范海茹，李淑英，許斌，高雅鑫，張蒙冉，王鳳忠

(中國農業(yè)科學院農產品加工研究所，北京 100193)

鮮味在我國飲食文化中占有重要地位[1]。鮮味肽是從食物中提取，或經氨基酸合成得到的小分子肽，可增強食物的鮮味和醇厚味，弱化苦味強度[2]。國內外鮮味調味品迭代升級，營養(yǎng)型調味品受到青睞，該類調味品含動植物蛋白水解物等，增強食品風味的同時補充人體所需的氨基酸等營養(yǎng)成分[3]。充分挖掘利用我國的植物蛋白資源，開展鮮味肽研究已成熱點。

豆粕是大豆提油后得到的副產物，含有大豆中的全部蛋白，氨基酸組成比例較好[4]。高溫豆粕經高溫脫溶制得，產量占豆粕總產量的95%[5]，目前主要應用于飼料行業(yè)[6]，在食品領域的開發(fā)應用較少[7]。

酶解在食品工業(yè)中主要用來對蛋白質進行物性修飾，豆粕經酶解可制備小肽和氨基酸[8]，有效提高蛋白質的吸收利用率和營養(yǎng)價值[9-11]，但通常酶解產物苦味較高，限制了產品應用[12]。單一蛋白酶酶解產生的小肽含量較低，苦味大，不適宜產品開發(fā)。目前較為普遍的是連續(xù)酶解技術，可提高蛋白質的水解效率，有效緩解酶解產物單一風味的問題[13]。有研究表明，苦味形成與多肽C-末端的疏水性氨基酸和N-末端的堿性氨基酸有關，若將此類氨基酸切除，苦味值會明顯降低[14]。因此，可以先用作用位點是疏水性氨基酸和堿性氨基酸的內切酶水解，再用外切酶切除這兩類氨基酸，達到脫苦效果。

前期研究已確定了適合高溫豆粕水解的內、外切酶和酶解工藝。本文在前期研究基礎上，擬結合感官風味和理化指標，確定最適連續(xù)酶解組合工藝，探究豆粕水解肽的呈味機制，以期實現高溫豆粕的高值化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高溫豆粕：市售；堿性蛋白酶(200000 U/g)、中性蛋白酶(50000 U/g)、木瓜蛋白酶(100000 U/g)：北京索萊寶科技有限公司；風味蛋白酶(≥500 U/g)：Sigma公司；甲醛、NaOH、HCl(分析純)：國藥集團化學試劑有限公司。

Mettler Toledo FiveEasy Plus型pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；FA2004型電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；FW 100型高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；UDK 159型全自動凱氏定氮儀 意大利VELP公司；RH-QA型恒溫搖床 常州中誠儀器制造有限公司；3K15型醫(yī)用離心機 Sigma公司；G136T型滅菌鍋 Autoclave公司；L-8900型全自動氨基酸分析儀 日本日立公司；AstreeⅡ/LS16型電子舌 法國Alpha MOS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

用粉碎機粉碎高溫豆粕，過80目篩，備用。

1.2.2 連續(xù)酶解高溫豆粕蛋白工藝

本批次所用高溫豆粕原料的蛋白質含量為40.41%。前期研究確定的最適內切酶有堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，外切酶是風味蛋白酶；最佳酶解工藝見表1。參考劉媛等[15]的內切酶和外切酶分步酶解的方式酶解豆粕。根據內切酶種類，設計7種方案制備酶解產物，旨在改善水解液風味的同時，制備營養(yǎng)價值高、富含小肽的肽粉。(1)木瓜蛋白酶+風味蛋白酶(簡寫為Pap)；(2)中性蛋白酶+風味蛋白酶(簡寫為Neu)；(3)堿性蛋白酶+風味蛋白酶(簡寫為Alc)；(4)堿性蛋白酶+中性蛋白酶+風味蛋白酶(簡寫為Alc-n)；(5)堿性蛋白酶+木瓜蛋白酶+風味蛋白酶(簡寫為Alc-p)；(6)中性蛋白酶+木瓜蛋白酶+風味蛋白酶(簡寫為Neu-p)；(7)堿性蛋白酶+中性蛋白酶+木瓜蛋白酶+風味蛋白酶(簡寫為Alc-n-p)。

