孟廣超，張艷芳，王選年*

(1.新鄉(xiāng)學(xué)院生物技術(shù)研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，鄭州 450001)

氨肽酶(Aminopeptidase)是一類從蛋白質(zhì)肽鏈N末端選擇性切除殘基并逐個(gè)游離出氨基酸的外切蛋白酶，它可以切除苦味肽氨端的疏水氨基酸，從而脫除苦味，在人們?nèi)粘Ｉ畹膶?shí)際生產(chǎn)中，多用于食品添加劑來改善食物的風(fēng)味和口感，提高食品的營養(yǎng)價(jià)值[1-3]。隨著當(dāng)前人們對食品風(fēng)味的要求逐漸變高，氨肽酶的發(fā)展廣受關(guān)注，它在生物活性肽的代謝中扮演著非常重要的角色。其次，氨肽酶在商業(yè)上擁有巨大的潛力，通過對蛋白水解產(chǎn)物中苦味肽的水解，并釋放游離的氨基酸，從而不僅使得蛋白質(zhì)水解物的風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值均得到提高，同時(shí)也可以使其加工周期變短[4-5]。

在我國氨肽酶的研究起源早，但是進(jìn)展緩慢，當(dāng)前市面上流通的商品化氨肽酶并不多見，且多是與其他蛋白酶的復(fù)合品，不僅價(jià)格昂貴，而且純度低[6-7]。最常見的氨肽酶來源是通過米曲霉的固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵來制取氨肽酶。氨肽酶的工業(yè)化問題仍然是調(diào)味品市場目前急需解決的問題。本實(shí)驗(yàn)在米曲霉產(chǎn)氨肽酶液態(tài)發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，逐步進(jìn)行優(yōu)化，旨在獲得最佳發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

米曲霉(Asergillusoryzae)：本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑與儀器

L-亮氨酸-4-硝基苯胺(分析純)：索萊寶公司；72S分光光度計(jì):美國IBAK公司；其他有機(jī)試劑:均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

米曲霉斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基，將土豆清洗干凈，切片，去皮，在沸水中煮20 min，用四層紗布過濾掉濾渣，加入15 g瓊脂，于121 ℃滅菌20 min。

液態(tài)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：硫酸銨2.5 g，磷酸氫二鉀3 g，氯化鈣 0.13 g，七水硫酸鎂0.2 g，七水硫酸亞鐵 0.0255 g，蛋白胨5 g，水1000 mL，pH自然，于121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 出發(fā)菌株的活化

將米曲霉接種于PDA斜面培養(yǎng)基進(jìn)行活化，于35 ℃培養(yǎng)3 d，待長滿嫩綠色孢子后備用。

1.2.2 孢子懸液的制備

用無菌水沖刷斜面培養(yǎng)基，洗脫斜面的米曲霉孢子，將孢子振蕩打散，制成孢子懸液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整好孢子懸液濃度為107個(gè)/mL備用。

1.2.3 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)

將調(diào)整好濃度的米曲霉孢子懸液接種到基礎(chǔ)液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在適當(dāng)條件下?lián)u瓶發(fā)酵培養(yǎng)，檢測氨肽酶活性。

1.2.4 氨肽酶活性的檢測方法

氨肽酶活性的測定采用亮氨酸對硝基苯胺法[8]，取適量發(fā)酵液在4 ℃，8000 r/min的條件下離心10 min，取上清粗酶液，并將上清粗酶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)。取100 μL稀釋后的酶液加入1.5 mL pH值為7.2的磷酸緩沖液于40 ℃水浴鍋中恒溫10 min，使其溫度穩(wěn)定，然后加入100 μL濃度為25 mmol/L的L-亮氨酸對硝基苯胺溶液，反應(yīng)10 min后，在405 nm下，以未加酶液為對照，測定吸光值。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：配制一系列不同濃度的對硝基苯胺溶液，以去離子水做對照，在405 nm下測定波長，以對硝基苯胺的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，以不同濃度的吸光值為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線中R2=0.9992。

