蔣 鳴

(江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院，江蘇 鹽城 224500)

肉豆蔻是肉豆蔻科植物肉豆蔻 (MyristicafragransHoutt.)的成熟干燥種仁，又稱肉果、玉果，是一種藥理活性較強(qiáng)的食物，也是一種天然香料[1-2]。肉豆蔻性溫、味辛，可治療脾胃虛寒、久瀉不止，其揮發(fā)油也具有一定的藥理活性，近年來(lái)也受到了廣泛關(guān)注。然而，關(guān)于肉豆蔻揮發(fā)油的研究大多還是集中在揮發(fā)油組成成分上，只有較少數(shù)集中在其抑菌性、抗氧化性等性質(zhì)上，這限制了肉豆蔻揮發(fā)油的開發(fā)利用[3]。

食品原料在生產(chǎn)、運(yùn)輸、貯藏等過(guò)程中會(huì)被微生物污染，許多微生物會(huì)殘留在食品中，導(dǎo)致食品衛(wèi)生不合格甚至腐敗，對(duì)人們的身體健康造成了極大威脅。其中，金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、黃曲霉、釀酒酵母菌是引起食物腐敗的重要因素[4-5]。部分植物揮發(fā)油對(duì)微生物的抑制作用較好且安全性高，具有很大抑菌潛力，肉豆蔻揮發(fā)油就是其中一種。故本研究采用蒸餾法提取了肉豆蔻揮發(fā)油并對(duì)其抑菌作用進(jìn)行了初探，為進(jìn)一步利用肉豆蔻揮發(fā)油提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

肉豆蔻：購(gòu)于鹽城某藥材市場(chǎng)；石油醚、無(wú)水乙醚、無(wú)水硫酸鈉(分析純)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。菌種：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、釀酒酵母菌(Saccharmoycescerevisiae)、黃曲霉(Aspergillusflavus)；培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基(細(xì)菌使用)、YPD 培養(yǎng)基(真菌使用)。揮發(fā)油提取器 上海玻璃儀器廠；TG328A分析天平；BGZ-240電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海東星實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海青浦滬西儀器廠；BD240恒溫培養(yǎng)箱 德國(guó) Binder公司；752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司。

1.2 肉豆蔻預(yù)處理

將肉豆蔻置于表面皿中，在干燥箱中于60 ℃進(jìn)行烘干2 h取出，降至室溫后用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩，立即裝進(jìn)密封袋中以防吸水，儲(chǔ)存待用。

1.3 肉豆蔻揮發(fā)油提取

稱取肉豆蔻粉末50 g，置于1000 mL平底燒瓶中，加入適量的蒸餾水潤(rùn)濕，放置過(guò)夜，水蒸氣蒸餾4 h，收集餾出液，餾出液用石油醚(30～60 ℃)萃取3次，在萃取液中加入適量無(wú)水硫酸鈉低溫干燥24 h后過(guò)濾，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，使石油醚揮發(fā)，得到肉豆蔻揮發(fā)油。

1.4 菌懸液的制備

將活化后的金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌和釀酒酵母菌接種在LB培養(yǎng)基和YPD 培養(yǎng)基中，3種細(xì)菌在36 ℃培養(yǎng)24 h，2種真菌在28 ℃培養(yǎng)48 h。取各供試菌的菌懸液，用無(wú)菌蒸餾水稀釋合適倍數(shù)，通過(guò)平板計(jì)數(shù)法確定菌液濃度，使菌液濃度在107～108CFU/mL內(nèi)。在無(wú)菌培養(yǎng)基中滴入0.1 mL菌懸液，用無(wú)菌涂布環(huán)制成均勻的含菌平板，待用[6]。

1.5 供試品溶液的制備

以1%的吐溫80水溶液為溶劑，將1.3制備的肉豆蔻揮發(fā)油分別配制成2.0，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0，120.0，160.0 mL/L稀釋液[7]。

1.6 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

取各濃度供試品溶液10 mL，分別加入50 μL的菌懸液，緩慢搖勻制成肉豆蔻揮發(fā)油與菌懸液的混合液。移取0.2 mL該混合液于無(wú)菌平板中，用涂布環(huán)均勻涂布，倒置培養(yǎng)(3種細(xì)菌在36 ℃培養(yǎng)24 h，2種真菌在28 ℃培養(yǎng)48 h)。肉眼觀察平板，有菌體生長(zhǎng)為陽(yáng)性(+)，“+”越多表示菌體生長(zhǎng)越多；無(wú)菌體生長(zhǎng)為陰性(-)，找出未長(zhǎng)菌的最低濃度，即為最低抑菌濃度(MIC)，重復(fù)3次。

