蔡惠鈿，張逸

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣州 510642；2.華農(nóng)(潮州)食品研究院有限公司，廣東 潮州 521000)

無花果是?？崎艑匍_花植物，產(chǎn)于地中海沿岸，屬亞熱帶落葉小喬木。近些年來，由于其廣泛的觀賞、食用價值，得到了大力培育和利用。

以無花果為原料的保健品食品不僅營養(yǎng)價值豐富，而且風(fēng)味更加美味，相關(guān)的工藝技術(shù)研究多有報道。胡艦等[1]采用響應(yīng)面法優(yōu)化了無花果復(fù)配生姜汁嫩化獅子頭的工藝。譚海剛等[2]利用無花果進行果醋釀造，研究了無花果果醋的最佳釀造工藝。無花果中包含大量營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、礦物質(zhì)、維生素等，可以在分離純化中保留下來，提高了無花果的利用效率。從王宇晴等[3]應(yīng)用快速溶劑萃取法提取靈芝多糖的研究中可以看出，多糖分離純化與溫度密切相關(guān)，無花果作為一種保健型調(diào)味品，其多糖分離純化最佳溫度也是固定的，因其味道淡雅，已經(jīng)得到廣大消費者喜愛。

目前，國內(nèi)無花果多糖分離純化研究大多停留在實驗階段，其以生產(chǎn)工藝優(yōu)化為主，各類產(chǎn)品繁多，應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)較少。國外無花果多糖分離純化研究主要是酵母菌研究，工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模較小，使用儀器分析方法測定的抗氧化活性結(jié)果并不具有代表性，實際應(yīng)用價值較低。因此，為了豐富無花果市場，研究無花果多糖的分離純化工藝及其抗氧化性能，對指導(dǎo)人們合理飲食，提高人體抗病能力，促進人體健康具有重要意義。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

無花果：由山東濱州永大三合無花果開發(fā)有限公司提供，品種為紫果，經(jīng)過壓榨后獲取無花果殘渣，在50 ℃條件下烘干無花果汁，粉碎后使用20目篩選備用。

試劑：濃硫酸，來自祁縣匯鴻源化工公司；無水乙醇，來自濟南雙盈化工有限公司；石油醚，來自江蘇省海安石油化工廠；氯仿，來自魯西化工集團股份有限公司；正丁醇，來自山東諾爾化工有限公司；丙酮，來自南京建滿化工有限公司；NaCl，來自無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；NaOH，來自臨沂多彩化工有限公司；HCl，來自德州潤昕實驗儀器有限公司。

用水：由東莞市佰純水處理設(shè)備有限公司生產(chǎn)的蒸餾水。

1.2 設(shè)備

高效液相系統(tǒng) 深圳市寶安區(qū)松崗天瑞環(huán)保設(shè)備廠；電子分析天平 河南省泰斯特儀器有限公司；蒸發(fā)儀 鞏義市宇翔儀器有限公司；真空泵 深圳市煒圣鈦電子有限公司；水浴鍋 泰州市誠倍教學(xué)設(shè)備有限公司；超濾系統(tǒng) 東莞市綠城水處理設(shè)備有限公司；冷凍干燥機 江西南翔空壓機有限公司。

2 試驗方法

2.1 無花果多糖提取

從山東濱州永大三合無花果開發(fā)有限公司隨機選取無花果，粉碎后得到50 g無花果渣。對無花果的干燥處理步驟如下：

檢查無花果，盡可能確保無花果都沒有傷痕，并且表面無其他物質(zhì)，并在干燥之前清洗無花果[4-6]。用木錘或者普通的搟面杖敲擊無花果，并盡可能保持完整，既不要搗成泥狀或碎成很多塊，也不要破壞它的果核，讓它的果肉裂開[7-9]。然后將無花果浸入冷水中，需要完全淹沒，確保沒有露出來的[10-11]。這時可以用平底鍋或其他比較重的東西將浮上來的壓下去，之后使其中的水結(jié)成冰，然后降壓，冰就會直接升華為水蒸氣，從食品中逸出[12]。