表1 蛋白酶酶解條件Table 1 The enzymatic conditions for different proteases

1.2.3 水解度(degree of hydrolysis，DH)的測定

參考葉健明等[16]的方法，采用pH-Stat法，計算水解度，其中每克蛋白質底物(豆粕)中具有的肽鍵毫摩爾數為8.38。

1.2.4 可溶性氮、氨基氮含量和肽氮含量的檢測

可溶性氮含量：酶解上清液與底物中含氮量的比值，上清液和底物中的含氮量均用GB 5009.5-2016方法測定。

氨基氮含量：酶解上清液中游離氨基酸所含氮量與底物中總氮量的比值，游離氨基酸含氮量采用甲醛滴定法測定[17]。

肽氮含量：酶解上清液中可溶性氮含量與氨基氮含量之間的差值。

1.2.5 電子舌分析

參考王銀誠等[18]的方法，略作修改。將不同酶解組合的酶解產物置于電子舌專用燒杯中，每杯樣品量為100 mL。每個樣品重復測定7次，選取后4次穩(wěn)定后的數值計算平均值作為統(tǒng)計分析的原始數據。

1.2.6 滋味稀釋分析(taste dilution analysis，TD)

參考Liu等和Seo等的方法[19-20]，采用比較滋味稀釋分析，通過等比例稀釋豆粕酶解產物進行滋味稀釋因子測定。

1.2.7 氨基酸含量的測定

豆粕中總氨基酸含量的測定：稱取適量樣品于水解管中，加入10 mL 6 mol/L HCl，充氮氣1 min以排出管內空氣，擰緊蓋子后放入110 ℃烘箱內水解24 h，取出后冷卻至室溫，混勻過濾。定容到50 mL容量瓶內，定容混勻后取1 mL進行氮吹，直至吹干。用0.02 mol/L HCl復溶5 mL混勻后過0.2 μm濾膜，進液相小瓶約1 mL待用。

豆粕游離氨基酸含量的測定：樣品0.1 mL用5 mL超純水稀釋并超聲10 min，5000 r/min 離心15 min，取1 mL上清液加入1 mL 8%磺基水楊酸，在10000 r/min條件下離心15 min，取1 mL上清液氮吹至干，加入1 mL 0.02 mol/L HCl復溶，過0.22 μm濾膜，于4 ℃保存待測。

1.3 數據處理

每次實驗至少重復3次，取平均值。實驗數據以“平均值±標準偏差”表示，用GraphPad軟件作圖，用Design Expert 8.0.6軟件進行方差分析。

2 實驗結果

2.1 高溫豆粕水解程度分析

本文選用前期研究確定的最適內切酶(堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶)和外切酶(風味蛋白酶)，采用連續(xù)酶解組合的方式，設計7種方案，研究其對高溫豆粕蛋白的利用率。通過對比7種酶解產物的水解度和可溶性氮含量，可初步判斷產物的水解程度。水解度表示水解過程中蛋白質肽鍵的裂解程度；酶解產物的可溶性氮可綜合反映不同酶解方案下豆粕蛋白的利用率，是氨基氮和肽氮含量之和。7種高溫豆粕酶解產物的水解度和可溶性氮含量見圖1。

圖1 豆粕蛋白酶解產物的水解度和可溶性氮含量Fig.1 The degree of hydrolysis and soluble nitrogen content of soybean meal protease hydrolysate

由圖1可知，水解度不一定會因內切酶數量的增多而提高。不同酶解產物的水解度由高到低依次是Alc-p、Alc-n-p、Neu-p、Alc-n、Neu、Pap、Alc，其中Alc-p、Alc-n-p、Neu-p、Alc-n、Neu的酶解產物水解度無顯著性差異，分別為53.85%、47.55%、46.70%、41.36%和35.31%。在所有方案中，可溶性氮的含量從高到低的組合方案依次為Alc-n-p、Alc-n、Alc-p、Alc、Neu、Pap、Neu-p。水解產物的可溶性氮含量均高于80%，說明7種酶解方案均有廣泛的作用位點，都能夠有效地降解豆粕蛋白中疏水性物質，滿足了生產需求，確保了高溫豆粕蛋白可以得到充分利用。

