徐勝男, 林東強(qiáng), 田 兵, 姚善涇
(1.浙江大學(xué)生物質(zhì)化工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院, 浙江 杭州 310027;2. 教育部生物系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 杭州 310027)
蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)是研究生物大分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的科學(xué)依據(jù),測(cè)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的主要實(shí)驗(yàn)方法有X 射線衍射、低溫冷凍電鏡和二維核磁共振。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中90% 的結(jié)構(gòu)均來(lái)自X 射線衍射,是獲得蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)最常用、最準(zhǔn)確的方法[1]。但目前僅少部分蛋白質(zhì)可以形成符合衍射要求的單晶,因此獲得符合衍射要求的蛋白質(zhì)晶體成為解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的瓶頸問(wèn)題[2-3]。致力于闡明蛋白質(zhì)結(jié)晶機(jī)制的大多數(shù)研究均是使用溶菌酶進(jìn)行,這是由于其易于獲得、易于儲(chǔ)存、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,在很寬的條件范圍內(nèi)可以獲得大晶體[3-4]。溶菌酶廣泛存在于人、動(dòng)物、植物的組織及微生物細(xì)胞,主要分為C 型(雞)、G 型(鵝)、細(xì)菌型和噬菌體型[5],不同物種來(lái)源的溶菌酶氨基酸數(shù)量、氨基酸組成、等電點(diǎn)和三維結(jié)構(gòu)等都存在差異,因此,不同物種溶菌酶的結(jié)晶條件也會(huì)有顯著的不同[6]。盡管在蛋白質(zhì)結(jié)晶領(lǐng)域有許多研究和實(shí)驗(yàn)進(jìn)展[7-8],但仍然沒(méi)有清晰的模型來(lái)解釋蛋白質(zhì)結(jié)晶各個(gè)階段的機(jī)理,因此,需要投入大量的時(shí)間和樣品量,通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)來(lái)優(yōu)化結(jié)晶條件[9]。
通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的研究,將增強(qiáng)對(duì)潛在晶體形成的預(yù)測(cè)。許多實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)溶解度研究來(lái)探究結(jié)晶機(jī)理[10-11]。1991 年,Ries-Kautt 等[12]得到了不同條件下雞蛋清溶菌酶的溶解度曲線,但不同物種的溶菌酶溶解度曲線并不一致。蛋白質(zhì)晶體的質(zhì)量取決于許多參數(shù),如溫度、pH 值、沉淀劑、蛋白質(zhì)種類(lèi)、蛋白質(zhì)初始濃度、生長(zhǎng)方法、蒸發(fā)速率等[7]。大量文獻(xiàn)報(bào)道了溶菌酶結(jié)晶條件的相關(guān)研究[9,13],溶菌酶具有很強(qiáng)的溫度依賴(lài)性,溫度是最常用于改變晶體生長(zhǎng)的參數(shù)之一[14];溶液的 pH 值會(huì)影響蛋白質(zhì)表面凈電荷的數(shù)量,從而影響溶菌酶結(jié)晶成核的速率[15-16];沉淀劑是溶菌酶結(jié)晶的另一個(gè)重要因素[15],通過(guò)添加沉淀劑,顆粒之間的相互作用從排斥性變?yōu)槲?,不同沉淀劑的相互作用力不同[17-18];蛋白質(zhì)初始濃度影響著結(jié)晶液滴的過(guò)飽和度,過(guò)飽和度的大小影響晶核形成的數(shù)量與質(zhì)量[19]。