經(jīng)過干燥處理后，再用石油醚脫脂3次。之后向其中加入500 mL蒸餾水，在100 ℃溫度下萃取3 h，過濾，再萃取濾渣，合并為濾液[13]。經(jīng)濃縮至1/4的原體積后，需將濃縮后濾液中的蛋白質(zhì)去除。在6次去蛋白后，緩慢加入4倍體積的由濟南雙盈化工有限公司生產(chǎn)的無水乙醇進行濾液沉淀，離心12 h后在4 ℃溫度下采集沉淀物，由此獲得無花果粗多糖[14]。

采用分子量為10 kDa的扁平纖維素超濾膜，將無花果多糖溶于水中進行超濾[15]。在60 ℃以下，采集分子量大于10 kDa的部分濃縮成1/4的原體積。慢慢加入無水乙醇，攪拌，在75%的濃度下，靜置12 h，在3000 r/min的條件下離心，然后用無水乙醇和丙酮進行沉淀，冷凍干燥，由此獲取無花果多糖。

2.2 無花果多糖理化性質(zhì)分析

2.2.1 多糖測定

將100 mg粗多糖樣品準(zhǔn)確稱量，制成10 mL的水溶液。粗多糖的吸光度與粗多糖樣品的吸光度基本一致，其含量按標(biāo)準(zhǔn)方程計算[16]。多糖測定公式：

(1)

2.2.2 理化性質(zhì)

經(jīng)水提醇沉淀，去蛋白，除去小分子雜質(zhì)，冷凍干燥后得到無花果多糖。表面呈淡灰色，無臭，易溶于水， pH值4.2，難溶于甲醇、乙醇、丙酮、醚等有機溶劑中。

碘-碘化鉀反應(yīng)為陰性，表明經(jīng)水提醇后的無花果不含淀粉；茚三酮反應(yīng)為陰性，表明產(chǎn)品無花果中不含有蛋白質(zhì)； UV光譜分析表明無花果多糖在260，280 nm時，沒有特征表示明顯吸收蛋白質(zhì)和核酸；在192 nm時，有一個吸收峰，表示糖的特征性吸收峰，見圖1。

圖1 無花果多糖的紫外光譜Fig.1 UV spectra of fig polysaccharides

無花果的陽性結(jié)果是含糖的，由多糖測定公式計算得到無花果多糖得率，采用苯酚-硫酸法測定總糖含量。在濃硫酸條件下，多糖經(jīng)水解轉(zhuǎn)化為單糖脫水。假如無花果試樣中含有0.1 mol三糖、0.1 mol二糖和0.1 mol單糖，經(jīng)硫酸處理后可轉(zhuǎn)化為0.6 mol脫水單糖。再加入酚類物質(zhì)，酚類物質(zhì)與脫水的單糖形成彩色化合物，利用吸收光度法測定處理液中單糖含量。由此可知，苯酚-硫酸法實際測定的是總糖。

2.3 去除多糖中的色素

試驗選取了S-8、NKA-9為極性樹脂，AB-8、D-101為弱極性樹脂，D3520為中極性樹脂，X-5為非極性樹脂。

從測定結(jié)果的對比中可以看出，考慮了極性和分子量，AB-8樹脂對一般顏料和有機物質(zhì)都有一定的吸附特性，并且有一定的孔徑，比表面積大，比重大，純化后的多糖回收率較高。綜合考慮各種因素，確定高純度的AB-8型樹脂為最佳純化樹脂，不同孔徑樹脂對多糖純度和回收率分析情況見表1。

表1 不同孔徑樹脂對多糖純度和回收率分析情況Table 1 Analysis of polysaccharide purity and recovery rate by resins with different pore sizes

