孫睿，張永涵，劉婧瑋,2，宋杰,2，郭秀蘭，Xu Changmou,3，鄒強(qiáng)*

(1.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，成都 610106；2.四川省輕工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，成都 610081；3.美國(guó)內(nèi)布拉斯加大學(xué)林肯分校，內(nèi)布拉斯加州 68588)

花椒是蕓香科植物青椒(ZanthoxylumschinifoliumSieb. et Zucc.)或花椒(Z.bungeanumMaxim.)的干燥成熟果實(shí)，是我國(guó)“八大調(diào)味料”之一，其味辛，性溫，歸脾、胃、腎經(jīng)?；ń酚盟帤v史悠久[1]，我國(guó)很多地區(qū)都可見(jiàn)花椒的身影，其中四川花椒的食用、藥用和栽培歷史都相當(dāng)悠久，共觀測(cè)到花椒種資源37個(gè)[2]，花椒產(chǎn)量約占全國(guó)總量的17.6%?；ń纷咽腔ń氛{(diào)味料的主要副產(chǎn)物，被大量浪費(fèi)?；ń纷阎胁伙柡椭舅岷扛哌_(dá)78.4%[3]。其中α-亞麻酸是人體必需的脂肪酸，不能自身合成，通常從食物中獲取[4]。α-亞麻酸具有促進(jìn)幼兒生長(zhǎng)和其他健康益處，比如它的抗凝血性能，能降低心臟方面問(wèn)題的風(fēng)險(xiǎn)[5-6]。

超臨界CO2萃取技術(shù)操作溫度低、選擇性好，且CO2具有無(wú)毒、價(jià)廉等特點(diǎn)，還能夠很好地保留花椒香料的天然香氣[7-8]。目前有多位學(xué)者以花椒籽為原料采用超臨界CO2萃取技術(shù)做出了許多探究，劉雄等[9]通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)研究表明超臨界CO2萃取花椒籽油的最佳條件為：原料粒度60目，萃取時(shí)間6 h，流量25 kg/h，溫度50 ℃，壓力45 MPa，此時(shí)花椒籽的出油率為93.63%。張淼等[10]研究表明正己烷結(jié)合超臨界CO2萃取花椒籽油最優(yōu)提取率為13.7%。劉通等[11]研究表明超臨界CO2萃取花椒籽油的最優(yōu)提取率下亞麻酸含量為39.2%。Devi等[12]研究了超臨界CO2萃取大麻籽中α-亞麻酸時(shí)各因素對(duì)萃取結(jié)果的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明原料粒徑越小，α-亞麻酸含量越高，隨著超臨界CO2溫度、壓強(qiáng)、CO2流速的升高與乙醇夾帶劑質(zhì)量的增多出現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。鮮少有人對(duì)花椒籽油的超臨界CO2萃取與其中α-亞麻酸相對(duì)含量工藝條件進(jìn)行同時(shí)優(yōu)化，本文采用響應(yīng)面法同時(shí)優(yōu)化花椒籽的超臨界CO2萃取和α-亞麻酸含量的工藝研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青花椒籽：由四川三臺(tái)圣菲倫食品公司提供；氫氧化鈉、氯化鈉：分析純；三氟化硼-甲醇溶液(濃度為15%)、正庚烷、甲醇：均為色譜純；氣體：CO2純度大于99.9%。

1.2 儀器設(shè)備

HA221-40-11型超臨界CO2萃取裝置 南通市華安超臨界萃取有限公司；7890B型氣相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司；DZF-6020型真空干燥箱、SECURA213-1CN型電子天平、高速萬(wàn)能粉碎機(jī)、電熱恒溫水浴鍋。