為了建立高效的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法,本文以雞蛋清溶菌酶、芽孢桿菌溶菌酶和人源溶菌酶3 種不同物種來(lái)源的溶菌酶為研究對(duì)象,采用氣相擴(kuò)散座滴法,探究溶菌酶初始濃度、溫度、pH 值和沉淀劑對(duì)這3種溶菌酶結(jié)晶的影響,優(yōu)化溶菌酶結(jié)晶條件,提高結(jié)晶效率,為深入研究蛋白質(zhì)結(jié)晶的方法和拓展蛋白質(zhì)結(jié)晶的應(yīng)用提供依據(jù)。
本文使用了3 種不同來(lái)源的溶菌酶,分別是人源溶菌酶,購(gòu)自武漢中昌國(guó)研標(biāo)物科技有限公司;芽孢桿菌溶菌酶,購(gòu)自北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司;雞蛋清溶菌酶,購(gòu)自生物工程(上海)股份有限公司,以上3 種溶菌酶純度均大于95%。3 種溶菌酶的相關(guān)信息列于表1 中。
表1 3 種物種來(lái)源的溶菌酶的氨基酸序列Table 1 Amino acid sequences of lysozymes from three species
由表 1 可知,3 種不同物種來(lái)源的溶菌酶氨基酸序列和氨基酸數(shù)量存在差異。雞蛋清溶菌酶由 129個(gè)氨基酸組成,等電點(diǎn)pH 在10.8 左右,最適pH 為6.2,相對(duì)分子量為14 kDa,主要由4 個(gè)二硫鍵、氫鍵以及疏水鍵等維持其穩(wěn)定性結(jié)構(gòu);芽孢桿菌溶菌酶由143 個(gè)氨基酸組成,最適pH 為8.0,相對(duì)分子量為16.0 kDa;人源溶菌酶由130 個(gè)氨基酸組成,最適pH 為6.5,相對(duì)分子量為14.72 kDa,由于Lys108的取代,不具有其他兩種溶菌酶所具有的二聚體結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)糖基化活性。3 種溶菌酶的催化殘基都是天冬氨酸和谷氨酸,處于保守區(qū)域,但位置存在差異。不同物種來(lái)源的溶菌酶酶活也不相同,人源溶菌酶最高,約為雞蛋清溶菌酶的3 倍[20-22]。
Thermo Shaker,型號(hào)MSC-100;eppendorf 小型高速離心機(jī),型號(hào)Centrifuge 5415R;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),日本島津公司產(chǎn)品,型號(hào)UV-1800;96 和48 條件雙孔座滴晶體培養(yǎng)板,均購(gòu)自博亞捷晶科技(北京)有限公司;Bio Tiss 微孔板封板膜,購(gòu)自云城辦公專(zhuān)營(yíng)店;晶體篩選劑Crystal Screen HR2-110、Index HR2-144、晶體染色液Izit crystal dye,購(gòu)自美國(guó)Hampton Research 公司;Nikon 光學(xué)顯微鏡,型號(hào)ECLIPSE E200,放大倍數(shù)80×;I-cube 培養(yǎng)箱,產(chǎn)自日本亞速旺公司,型號(hào)FCI-280。
2.3.1 溶菌酶的溶解度
溶解度是指可溶性蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)的百分比,蛋白質(zhì)分散指數(shù)(protein dispersibility index,PDI)為蛋白質(zhì)溶解度的常用表示方法之一,指水分散蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)的百分比,蛋白質(zhì)樣品體積和濃度的乘積可以得到水分散蛋白質(zhì)的含量。
稱(chēng)取3 種溶菌酶各350 mg,加入5 mL 蒸餾水后,1 500×g(相對(duì)離心力)旋轉(zhuǎn)振蕩5 h,12 000×g (相對(duì)離心力)離心15 min,吸取上清液。量取上清液體積,并通過(guò)Bradford 法測(cè)量上清液的蛋白質(zhì)濃度[23],根據(jù)牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出上清液蛋白質(zhì)濃度,得到水分散蛋白質(zhì)含量。BSA 標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=7.228 3x+0.417 8,y 為上清液樣品的吸光度A595,x 為上清液中溶菌酶的濃度。溶菌酶溶解度為
式中:V 為上清液體積。