酶活的定義[9]：在40 ℃、pH 7.2的條件下，每1 min水解亮氨酸對硝基苯胺生成1 μg對硝基苯胺(pNA)所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

酶活力計(jì)算公式：A×V1×D÷(k×t×V2)。

式中：A為吸光值，V1為反應(yīng)總體積，V2為酶液體積，D為酶液的稀釋倍數(shù)，k為消光系數(shù)，t為恒溫反應(yīng)時(shí)間。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

假設(shè)各個(gè)因素之間不存在相互影響的關(guān)系，每次實(shí)驗(yàn)改變一個(gè)因素水平，保持其他因素不變，分別對碳源、氮源、發(fā)酵時(shí)間、pH值、溫度、接種量、轉(zhuǎn)速等影響米曲霉產(chǎn)氨肽酶發(fā)酵條件的因素進(jìn)行考察[10]。

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)，在對影響氨肽酶活性的發(fā)酵時(shí)間、轉(zhuǎn)速、氮源、碳源、接種量、pH值、溫度、搖床轉(zhuǎn)速的單因素中，采用兩水平實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)確定各單因素對氨肽酶活性影響的顯著性[11]。

在Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采取三水平的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)面分析進(jìn)行對氨肽酶活性影響顯著的因素之間的函數(shù)模擬，尋找米曲霉產(chǎn)氨肽酶的活性與各因素的函數(shù)關(guān)系，通過數(shù)學(xué)的方法，找出米曲霉產(chǎn)氨肽酶活性的最大值，以及米曲霉產(chǎn)氨肽酶活性最大時(shí)各因素的水平，確定最佳發(fā)酵條件[12-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對米曲霉產(chǎn)氨肽酶的影響

圖1 培養(yǎng)過程中米曲霉產(chǎn)氨肽酶活性隨時(shí)間的變化Fig.1 Changes of aminopeptidase activity with time during culture

由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，氨肽酶的活性逐漸增加，在50 h時(shí)，米曲霉產(chǎn)氨肽酶的活性達(dá)到峰值152 U/mL，隨后開始下降，因此確定最佳發(fā)酵時(shí)間為50 h。

2.1.2 碳源對米曲霉產(chǎn)氨肽酶的影響

圖2 添加量為1%濃度的碳源對米曲霉產(chǎn)氨肽酶的影響Fig.2 Effects of carbon sources with 1% additive amount on aminopeptidase activity

由圖2可知，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入各類碳源后，米曲霉產(chǎn)氨肽酶的活性顯著下降，甚至幾乎喪失，原因可能是加入的碳源基本都是糖類物質(zhì)，在發(fā)酵液中，由于糖類物質(zhì)營養(yǎng)充分，米曲霉直接進(jìn)行糖酵解生理生化反應(yīng)，從而限制了氨肽酶以及其他蛋白酶系的形成，因此在本次實(shí)驗(yàn)中不添加其他碳源。

2.1.3 氮源對米曲霉產(chǎn)氨肽酶的影響

圖3 添加量為1%濃度的氮源對米曲霉產(chǎn)氨肽酶的影響Fig.3 Effect of nitrogen sources with 1% additive amount on aminopeptidase activity

由圖3可知，在添加了氮源之后，米曲霉產(chǎn)氨肽酶的活性顯著提高，無論是哪種氮源，都能對其活性有促進(jìn)作用，其中對氨肽酶活性影響最大的是牛肉膏，活性能達(dá)到453 U/mL，因此確定本次實(shí)驗(yàn)最佳的氮源為牛肉膏。