1.3 超臨界CO2萃取方法

取適量花椒籽于干燥箱中60 ℃烘3 h，粉碎過(guò)篩(20目)后備用。每次試驗(yàn)時(shí)準(zhǔn)確稱取花椒籽粉末200 g于超臨界萃取釜內(nèi)，通過(guò)改變萃取溫度、時(shí)間和壓力來(lái)進(jìn)行超臨界CO2萃取。其中CO2流量在壓力穩(wěn)定的情況下恒定不變。萃取結(jié)束后將花椒籽油稱重，并用GB5009.168-2016中第三法(歸一化法)來(lái)測(cè)定其中α-亞麻酸的相對(duì)含量?；ń酚偷牡寐拾凑障率接?jì)算：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 壓力對(duì)萃取效果的影響

在溫度為50 ℃，萃取時(shí)間為90 min時(shí)，通過(guò)設(shè)定不同的壓力來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)，探討壓力對(duì)萃取結(jié)果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 萃取壓力對(duì)萃取結(jié)果的影響Fig.1 The effect of extraction pressure on the extraction results

由圖1可知，花椒籽的提油率和α-亞麻酸含量隨著壓力的升高而逐漸增加。初始時(shí)，花椒籽油脂在CO2中溶解的不多。隨著壓力的增加，油脂更多地溶解在CO2中。這是因?yàn)楫?dāng)溫度一定時(shí)，隨著壓力的增大，超臨界CO2的密度也會(huì)相應(yīng)增大，從而使得花椒籽油在CO2中的溶解度增加，出油率和α-亞麻酸含量隨壓力升高而增加。當(dāng)壓力達(dá)到一定值后，對(duì)CO2的溶解度影響變小，所以提油率和α-亞麻酸含量會(huì)變平穩(wěn)。此儀器最高壓力要低于40 MPa，壓力升高，對(duì)儀器設(shè)備要求會(huì)更高，安全隱患會(huì)更大。綜合考慮，確定3個(gè)壓力水平為25，30，35 MPa。

2.1.2 溫度對(duì)萃取效果的影響

在壓力為30 MPa，萃取時(shí)間為90 min時(shí)，通過(guò)設(shè)定不同的溫度來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)，探討溫度對(duì)萃取結(jié)果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 萃取溫度對(duì)萃取結(jié)果的影響Fig.2 The effect of extraction temperature on the extraction results

由圖2可知，隨著溫度的升高，加快了油溶于CO2中，分子作用力加快，所以此時(shí)出油率和α-亞麻酸含量隨溫度升高而增加；而在后期，隨著溫度的升高反而降低了溶劑的CO2密度，從而降低了溶解在超臨界CO2中的溶質(zhì)，因此隨溫度升高而降低。由此確定3個(gè)溫度水平為45，50，55 ℃。

2.1.3 時(shí)間對(duì)萃取效果的影響

在壓力為30 MPa，溫度為50 ℃時(shí)，通過(guò)設(shè)定不同的時(shí)間來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)，探討時(shí)間對(duì)萃取結(jié)果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 萃取時(shí)間對(duì)萃取結(jié)果的影響Fig.3 The effect of extraction time on the extraction results

由圖3可知，隨著時(shí)間的增加，提油率和α-亞麻酸含量會(huì)隨之增加，而在達(dá)到90 min后已無(wú)太大變化。因此確定3個(gè)時(shí)間為60，90，120 min。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)上面單因素試驗(yàn)結(jié)果，以萃取壓力、溫度、時(shí)間3個(gè)因素為自變量，以花椒籽油的得率和α-亞麻酸的含量為響應(yīng)值，每個(gè)取3個(gè)水平并編碼-1，0，1，并根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選定3個(gè)因素的零水平和波動(dòng)區(qū), 采用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的水平編碼見(jiàn)表1，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2～表4。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 The factors and levels of response surface test

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 2 The results of response surface experimental design