測(cè)定不同溫度(5、10、15、25、30 和 40 ℃)和不同 pH 值(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 和8.5)時(shí)3 種溶菌酶的溶解度。以溫度作為變量時(shí),pH 值均為5.5,以pH 值作為變量時(shí),溫度均為25 ℃。
2.3.2 座滴法制備溶菌酶晶體
在室溫下,配制溶菌酶溶液,如圖1 所示,吸取80 μL 晶體篩選劑于儲(chǔ)液池(liquid reservoir)中,1 μL溶菌酶溶液于點(diǎn)樣孔(sample hole)中,再?gòu)膬?chǔ)液池中吸取1 μL 晶體篩選劑于點(diǎn)樣孔中,用封板膜密封,在培養(yǎng)箱中靜置生長(zhǎng),定期觀察并記錄晶體的生長(zhǎng)情況,第1 周每天觀察,第2 周3 d 觀察一次晶體。
2.3.3 溶菌酶晶體的鑒定
利用Hampton Research 公司的Izit Crystal Dye 進(jìn)行晶體染色。Izit 是一種小分子染料,用于區(qū)分生物大分子晶體、小分子晶體和無(wú)機(jī)晶體。生物大分子晶體含有大溶劑通道,允許 Izit 滲透并使晶體呈現(xiàn)深藍(lán)色,小分子晶體和無(wú)機(jī)晶體不具有大的溶劑通道,無(wú)法吸收Izit。若添加Izit 后出現(xiàn)薄的針狀藍(lán)色晶體,是由于具有高相對(duì)過(guò)飽和度的篩選劑促使染料結(jié)晶后形成的,可以通過(guò)添加1 μL Izit 染色液和1 μL 篩選劑形成2 μL 液滴的對(duì)照實(shí)驗(yàn)將這種假陽(yáng)性與陽(yáng)性區(qū)分開(kāi)[24]。將10 μL Izit 與儲(chǔ)液池中80 μL 的晶體篩選劑混合均勻,從混合液中吸取1 μL 至點(diǎn)樣孔中的結(jié)晶液滴,對(duì)晶體進(jìn)行染色。在特定溫度的培養(yǎng)箱中靜置6 h 后,觀察染色情況,根據(jù)整個(gè)晶體是否被染成深藍(lán)色來(lái)判斷晶體是否為蛋白質(zhì)。
2.3.4 溶菌酶結(jié)晶條件的研究
從溶菌酶初始濃度、溫度、pH 值、沉淀劑4 個(gè)方面對(duì)3 種物種來(lái)源的溶菌酶的最適結(jié)晶條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探究。
圖1 座滴板的橫截面Fig.1 Cross section of the sitting-drop plate
2.3.4.1 溶菌酶初始濃度對(duì)溶菌酶結(jié)晶的影響
在25 ℃下培養(yǎng)3 種溶菌酶,初始質(zhì)量濃度分別為10、20、40、80 和120 mg·mL-1。雞蛋清溶菌酶以及芽孢桿菌溶菌酶的篩選劑均含有濃度為0.1 mol?L-1乙酸鈉的緩沖液以及濃度為2.0 mol?L-1甲酸鈉沉淀劑,pH 為 5.5;人源溶菌酶的篩選劑中含有 0.1 mol?L-1雙(2-羥乙基)氨基(三羥甲基)甲烷(Bis-(2-Hydroxyethyl)amino-tris(Hydroxymethyl)methane, BIS-TRIS)緩沖液及 2.0 mol?L-1硫酸銨沉淀劑,pH為6.1。
2.3.4.2 溫度對(duì)溶菌酶結(jié)晶的影響
在5、15、25 和40 ℃ 4 個(gè)溫度下對(duì)3 種溶菌酶進(jìn)行晶體培養(yǎng)。雞蛋清溶菌酶和芽孢桿菌溶菌酶初始質(zhì)量濃度均為 40 mg·mL-1,篩選劑均含有 0.1 mol?L-1乙酸鈉的緩沖液以及 2.0 mol?L-1甲酸鈉沉淀劑,pH 為5.5;人源溶菌酶的初始質(zhì)量濃度為80 mg?mL-1,篩選劑含有0.1 mol?L-1BIS-TRIS 的緩沖液以及2.0 mol?L-1硫酸銨的沉淀劑,pH 為6.1。
2.3.4.3 pH 對(duì)溶菌酶結(jié)晶的影響
在25 ℃的溫度下培養(yǎng)3 種溶菌酶晶體,pH 設(shè)置為3.5、4.5、5.5、6.5、7.5 和8.5。雞蛋清溶菌酶和芽孢桿菌溶菌酶的初始質(zhì)量濃度均為40 mg?mL-1,篩選劑均含有0.1 mol?L-1乙酸鈉的緩沖液和2.0 mol?L-1甲酸鈉的沉淀劑;人源溶菌酶的初始質(zhì)量濃度為80 mg?mL-1,篩選劑含有0.1 mol?L-1BIS-TRIS 的緩沖液和2.0 mol?L-1硫酸銨的沉淀劑。
2.3.4.4 沉淀劑對(duì)溶菌酶結(jié)晶的影響