2.2 高溫豆粕酶解產物分析

7種方案的酶解組合都可以將高溫豆粕蛋白較高效地酶解，在確保豆粕蛋白利用率高的同時，還要考慮所得多肽的純度。肽氮含量和肽粉純度息息相關，肽粉純度與產品質量直接相關，決定產品價值，測定結果見圖2。

圖2 豆粕蛋白酶解產物中肽氮含量Fig.2 The peptide nitrogen content of soybean meal protease hydrolysate

所有酶解方案中，肽氮含量均在50%以上，其中Alc-p、Alc-n-p和Pap的肽氮含量高于60%，分別為66.44%、60.56%、60.31%，剩余由高到低依次是Alc-n、Alc-n-p、Neu、Alc和Neu-p酶解產物，說明內外切蛋白酶連續(xù)水解技術可以有效地將豆粕蛋白轉化為多肽，有利于小肽的富集。

2.3 高溫豆粕酶解產物的感官分析

本文采用電子舌技術探究了不同酶解產物的風味變化，并選擇雞精、味精、菌菇精、復合氨基酸和呈味核苷酸二鈉(I+G)作為鮮味標品，探究酶解產物的呈味特性。PCA分析圖見圖3。

圖3 豆粕蛋白酶解產物的電子舌PCA分析圖Fig.3 Electronic tongue PCA analysis of soybean meal protease hydrolysate

由圖3可知，2個主成分共反映原來信息的95.30%，表明PCA降維后的數據能夠很好地反映原始數據信息。電子舌PCA圖上樣品之間的距離遠近與它們之間的差異性存在一定的相關性，距離越近，差異越小[21]。不同酶解產物均落到第二和第三象限，并呈現一定的變化趨勢，即“Alc→Neu→Pap”。第二象限從上到下依次為Alc-n-p、Alc-n、Alc-p和Alc，4種酶解產物的共性酶分別為堿性蛋白酶和風味蛋白酶，除此之外，Alc-n-p還有中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，Alc-n有中性蛋白酶，Alc-p有木瓜蛋白酶，Alc-n和Alc-p在位置上極為相近。第三象限從上到下依次為Neu-p、Neu和Pap，Neu-p和Neu酶解產物的共性酶分別為中性蛋白酶和風味蛋白酶，此外Neu-p較Neu多使用一種木瓜蛋白酶，Pap是木瓜蛋白酶和風味蛋白酶的酶解產物。由以上結果可以看出，電子舌可以有效區(qū)分不同蛋白酶的酶解產物，對酶解風味影響較為顯著的蛋白酶組合依次為：堿性蛋白酶+風味蛋白酶>中性蛋白酶和風味蛋白酶>木瓜蛋白酶和風味蛋白酶。而且可以看出復合連續(xù)酶解使用的酶種類越多，水解產物的呈味特性越豐富，這可能與產生的末端氨基酸種類多少有關。

本文選擇的鮮味標品中雞精、菌菇精和復合氨基酸落到了PCA圖的第一象限，而味精和“I+G”落到第三和四象限之間且與Neu-p的酶解產物較為相近。味精是我國家常調味料，主要成分為谷氨酸鈉；“I+G”由5＇-肌苷酸二鈉(IMP)和5＇-鳥苷酸二鈉(GMP)按1∶1的比例混合而成，是新一代的核苷酸類食品增鮮劑，是經濟而且效果較好的鮮味增強劑，可直接加入食品中，起增鮮作用，是方便面調味包和其他調味品的主要呈味成分之一，與味精合用具有協同增鮮的作用，因此也被稱為“強力味精”。本文研究結果表明“Alc-n-p、Alc-n、Alc-p和Alc”共處于第二象限，在風味上應該更相近且可能有一定的共性特征；而“Neu-p、Neu和Pap”共處于第三象限，Neu-p的酶解產物在呈味特性上與味精和“I+G”極為相似。

電子舌由5根味覺傳感器組成，從第一象限到第四象限分別為“UMS(鮮)、SWS(甜)、STS(咸)、SRS(酸)、GPS(復合味1)、SPS(復合味2)和BRS(苦)”。參考圖3中B的PCA載荷圖與圖3中A疊加可知，鮮味劑復合氨基酸在風味上可能偏鮮和甜一些，雞精偏咸一些，“Alc-n-p、Alc-n、Alc-p和Alc”的酶解產物可能更酸一些，“Neu-p、Neu和Pap” 的酶解產物可能比較復合，風味上應該更豐富一些。綜合電子舌分析結果，Neu-p的酶解產物在風味和呈味特性上應該更好一些，有望深入開發(fā)成鮮味肽。