續(xù) 表

根據(jù)表2設(shè)計(jì)水平，采用Design-Expert軟件對(duì)提油率和α-亞麻酸含量進(jìn)行擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程，提油率：Y1=+12.45-0.31A+0.55B+0.10C+0.011AB-0.16AC-0.043BC-1.55A2-0.97B2-0.39C2；α-亞麻酸含量：Y2=+4.52+0.22A-0.15B+0.011C-0.23AB-0.31AC-0.010BC-0.57A2-0.35B2-0.72C2。

表3 提油率回歸方程方差分析表Table 3 The regression equation anova table of oil extraction rate

表4 α-亞麻酸含量回歸方程方差分析表Table 4 The regression equation anova table of α-linolenic acid content

續(xù) 表

由表3中F值可知，提油率的影響因素由大到小為：萃取溫度B>萃取壓力A>萃取時(shí)間C；由表4中F值可知，花椒籽油中α-亞麻酸含量的影響因素由大到小為：萃取壓力A>萃取溫度B>萃取時(shí)間C。

由表3和表4可知，表3中的P值<0.0001，表4中的P值為0.0003，說(shuō)明該模型極顯著；失擬項(xiàng)分別0.1116和0.1895，均大于0.05，表明兩個(gè)模型失擬項(xiàng)不顯著，擬合程度較好。兩個(gè)模型的決定系數(shù)(R2)分別為0.9872和0.9651，說(shuō)明方程的回歸效果好，調(diào)整確定系數(shù)(RAdj2)分別為0.9707和0.9202，說(shuō)明兩個(gè)模型可信度高，試驗(yàn)誤差較小，能較好地預(yù)測(cè)花椒籽的提油率和油中α-亞麻酸含量隨著壓力等因素變化的規(guī)律。

2.3 響應(yīng)面結(jié)果分析

將模型其中一個(gè)影響因素固定為0，繪制其余兩個(gè)因素對(duì)花椒籽的提油率以及α-亞麻酸含量影響的等高線圖及響應(yīng)曲面，見(jiàn)圖4和圖5。

a.萃取壓力和溫度

b.萃取壓力和時(shí)間

c.萃取溫度與時(shí)間

a.萃取壓力與溫度

b.萃取壓力與時(shí)間

c.萃取溫度與時(shí)間

根據(jù)圖4響應(yīng)面及圖中等高線圖的形狀分析萃取壓力、溫度、時(shí)間3個(gè)因素對(duì)花椒籽提油率的影響。等高線的形狀反映交互作用的強(qiáng)弱，圓形表示兩個(gè)因素之間交互作用比較弱，而橢圓形則表示兩個(gè)因素之間交互作用較強(qiáng)，由圖4中a和b可知，因素A和B、A和C的交互作用較弱，由圖4中c可知，因素B和C的交互作用較強(qiáng)。由圖4中a可知，在時(shí)間為90 min時(shí)，隨著萃取壓力和溫度的提升，花椒籽的提油率有著先增大后減小的趨勢(shì)。在壓力為27.2～32.1 MPa，萃取溫度48.5～53.4 ℃時(shí)，提油率在較高范圍內(nèi)。由圖4中b可知，在溫度為50 ℃時(shí)，隨著萃取壓力和時(shí)間的增加，提油率先增大后減小。在壓力為28.5～31.5 MPa，萃取時(shí)間為75～114 min時(shí)，提油率較高。由圖4中c可知，在壓力為30 MPa時(shí)，隨著萃取溫度和時(shí)間的提高，提油率也呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。在溫度為50.5～52.5 ℃，萃取時(shí)間為84～102 min時(shí)，提油率達(dá)到較高水平。