在25 ℃的溫度下培養(yǎng)3 種溶菌酶晶體,雞蛋清溶菌酶和芽孢桿菌溶菌酶的初始質(zhì)量濃度均為40 mg?mL-1,篩選劑pH 值為5.5;人源溶菌酶的初始質(zhì)量濃度為80 mg?mL-1,篩選劑pH 值為6.1。沉淀劑設(shè)置如表2所示。
表2 3 種物種來(lái)源的溶菌酶的沉淀劑種類(lèi)Table 2 Precipitants for lysozyme from three species
圖2 3 種物種來(lái)源的溶菌酶在不同溫度和pH 值下的溶解度Fig.2 Solubility of lysozymes from three species at different temperatures and pH values
測(cè)定了不同溫度(5、10、15、25、30 和 40 ℃)和 pH 值(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 和8.5)條件下3 種溶菌酶在緩沖液中的溶解度,結(jié)果如圖2 所示。以溫度為變量時(shí),pH 值為5.5。如圖2(a)所示,溫度為5~40 ℃,雞蛋清和芽孢桿菌溶菌酶的溶解度呈現(xiàn)了相同的變化規(guī)律,人源溶菌酶與它們不同。在5~25 ℃,人源溶菌酶溶解度是雞蛋清和芽孢桿菌溶菌酶溶解度的5~7 倍,在30~40 ℃,3種溶菌酶溶解度的差距趨于0。在15 ℃時(shí),人源溶菌酶溶解度達(dá)到最大值,而其余2 種溶菌酶卻降至最小值。在25 ℃時(shí),人源溶菌酶的溶解度開(kāi)始大幅下降,而雞蛋清和芽孢桿菌溶菌酶的溶解度達(dá)到最大值。以pH 值為變量時(shí),溫度為25 ℃。圖2(b)示出在pH 為3.5~8.5 時(shí)3 種溶菌酶溶解度的變化,由圖可知人源溶菌酶溶解度是其余2 種溶菌酶的6 倍左右。3 種溶菌酶的溶解度均隨著pH 值增大而增大,在pH 值為7.5 時(shí)3 種溶菌酶溶解度均達(dá)到最大值,其后便開(kāi)始下降;并且pH 值在4.5~6.0,溶解度大幅上升,隨pH 值變化顯著。這些溶解度數(shù)據(jù)的獲得,為研究溶菌酶結(jié)晶條件提供了主要依據(jù)。
由溶解度數(shù)據(jù)測(cè)定可知,人源溶菌酶溶解度為雞蛋清和芽孢桿菌溶解度的5~7 倍,因此研究溶菌酶初始濃度對(duì)晶體生長(zhǎng)的影響時(shí),溶菌酶的初始濃度范圍要寬一點(diǎn),以覆蓋人源溶菌酶溶解度最大值以及其余2 種溶菌酶溶解度最小值。因此設(shè)置了蛋白質(zhì)初始質(zhì)量濃度為10~120 mg?mL-1。同樣將溫度設(shè)置為5、15、25 和40 ℃,在這個(gè)溫度范圍內(nèi),人源溶菌酶溶解度與其余2 種溶菌酶溶解度呈現(xiàn)不一樣的變化規(guī)律。設(shè)置了pH 為3.5~8.5,3 種溶菌酶溶解度在這個(gè)pH 值范圍內(nèi)均呈現(xiàn)出相同的變化規(guī)律。
3.2.1 溶菌酶初始濃度對(duì)晶體生長(zhǎng)的影響
圖3 示出了3 種溶菌酶在不同的初始濃度下晶體生長(zhǎng)的情況,表示了溶菌酶初始濃度對(duì)晶體生長(zhǎng)的影響程度。
圖 3(a)、(b)、(c)、(d)和(e),為雞蛋清溶菌酶在 10、20、40、80 和 120 mg·mL-1初始質(zhì)量濃度下的狀態(tài),分別是:未形成沉淀或晶體;出現(xiàn)數(shù)量較少的四方塊狀晶型;形成多個(gè)四方塊狀晶體的理想晶型;形成四方塊和六面體等不規(guī)則形狀的晶體交疊在一起;形成了大量形狀各不相同的晶體。圖 3(f)、(g)、(h)、(i)和(j),芽孢桿菌溶菌酶在 10、20、40、80 和 120 mg·mL-1初始濃度下的狀態(tài),分別是:未形成沉淀或晶體;形成了單個(gè)板塊狀晶體;形成多個(gè)板塊狀晶體的理想晶型;形成大量的微小晶體;生成小麥?zhǔn)鵂畹木w。圖 3(k)、(l)、(m)、(n)和(o),為人源溶菌酶在 10、20、40、80 和 120 mg·mL-1初始濃度下的狀態(tài),分別是:出現(xiàn)不透明沉淀;形成棒簇狀晶體;形成不透明沉淀以及小型針狀晶體;生成了分散的晶體并且呈現(xiàn)最理想的晶型,針狀晶體;形成了大量的聚集的針狀晶體。研究發(fā)現(xiàn),在溶菌酶初始濃度過(guò)高時(shí)會(huì)形成過(guò)多的晶核,晶體生長(zhǎng)速度過(guò)快,會(huì)形成大量的細(xì)小微晶, 晶體質(zhì)量比較差;初始濃度過(guò)低時(shí)無(wú)法形成沉淀和晶體或生成的晶體數(shù)量過(guò)少。