2.4 高溫豆粕酶解產物的滋味分析

為進一步探究影響酶解產物呈味的因素，本文對水解液的呈味特性進行了初步判斷，并對產物中多肽的氨基酸組成進行了測定。TD值即滋味值，可以初步判斷產物的呈味特性，值越高，呈味特性越明顯。酶解產物呈味的影響因素有很多[22]，一些研究者研究發(fā)現，鮮味肽中一般會含有谷氨酸或天冬氨酸等親水性氨基酸殘基[23-24]。鮮味肽的呈鮮特性不僅與鮮味氨基酸組成有關，除此之外，還與其一級結構和氨基酸序列相關，當鮮味肽的氨基酸組成相同時，其呈味特性會因氨基酸在肽鏈上的位置不同而發(fā)生改變[25]。由實驗結果可知，本文的7種酶解產物就滋味強弱而言共分為3組：Alc-p(TD=16)，Pap、Neu、Neu-p和Alc-n-p(TD=8)，以及Alc和Alc-n(TD=2)。就氨基酸組成分析而言，谷氨酸和天冬氨酸呈鮮味。7種酶解方案中，多肽的鮮味氨基酸所占比例由高到低是Alc-n、Neu、Pap、Alc、Neu-p、Alc-n-p和Alc-p，占比依次為38.69%、38.59%、38.54%、38.10%、37.32%、36.75%和33.55%，其中Alc-n、Neu、Pap、Alc和Neu-p的鮮味氨基酸占比相互間無顯著差異，Alc-p酶解產物與其他產物有顯著性差異，與Alc-n產物呈極顯著差異。Alc-p的鮮味氨基酸占比最低，且滋味強度最強，致使其與鮮味標品的差異性較大，這可能與參與酶解的蛋白酶種類有關。Alc和Alc-n酶解產物中多肽的鮮味氨基酸所占比例較高，滋味強度最弱，說明外切酶有效地將肽段末端影響呈味的疏水性氨基酸切除，但是電子舌PCA分析中與鮮味標品的差異性較大，可能是因為鮮味肽在結構和氨基酸序列上的不同導致的。酶解產物就呈味特性而言大致可分為兩大組：“Alc-n-p、Alc-n、Alc-p和Alc”組的酶解產物風味上可能偏酸一些，“Neu-p、Neu和Pap”組的酶解產物風味上可能比較綜合，更豐富一些。特別是Neu-p，在呈味特性上更像“味精和I+G”。眾所周知，味精的主要成分是谷氨酸鈉，而“I+G”自身風味相對較弱，但是與味精一起，添加量只要味精的2%～5%就具有協同增鮮的作用。

綜合上述結果表明，Alc-p酶解產物的TD值最大，即滋味最強，但是呈味偏酸，可能不太適合做風味肽；Neu-p酶解產物的TD值次之，即滋味較強，呈味特性與“味精和I+G”更像，極具開發(fā)鮮味肽的潛力。

圖4 豆粕蛋白酶解產物中多肽的鮮味氨基酸占比和TD值Fig.4 The proportion of umami amino acids and TD values of peptides in soybean meal protease hydrolysate

3 討論

本研究旨在改善酶解產物的風味，制備大量的營養(yǎng)價值高、富含小肽的肽粉，嘗試連續(xù)酶解的方式，探討內切酶和外切酶連續(xù)酶解對豆粕酶解產物的影響，綜合分析7種蛋白酶組合的酶解產物的水解度、可溶性氮、肽氮和氨基氮含量說明7種酶解組合均能有效水解高溫豆粕蛋白，制備純度較高的低聚肽；通過對TD值、電子舌和氨基酸組成進行分析，發(fā)現不同酶解組合制備的水解產物風味差異較大，“中性蛋白酶+木瓜蛋白酶+風味蛋白酶”連續(xù)酶解組合，即Neu-p組，制備的酶解產物滋味較強，呈味特性與“味精和I+G”更像，極具開發(fā)鮮味肽的潛力。