由表1可知，使用AB-8樹脂，無花果多糖純度達到最高，為75%；使用AB-8樹脂和NKA-9樹脂，多糖回收率達到最高，為70%。因此，選用AB-8樹脂去除多糖中的色素效果最好。

2.4 去除蛋白質(zhì)

無花果蛋白組分多糖的提取采用傳統(tǒng)的 Sevag法和3%三氯乙酸法，而苯酚-硫酸法用于測定多糖含量，而雙縮脲法用于測定蛋白質(zhì)含量。不同方法除蛋白質(zhì)成分比較見表2。

表2 不同方法除蛋白質(zhì)成分比較Table 2 Comparison of protein components removed by different methods

由表2可知，使用 Sevag法和3%三氯乙酸法多糖損失率相差3%，其中Sevag法多糖損失率較高；而3%三氯乙酸法去除率較高，同樣比Sevag法高3%。但是，使用3%三氯乙酸法易潮解，溶于水、乙醇、乙醚，試驗更加方便。

2.5 NaCl洗脫

鹽對多糖的純化效果較差，但加入鹽可增加樹脂對雜質(zhì)的吸附性，但濃度不能過高，否則會給以后透析帶來較大影響。NaCl是一種白色晶體粉末，溶于丁烷后變成等離子體，該物質(zhì)易溶于水，在酒精中分散的 NaCl能形成膠體。氯化氫的存在使其在水中的溶解度下降，在濃鹽酸中幾乎不溶，不易溶于乙醚。

基于此，不同濃度NaCl對多糖純化的影響分析見圖2。

圖2 不同濃度NaCl對多糖純化影響分析Fig.2 Analysis of the influence of NaCl with different concentration on the purification of polysaccharides

由圖2可知，當(dāng)NaCl濃度為0.01，0.05 mg/mL時，無花果多糖純度在60%以下；而當(dāng)NaCl濃度為0.02，0.03，0.04 mg/mL時，無花果多糖純度在60%以上，且當(dāng)NaCl濃度為0.03 mg/mL時，無花果多糖純度最高，為76%，經(jīng)綜合考慮，最終選用0.03 mg/mL的NaCl溶液。

2.6 無花果多糖的分離純化

因為無花果是多糖的混合物，為了得到均勻的成分，用AB-8型離子交換樹脂進行分離，無花果用0.03 mg/mL的NaCl溶液進行梯度洗脫。再用苯酚-硫酸法測定無花果洗脫液中多糖，AB-8柱層析色譜圖見圖3。

圖3 AB-8柱層析色譜圖Fig.3 AB-8 column chromatography

由圖3可知，在管數(shù)分別為10～20，20～30，30～40，40～50時出現(xiàn)多糖餾分，選用0.03 mg/mL NaCl溶液進行梯度洗脫，在管數(shù)為10～20，30～40時出現(xiàn)脫峰，說明這兩個時期無花果多糖的分離純化效果較好。

3 抗氧化性能試驗結(jié)果與分析

3.1 清除超氧陰離子自由基

超氧自由基是一種常見的自由基，其氧化能力很強。超氧陰離子自由基的清除量是測定抗氧化活性時常用的一項重要指標(biāo)。

通過周期性的介孔硅膠與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸相互作用產(chǎn)生超氧陰離子， 硝基四氮唑藍通過還原作用產(chǎn)生最大吸收量。在該吸收條件下，研究超氧陰離子去除率的吸收變化，吸收度值越小，清除率越高。超氧陰離子的清除活性見圖4。

圖4 超氧陰離子的清除活性分析Fig.4 Analysis of scavenging activity of superoxide anions

由圖4可知，隨著濃度增加，超氧陰離子的清除效率也隨之增加，當(dāng)濃度為500 μg/mL時，清除效率達到最低，為50%；當(dāng)濃度為2500 μg/mL時，清除效率達到最高，為75%。根據(jù)分析結(jié)果，無花果清除超氧陰離子效率最高為75%。