圖4 牛肉膏添加量對米曲霉產(chǎn)氨肽酶的影響

由圖4可知，隨著牛肉膏濃度的增加，米曲霉產(chǎn)氨肽酶的活性也在增加，在添加量為1.8 g/L時(shí)，活性達(dá)到最高的461 U/mL，繼續(xù)增加牛肉膏的添加量，氨肽酶活性慢慢下降，表明過高濃度的氮源并不能一直提高米曲霉產(chǎn)氨肽酶的活性，因此本次實(shí)驗(yàn)選擇牛肉膏的添加量為1.8 g/L。

2.1.4 pH值對米曲霉產(chǎn)氨肽酶的影響

由圖5可知，隨著pH值的升高，米曲霉產(chǎn)氨肽酶的活性逐漸升高，在pH值為6.5時(shí)，氨肽酶活性達(dá)到最高的475 U/mL，隨后開始下降，原因可能是米曲霉為一種偏酸性的霉菌，其理想的生存環(huán)境的pH為3～7，其代謝環(huán)境與其生存環(huán)境基本相同，pH值大于其生存環(huán)境，會(huì)影響米曲霉的生長，進(jìn)而影響其產(chǎn)酶的代謝，因此確定本次實(shí)驗(yàn)的最佳pH值為6.5。

圖5 pH值對米曲霉產(chǎn)氨肽酶的影響Fig.5 Changes of aminopeptidase activity with pH values

2.1.5 溫度對米曲霉產(chǎn)氨肽酶的影響

圖6 溫度對米曲霉產(chǎn)氨肽酶的影響Fig.6 Changes of aminopeptidase activity with temperatures

由圖6可知，隨著溫度的升高，米曲霉產(chǎn)氨肽酶的活性逐漸升高，在36 ℃時(shí)達(dá)到最高的477 U/mL，隨后開始下降，因此確定本次實(shí)驗(yàn)的最佳溫度為36 ℃。

2.1.6 接種量對米曲霉產(chǎn)氨肽酶的影響

圖7 接種量對米曲霉產(chǎn)氨肽酶的影響Fig.7 Changes of aminopeptidase activity with inoculation amount

由圖7可知，隨著接種量的增加，米曲霉產(chǎn)氨肽酶的活性逐漸增加，在接種量為2.5%時(shí)，米曲霉產(chǎn)氨肽酶的活性達(dá)到最高的481 U/mL，隨后下降。原因是隨著接種量的增加，米曲霉菌落的數(shù)量逐漸增加，氨肽酶活性逐漸升高，但是隨著接種量繼續(xù)增加，由于營養(yǎng)物質(zhì)有限，米曲霉生長受到抑制，所產(chǎn)活性自然下降，因此本次實(shí)驗(yàn)選取接種量為2.5%。

2.1.7 轉(zhuǎn)速對米曲霉產(chǎn)氨肽酶的影響

圖8 轉(zhuǎn)速對米曲霉產(chǎn)氨肽酶的影響Fig.8 Changes of aminopeptidase activity with rotating speed

由圖8可知，米曲霉產(chǎn)氨肽酶的活性隨著轉(zhuǎn)速的變化呈波浪形變化，在180 r/min時(shí)，能獲得最大值,為481 U/mL，因此確定本次實(shí)驗(yàn)的最佳轉(zhuǎn)速為180 r/min。

2.2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)確定影響米曲霉產(chǎn)氨肽酶的顯著因素

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用軟件Minitab進(jìn)行Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過兩水平的實(shí)驗(yàn)方法，確定各因素對氨肽酶活性影響的順序，篩選出影響顯著的因素，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及結(jié)果見表1和表2。

表1 Placket-Burman實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 The factors and levels of Plackett-Burman experiment

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其響應(yīng)值Table 2 Plackett-Burman experimental design and response values

表3 各因素顯著性及其效應(yīng)值分析Table 3 The analysis of significance of each factor and its effect value

由表3可知，在各影響因素中，pH值、溫度、牛肉膏添加量、發(fā)酵時(shí)間對酶活為正效應(yīng)，轉(zhuǎn)速和接種量對酶活為負(fù)效應(yīng)，各因素對酶活影響的顯著性為pH值>溫度>牛肉膏添加量>接種量>發(fā)酵時(shí)間>轉(zhuǎn)速，根據(jù)對氨肽酶活性的顯著性關(guān)系，選取pH值、溫度、牛肉膏添加量這3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化。