通過內切酶對豆粕蛋白進行水解，酶解產物的水解度不斷增大，相對分子質量逐漸降低，疏水性末端暴露，游離氨基酸和肽含量逐漸升高。耿瑞蝶等表示食品的苦味通常與蛋白質酶解所形成的能夠呈現苦味的短肽相關[26]。劉伯業(yè)的研究表明，內切酶會使酶解產物的水解度提高，也增加了酶解產物中苦味肽的含量，而且在苦味感官上起到了主導作用，可能是由于蛋白酶的內切位點不同，而引起氨基酸序列不同。本研究根據酶解產物呈現苦味的問題采用連續(xù)酶解的方式，將內切酶酶解產物再次用外切酶酶解，改善了酶解產物的風味，也使高溫豆粕蛋白得到了充分利用。黃金梅等研究證實采用多種酶進行分步水解，可以實現豆粕蛋白的深度水解，提高了豆粕蛋白的利用率[27]。不同蛋白酶的作用位點不同，中性蛋白酶水解Tyr、Phe等疏水性氨基酸殘基的羧基端肽鍵，有利于風味蛋白酶發(fā)揮外切作用，改善產物的口感，這也是電子舌PCA分析中中性蛋白酶參與組合的酶解產物與鮮味標品差異性更小的原因。木瓜蛋白酶主要作用于Lys、Arg等堿性氨基酸殘基的羧基端肽鍵，疏水性氨基酸常處在肽鏈中間，所以木瓜蛋白酶酶解產物與鮮味標品“味精和I+G”的差異性較中性蛋白酶酶解產物更大。堿性蛋白酶的水解位點是芳香族氨基酸殘基或疏水性氨基酸殘基的羧基端肽鍵，酶解后會使多肽C-末端的疏水性氨基酸增多，也極大增強了不良風味的強度，但是在外切酶的作用下，堿性蛋白酶的這一特點更有利于外切酶的發(fā)揮作用，又由于堿性蛋白酶有比中性蛋白酶和木瓜蛋白酶更多的內切位點，所以相對于Neu和Pap的酶解產物，多肽中的疏水性氨基酸比例會更低，致使Alc的酶解產物比Pap和Neu的TD值低。經過氨基酸含量測定后發(fā)現，在內切酶和外切酶連續(xù)酶解的過程中，酶解所得呈味肽中，谷氨酸和天冬氨酸占比較大時，可能會強化鮮味。也有研究者研究表明，除氨基酸種類外，鮮味肽的呈鮮特性還與氨基酸序列相關，氨基酸組成相同的鮮味肽，會因氨基酸在肽鏈上的位置不同，而發(fā)生呈味特性的變化。Tamura M等研究表明，鮮味肽結構中酸性基團和堿性基團所處位置會對鮮味產生影響，只有在C端是帶負電的酸性基團，N端是帶正電的堿性基團時，呈味二肽才表現出呈味特性，反之，則此肽不具備該特性[28]。但是酶解液的呈味效果不僅只單一的某種滋味，而是各種滋味的綜合效果，為生產較好的鮮味調味品還應考慮不同呈味肽的相互作用。

4 結論

本研究以高溫豆粕為原料，嘗試先用內切酶水解，再用外切酶切除多肽疏水性末端的方式，設計了7種蛋白酶組合對其進行酶解。研究發(fā)現采用連續(xù)酶解的方式可以有效提高水解度和可溶性氮含量，達到充分利用豆粕蛋白資源的目的。7種酶解產物的可溶性氮含量均高于80%，肽氮含量均高于50%；電子舌感官分析中，Neu-p酶解產物的差異性與鮮味標品味精和I+G的差異性最小，在呈味特性上與二者極為相似；酶解產物就滋味強弱而言共分為3組：Alc-p(TD=16)，Pap、Neu、Neu-p和Alc-n-p(TD=8)，以及Alc和Alc-n(TD=2)；并發(fā)現酶解產物在感官上帶來的差異，與水解度和多肽中鮮味氨基酸占比等有較大關系。綜合以上結果，本研究的7種蛋白酶組合中，中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風味蛋白酶組合酶解產物在風味和呈味特性上應該更好一些，有望深入開發(fā)成鮮味肽。