨化醇和度骨化醇等[10，11]。骨化三醇作為維生素D類似物中臨床應(yīng)用最為廣泛的一種，前期的研究主要集中在其調(diào)節(jié)鈣磷代謝及治療佝僂病等方面的作用，近年來(lái)有關(guān)骨化三醇可能參與腎臟保護(hù)作用的研究越來(lái)越多。

本研究發(fā)現(xiàn)在骨化三醇治療12 周后糖尿病腎病大鼠蛋白尿指標(biāo)較未治療組明顯下降，肌酐水平也有下降，尿液中的Smad1 蛋白水平較未治療組有所下降，證實(shí)了其具有獨(dú)立于鈣磷代謝以外的腎臟保護(hù)作用，推測(cè)骨化三醇可能具有影響信號(hào)蛋白Smad1 的作用。Smad 蛋白家族被證實(shí)是一類細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，其可將TGF-β 信號(hào)通路信息從受體傳導(dǎo)至靶向細(xì)胞內(nèi)核中，并可在多種靶向細(xì)胞種類中發(fā)揮重要作用，如調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化凋亡，合成基質(zhì)等，同時(shí)也參與免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)[12，13]。有研究發(fā)現(xiàn)，Smad1 蛋白作為Smad 蛋白家族一員是TGF-β1下游重要的信號(hào)傳導(dǎo)因子，在糖尿病腎病整個(gè)病程的進(jìn)展中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)足細(xì)胞線粒體NADPH 氧化酶增多，抑制了線粒體的功能，誘導(dǎo)腎小球的肥大、形狀的改變，甚至細(xì)胞凋亡，最終可引起腎小球硬化，造成腎臟功能的持續(xù)惡化，導(dǎo)致患者進(jìn)入終末期腎病[14-16]。研究發(fā)現(xiàn)骨化三醇不僅具有調(diào)節(jié)鈣磷代謝的生物學(xué)作用，還可能通過(guò)影響炎癥因子分泌、改善系膜細(xì)胞增殖、抑制RAS 系統(tǒng)、減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積等途徑改善糖尿病腎病病理生理過(guò)程，具有獨(dú)立于鈣磷代謝以外的腎臟保護(hù)作用[17-19]，但其具體作用機(jī)制尚不完全清楚。有研究表明[20,21]，骨化三醇可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)核因子κB 通路，影響其下游的炎癥因子表達(dá)減少，抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而緩解腎臟組織炎癥損傷及腎小球纖維化的進(jìn)展，從而對(duì)改善腎臟功能起到一定的保護(hù)作用，與上述研究結(jié)果是一致的。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病大鼠尿液中Smad1 信號(hào)蛋白水平和24 h 尿蛋白量成存在正相關(guān)趨勢(shì)，這也說(shuō)明了Smad1 信號(hào)蛋白可以影響糖尿病腎病蛋白尿的發(fā)生及進(jìn)展，其能否作為糖尿病腎病診斷檢測(cè)的指標(biāo)還需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，骨化三醇可以調(diào)節(jié)信號(hào)蛋白Smad1水平，從而改善糖尿病腎病大鼠蛋白尿的，改善腎臟功能，延緩糖尿病腎病的發(fā)展，給臨床上糖尿病腎病的診斷治療提供了新思路。