1.7 抑菌圈的測(cè)定

將1.3制備的肉豆蔻揮發(fā)油與無(wú)水乙醚按體積比為1∶1混合均勻得混合液，用無(wú)菌鑷子小心夾取滅菌的圓狀濾紙片(直徑d=0.5 cm)，浸入上述混合液中，20 min 后取出，晾干。將濾紙片貼在各供試菌平板上，每個(gè)平板貼3片，呈“品”字形。以無(wú)水乙醚作為空白對(duì)照，將平板倒置培養(yǎng)，分別在1，2，3，4，5，6 d后取出平板，測(cè)量抑菌圈直徑大小，取平均值。

1.8 對(duì)菌體生長(zhǎng)曲線的影響

采用比濁度法測(cè)定菌體生長(zhǎng)曲線，在分光光度計(jì)上測(cè)定菌懸液的吸光度值，通過(guò)吸光度來(lái)推算菌液的濃度。將1.3制備的肉豆蔻揮發(fā)油與無(wú)水乙醚混合，加入菌懸液，制成肉豆蔻揮發(fā)油濃度為0.5%和1%、含菌量為1×107CFU/mL的培養(yǎng)基；陰性對(duì)照為不含肉豆蔻揮發(fā)油、含菌量為1×107CFU/mL的培養(yǎng)基。將3種細(xì)菌培養(yǎng)基置于36 ℃，2種真菌培養(yǎng)基置于28 ℃，均以150 r/min的速度振蕩培養(yǎng)12 h，在此期間每1 h取一次樣，測(cè)定菌液在600 nm處的吸光度值并記錄。將時(shí)間作為橫坐標(biāo)，將讀取的吸光度平均值(n=3)作為縱坐標(biāo)，得供試菌體的生長(zhǎng)曲線[8]。

1.9 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 19.0軟件中的單因素方差分析法統(tǒng)計(jì)分析肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)不同種屬菌株抑菌活性的強(qiáng)弱，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 肉豆蔻揮發(fā)油的MIC

根據(jù)1.6的方法測(cè)定肉豆蔻揮發(fā)油的MIC，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)各菌種的MICTable 1 The MIC of nutmeg volatile oil on tested strains

由表1可知，肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)5種不同類型供試菌種均有一定的抑制作用[9]，且抑菌活性與肉豆蔻揮發(fā)油濃度基本呈正相關(guān)。當(dāng)肉豆蔻揮發(fā)油濃度相當(dāng)?shù)蜁r(shí)(2.0 mL/L)時(shí)，其對(duì)5種供試菌種均沒(méi)有明顯的抑制效果；當(dāng)濃度漸漸增大時(shí)，其開始對(duì)各菌種出現(xiàn)不同程度的抑菌作用，平板中菌體減少；當(dāng)其濃度較高時(shí)(160.0 mL/L)，對(duì)5種供試菌種均起到良好的抑制效果，平板中無(wú)菌體長(zhǎng)出。肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、黃曲霉和釀酒酵母菌的MIC分別是20.0，40.0，40.0，160.0，160.0 mL/L。總體來(lái)講，肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)細(xì)菌的抑菌活性高于真菌[10]。

2.2 肉豆蔻揮發(fā)油的抑菌圈結(jié)果

根據(jù)1.7的方法測(cè)定抑菌圈直徑，其中對(duì)無(wú)水乙醚空白對(duì)照組的抑菌圈進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)無(wú)抑菌圈，即抑菌圈直徑為0；肉豆蔻揮發(fā)油的抑菌圈直徑結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)各菌種的抑菌圈Table 2 The inhibitory zone of nutmeg volatile oil on tested strains

由表2可知，肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)5種不同類型供試菌種均有一定的抑制作用。肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)細(xì)菌的抑菌圈大于真菌，即對(duì)細(xì)菌的抑制效果好于真菌，該結(jié)果與2.1一致。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌圈直徑先增大后減小，5種供試菌的抑菌圈直徑均在第3天達(dá)到最大值，且與其他時(shí)間的抑菌圈直徑形成顯著性差異。根據(jù)研究結(jié)果[11-12]，抑菌圈直徑大于20 mm時(shí)為極敏；16～20 mm為高敏；11～15 mm為中敏；8～10 mm 為低敏；小于8 mm為不敏感。故肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌為極敏；對(duì)枯草桿菌為中敏；對(duì)大腸桿菌為高敏；對(duì)黃曲霉為低敏；對(duì)釀酒酵母菌為低敏[13]。肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)5種供試菌的抑菌效果為：金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>枯草桿菌>釀酒酵母菌>黃曲霉。

2.3 肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)菌體生長(zhǎng)曲線的影響

不同濃度肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.1 Effects of different concentration of nutmeg volatile oil on growth curve of Staphylococcus aureus