3.2 清除羥基自由基

羥基自由基·OH 是一種非?；钴S的活性氧，有很強的氧化能力。由于鄰二氮菲-Fe2+溶液反應(yīng)生成的羥基自由基·OH在空氣中被氧化成鄰二氮菲-Fe3+，此時溶液呈橙紅色。隨著溶液不斷反應(yīng)，最大吸收峰消失，此時可以在溶液中繼續(xù)添加鄰二氮菲-Fe2+，通過褪色程度來衡量羥基自由基·OH的清除效果。

配制不同濃度的無花果，測定其對羥基自由基·OH的清除率，結(jié)果見圖5。

圖5 羥基自由基·OH的清除率Fig.5 The scavenging rate of hydroxyl radicals

由圖5可知，無花果多糖在處理過程中存在一定清除羥基自由基·OH能力，隨著溶液濃度增加，清除率逐漸增強，根據(jù)分析結(jié)果可知，無花果多糖清除羥基自由基的最高效率為38%。

3.3 還原能力測試

抗氧化劑提供電子，以自身的還原作用清除羥基自由基·OH。還原力越強，抗氧化能力越強；在鐵氰化鉀體系中，F(xiàn)e3+在抗氧化劑促進下被還原為Fe2+，F(xiàn)e2+在AB-8柱層析色譜圖中被發(fā)現(xiàn)。吸收度值越大，還原性越強。無花果多糖的還原能力測定結(jié)果見圖6。

圖6 無花果多糖的還原能力測定結(jié)果Fig.6 Determination results of reducing capacityof fig polysaccharides

由圖6可知，無花果多糖圖像顯示了一定的還原能力，并且隨濃度的增加逐漸增強。在1000 μg/mL濃度下，還原量最大，吸光度在0.05左右，達到最高。

3.4 試驗結(jié)論

無花果中多糖組分還原能力與單糖還原端暴露量有關(guān)，如果純化單糖的還原端組分未暴露，那么將直接影響其還原效果。無花果多糖還具有還原鐵離子作用，隨著無花果溶液濃度增加，還原程度越高，并且抑制羥基自由基·OH無規(guī)則轉(zhuǎn)移，保障羥基自由基·OH能夠轉(zhuǎn)變?yōu)楦臃€(wěn)定的產(chǎn)物，使無花果在反應(yīng)過程中自動終止羥基自由基·OH一系列的反應(yīng)。

通過上述測試內(nèi)容可知，當(dāng)濃度為2500 μg/mL時，無花果多糖清除超氧陰離子效率最高為75%。當(dāng)濃度為2500 μg/mL時，無花果多糖清除羥基自由基的最高效率為38%。在1000 μg/mL濃度下，還原量最大，吸光度在0.05左右，達到最高。說明純化后的無花果多糖抗氧化活性明顯強于未純化的無花果。原因在于多糖的活性與分子量、溶解性、黏度和結(jié)構(gòu)有關(guān)，多糖類分子量越大，越不利于跨膜行動，多糖分子進入生物體進行生物活動的可能性就越低。小分子多糖更容易結(jié)合，而過低的活性位點和過低的分子量會阻礙活性聚合結(jié)構(gòu)的形成，相對分子質(zhì)量適宜的多糖活性高。

4 結(jié)束語

無花果的營養(yǎng)價值很高，多糖是無花果果實的主要活性成分。無花果多糖的提取、分離純化方法隨著科學(xué)技術(shù)的進步也在不斷更新。相信在未來無花果多糖生產(chǎn)中將出現(xiàn)更加高效、環(huán)保的新技術(shù)。

試驗結(jié)果表明，粗多糖具有很強的清除超氧陰離子自由基的能力，還具有很強的還原能力，由此說明無花果具有很強的抗氧化能力。但是，該試驗只對其體外抗氧化作用進行了部分研究。接下來可通過在其他物質(zhì)上試驗來研究其在有機體內(nèi)清除自由基的效果。