根據(jù)圖5響應(yīng)面及圖中等高線圖的形狀分析萃取壓力、溫度、時(shí)間3個(gè)因素對(duì)花椒籽α-亞麻酸含量的影響。由圖5中b和c可知，因素A和C、B和C的交互作用較強(qiáng)，由圖5中a可知，因素A和B的交互作用較弱。由圖5中a可知，在時(shí)間為90 min時(shí)，隨著萃取壓力和溫度的提升，花椒籽的α-亞麻酸含量有著先增大后減小的趨勢(shì)，溫度對(duì)其影響更大，表現(xiàn)在響應(yīng)面曲面更陡。在萃取溫度為45～51.2 ℃，壓力為29～34.2 MPa時(shí)，α-亞麻酸含量處于較高水平。由圖5中b可知，在溫度為50 ℃時(shí)，隨著萃取壓力和時(shí)間的增加，α-亞麻酸含量先增大后減小。在壓力為29～32.5 MPa，萃取時(shí)間為78～96 min時(shí)，α-亞麻酸含量處于較高水平。由圖5中c可知，在壓力為30 MPa時(shí)，隨著萃取溫度和時(shí)間的提高，α-亞麻酸含量也呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。在溫度為46～52.1 ℃，萃取時(shí)間為78～102 min時(shí)，α-亞麻酸含量在較高范圍內(nèi)。

對(duì)軟件進(jìn)一步分析，提油率的最佳條件為：壓力為32.58 MPa，溫度為51.55 ℃，時(shí)間為90.19 min；α-亞麻酸含量的最佳條件為：壓力為34.89 MPa，溫度為47.49 ℃，時(shí)間為85.03 min。

經(jīng)過(guò)對(duì)回歸模型的數(shù)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)要得到最佳提油率與α-亞麻酸含量的條件并不完全相同，說(shuō)明兩個(gè)響應(yīng)值(Y1與Y2)相互制約[13]。通過(guò)上面對(duì)兩個(gè)模型的響應(yīng)曲面與等高線分析以及各因素對(duì)響應(yīng)值的影響順序，選擇最佳工藝條件為：萃取壓力30.3 MPa，萃取溫度51.2 ℃，萃取時(shí)間89.6 min，提油率預(yù)測(cè)值為12.50%，α-亞麻酸含量的預(yù)測(cè)值為4.48%。

3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)分析結(jié)果，將試驗(yàn)條件稍作修改以方便進(jìn)行。壓力調(diào)整為30 MPa，溫度為51 ℃，時(shí)間為90 min。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的提油率平均為12.52%，此時(shí)α-亞麻酸含量平均為4.45%。從本試驗(yàn)可以看出花椒籽提油率和α-亞麻酸含量采用響應(yīng)面同步優(yōu)化法進(jìn)行模擬，其數(shù)學(xué)回歸模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值非常接近，偏差較小，說(shuō)明該回歸模型具有可靠性。

本試驗(yàn)提取的花椒籽油提油率與α-亞麻酸含量等與其他學(xué)者研究的花椒籽油有所差異，可能是與花椒籽的品種、采摘后續(xù)處理技術(shù)等不同有關(guān)[14-15]。

花椒籽油脂肪酸氣相色譜圖見(jiàn)圖6，花椒籽油脂肪酸組成見(jiàn)表5。

圖6 花椒籽油脂肪酸氣相色譜圖Fig.6 Gas chromatogram of fatty acids of Zanthoxylum bungeanum seed oil

表5 花椒籽油脂肪酸組成Table 5 The fatty acid composition of Zanthoxylum bungeanum seed oil

4 結(jié)論

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以提油率與α-亞麻酸含量分別為兩個(gè)自變量，確定了壓力、溫度與時(shí)間3個(gè)因素的3個(gè)水平，用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)模型擬合，得到花椒籽提油率影響因素由大到小為：萃取溫度>萃取壓力>萃取時(shí)間；α-亞麻酸含量影響因素由大到小為：萃取壓力>萃取溫度>萃取時(shí)間；進(jìn)一步優(yōu)化得到試驗(yàn)最佳條件：壓力30 MPa，溫度51 ℃，時(shí)間90 min，在此最佳優(yōu)化條件下，花椒籽的提油率為12.52%，α-亞麻酸含量為4.45%。