由圖1可知，金黃色葡萄球菌在經(jīng)過(guò)肉豆蔻揮發(fā)油處理后生長(zhǎng)曲線發(fā)生了非常明顯的變化，且1%肉豆蔻揮發(fā)油效果略好于0.5%肉豆蔻揮發(fā)油。在2 h后，金黃色葡萄球菌快速增長(zhǎng)，直至10 h時(shí)相對(duì)趨于穩(wěn)定；經(jīng)過(guò)肉豆蔻揮發(fā)油處理后，金黃色葡萄球菌增長(zhǎng)一直非常緩慢，抑制作用明顯。

不同濃度肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)枯草桿菌生長(zhǎng)曲線的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)枯草桿菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.2 Effects of different concentration of nutmeg volatile oil on growth curve of Bacillus subtilis

由圖2可知，枯草桿菌在經(jīng)過(guò)肉豆蔻揮發(fā)油處理后生長(zhǎng)曲線與陰性對(duì)照相比發(fā)生了明顯變化，且高濃度效果略好于低濃度。在1 h后，枯草桿菌快速增長(zhǎng)，直至8 h時(shí)相對(duì)趨于穩(wěn)定；經(jīng)過(guò)肉豆蔻揮發(fā)油處理后，枯草桿菌在6 h前緩慢增長(zhǎng)，6 h后菌體有所減少，抑制作用明顯。

不同濃度肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響見(jiàn)圖3。

圖3 不同濃度肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.3 Effects of different concentration of nutmeg volatile oil on growth curve of Escherichia coli

由圖3可知，大腸桿菌在經(jīng)過(guò)肉豆蔻揮發(fā)油處理后生長(zhǎng)曲線發(fā)生了明顯變化，抑菌效果仍與濃度成正比。在2 h后，大腸桿菌快速增長(zhǎng)；經(jīng)過(guò)肉豆蔻揮發(fā)油處理后，大腸桿菌增長(zhǎng)一直非常緩慢，有良好的抑制作用。

不同濃度肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)曲線的影響見(jiàn)圖4。

圖4 不同濃度肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)曲線的影響Fig.4 Effects of different concentration of nutmeg volatile oil on growth curve of Aspergillus flavuus

由圖4可知，黃曲霉在經(jīng)過(guò)肉豆蔻揮發(fā)油處理后生長(zhǎng)曲線發(fā)生了非常明顯的變化，且1%肉豆蔻揮發(fā)油效果略好于0.5%肉豆蔻揮發(fā)油。在2 h后，黃曲霉快速增長(zhǎng)，在7 h時(shí)相對(duì)趨于穩(wěn)定；經(jīng)過(guò)肉豆蔻揮發(fā)油處理后，黃曲霉在6 h前增長(zhǎng)一直非常緩慢，但在6 h后菌體生長(zhǎng)速度較快，在11 h后趨于穩(wěn)定[14]?？傮w來(lái)看，肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)黃曲霉的抑制作用差于上述3種細(xì)菌。

不同濃度肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)釀酒酵母菌生長(zhǎng)曲線的影響見(jiàn)圖5。

圖5 不同濃度肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)釀酒酵母菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.5 Effects of different concentration of nutmeg volatile oil on growth curve of Saccharmoyces cerevisiae

由圖5可知，釀酒酵母菌在經(jīng)過(guò)肉豆蔻揮發(fā)油處理后生長(zhǎng)曲線發(fā)生了非常明顯的變化，仍與濃度成正比。在2 h后，釀酒酵母菌快速增長(zhǎng)；經(jīng)過(guò)肉豆蔻揮發(fā)油處理后，釀酒酵母菌在5 h前增長(zhǎng)一直非常緩慢，但在5 h后菌體生長(zhǎng)速度較快，在11 h后又略有下降?？傮w來(lái)看，肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)釀酒酵母菌的抑制作用差于上述3種細(xì)菌，但略優(yōu)于黃曲霉。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)考察了肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、黃曲霉和釀酒酵母菌的抑菌活性。MIC結(jié)果表明肉豆蔻揮發(fā)油具有良好的抑菌活性，對(duì)5種供試菌的抑菌效果為金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>枯草桿菌>釀酒酵母菌>黃曲霉。故對(duì)于這5種供試菌來(lái)說(shuō)，肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)細(xì)菌的抑制效果優(yōu)于真菌。抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)5種供試菌的抑菌效果均為先增大后減小，在第3天達(dá)到最佳抑菌效果。生長(zhǎng)曲線結(jié)果表明肉豆蔻揮發(fā)油顯著改變了5種供試菌的生長(zhǎng)曲線，抑制了供試菌生長(zhǎng)和增殖，進(jìn)而發(fā)揮 了抑菌效果。研究結(jié)果為肉豆蔻揮發(fā)油的高值化利用以及其應(yīng)用范圍的擴(kuò)大提供了理論依據(jù)。