2.3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)優(yōu)化氨肽酶液態(tài)發(fā)酵條件

在Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)原理，選取牛肉膏添加量、溫度和pH值為自變量，以氨肽酶活性為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平Box-Behnken實(shí)驗(yàn)，利用軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。各因素的編碼水平以及Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表4和表5。

表4 各變量的因素水平Table 4 The factors and levels of each variable

表5 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 5 Response surface experimental design and results

對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，得到3個(gè)變量(A,B,C)與氨肽酶活性(Y)的回歸關(guān)系式為Y=484.2+8.63A+6.63B+3.5C-3AB+9.75AC+3.75BC-16.35A2-43.35B2-29.6C2。

表6 回歸模型方差分析Table 6 The variance analysis of regression model

由表6可知，3個(gè)因素中pH值(P=0.0172<0.05)和溫度(P=0.0486<0.05)對氨肽酶活性的影響顯著，牛肉膏添加量(P=0.2483>0.05)對氨肽酶活性的影響不顯著。在交互項(xiàng)中，AC對氨肽酶活性的影響顯著，AB、BC對氨肽酶活性的影響不顯著，整體回歸模型的P值=0.0001<0.05，模型效果顯著，失擬項(xiàng)的P=0.0702>0.05，效果不顯著，表明模型沒有失擬現(xiàn)象，二次項(xiàng)的修正系數(shù)為R2=0.9379，表明該方程能在93%的水平上表示發(fā)酵產(chǎn)酶水平，模型可信度高。

pH值、溫度和牛肉膏添加量3個(gè)因素及其交互作用的產(chǎn)酶影響可以通過響應(yīng)曲面圖直觀反映出來，在各因素對酶活影響的兩兩交互作用中，各個(gè)組合中響應(yīng)值的最高點(diǎn)均落在實(shí)驗(yàn)的考察區(qū)域內(nèi)。

由回歸方程模型預(yù)測可知，當(dāng)pH值為6.645，溫度為36.28 ℃，牛肉膏添加量為1.844 g/L時(shí)，氨肽酶的預(yù)測值最高，可達(dá)Ymax=492.883 U/mL，考慮到實(shí)際培養(yǎng)條件和操作問題，選取pH為6.5，溫度為36 ℃，牛肉膏添加量為1.8 g/L進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，測得的最終氨肽酶活性為479.22 U/mL，與理論預(yù)測值相差2.3%，較未優(yōu)化前提高了298%。

圖9 溫度和pH值對氨肽酶活性影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.9 The response surface and contour plot of temperature and pH value on the activity of aminopeptidases

圖10 牛肉膏添加量和pH值對氨肽酶活性影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.10 The response surface and contour plot of beef extract additive amouat and pH value on theactivity of aminopeptidases

圖11 牛肉膏添加量和溫度對氨肽酶活性影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.11 The response surface and contour plot of beef extract and temperature on the activity of aminopeptidases

3 結(jié)論

在單因素研究的基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面研究的方法對米曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)氨肽酶活性的影響因素進(jìn)行探究。通過Minitab和Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果表明當(dāng)pH值為6.645，溫度為36.28 ℃，牛肉膏添加量為1.822 g/L時(shí)，預(yù)測酶活最高為485.883 U/mL，取pH值為6.6，溫度為36 ℃，牛肉膏添加量為1.82 g/L時(shí)，驗(yàn)證酶活為479.22 U/mL。為獲得酶制劑的制備及在發(fā)酵過程中的應(yīng)用提供了借鑒，對我國氨肽酶的國產(chǎn)化提供了理論支持，為食品發(fā)酵工業(yè)下腳料的高附加值轉(zhuǎn)化提供了理論支持。