因此想要獲得高質(zhì)量的晶體,溶菌酶初始濃度應(yīng)處于較低或中等的水平,避免產(chǎn)生過(guò)多晶核,形成質(zhì)量較差的晶體。雞蛋清溶菌酶和芽孢桿菌溶菌酶最適蛋白質(zhì)初始質(zhì)量濃度均為40 mg·mL-1,最理想晶型分別為四方塊狀和板塊狀。人源溶菌酶的最適蛋白質(zhì)初始質(zhì)量濃度與上述二者不同,為80 mg·mL-1,最理想晶型呈現(xiàn)針狀。由此可以說(shuō)明,初始質(zhì)量濃度不僅影響了晶體的形狀,而且不同物種溶菌酶也顯示了晶型的不同變化。
圖3 3 種物種來(lái)源的溶菌酶在10~120 mg·mL-1 初始濃度下的結(jié)晶狀態(tài)Fig.3 Crystallization of lysozyme from three species under initial concentrations of 10~120 mg·mL-1
3.2.2 溫度對(duì)晶體生長(zhǎng)的影響
圖4 示出了在不同溫度下晶體的生長(zhǎng)情況,表示了溫度對(duì)晶體生長(zhǎng)的影響程度。
如圖 4(a)、(b)、(c)和(d)所示,雞蛋清溶菌酶在5、15、25 和40 ℃的狀態(tài)分別是:形成了大量的晶體;形成了少量板塊狀晶體;生成了數(shù)量適中的方塊狀理想晶型;形成了聚集的棒簇狀晶體且表面殘缺不平整,多處出現(xiàn)裂紋。如圖 4(e)、(f)、(g)和(h)所示,芽孢桿菌溶菌酶在 5、15、25 和40 ℃的狀態(tài)分別是:形成了數(shù)量龐大的孿晶;形成了少量不規(guī)則的多面體晶體;形成了板塊狀的理想晶型;形成了大量的針狀晶體。如圖 4(i)、(j)、(k)和(l)所示,人源溶菌酶在5、15、25 和40 ℃的狀態(tài)分別是:形成了大量交叉的針狀晶體;形成了多層重疊的板塊狀晶體,表面殘缺不規(guī)整;形成了針狀晶體的理想晶型,數(shù)量適中,呈現(xiàn)分散狀態(tài);形成了小麥?zhǔn)鵂罹w。溶菌酶在低溫時(shí)會(huì)迅速結(jié)晶,產(chǎn)生過(guò)多的晶核或者孿晶,造成晶體聚集,無(wú)法獲得達(dá)到衍射要求的晶體;高溫會(huì)造成晶體變形,表面出現(xiàn)各種裂紋,因此過(guò)高或過(guò)低的溫度都無(wú)法獲得質(zhì)量較高的晶體。25 ℃為3 種物種溶菌酶的最適結(jié)晶溫度。由此可以說(shuō)明,溫度也是一個(gè)影響晶體形狀的重要因素。
3.2.3 pH 值對(duì)晶體生長(zhǎng)的影響
圖5 示出了3 種溶菌酶在不同pH 條件下形成的晶體大小、數(shù)量、形狀各不相同,表示了pH 對(duì)晶體生長(zhǎng)的影響程度。
圖4 3 種物種來(lái)源的溶菌酶在5~40 ℃溫度下的結(jié)晶狀態(tài)Fig.4 Crystallization of lysozyme from three different species at temperatures of 5~40 ℃
圖5 3 種物種來(lái)源的溶菌酶在3.5~8.5 的pH 值下的結(jié)晶狀態(tài)Fig.5 Crystallization of lysozyme from three species under pH values of 3.5~8.5
如圖 5(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)所示,雞蛋清溶菌酶在 pH 3.5、4.5、5.5、6.5、7.5 和 8.5 的條件下的狀態(tài)分別是:形成了不規(guī)則形狀的晶體;形成了數(shù)個(gè)不規(guī)則六面體;形成了方塊狀理性晶型,數(shù)量適中;形成了多個(gè)板塊狀晶體,大小各異,晶型不均勻;形成了大小各異的六面體晶體;形成了微小的大量聚集的針狀晶體。如圖5(g)、(h)、(i)、(j)、(k)和(l)所示,芽孢桿菌溶菌酶在pH 3.5、4.5、5.5、6.5、7.5 和8.5 的條件下的狀態(tài)分別是:形成了大量聚集的針狀晶體;形成了數(shù)個(gè)六面體晶體,但形狀各異;形成了理想晶型,多個(gè)板塊狀晶體,晶型均勻一致形成了數(shù)量較少的板塊狀晶體,邊緣凸起,晶型不均勻;形成了單個(gè)六面體晶體;未形成沉淀或晶體。如圖 5(m)、(n)、(o)、(p)、(q)和(r)所示,人源溶菌酶在pH 3.5、4.5、5.5、6.5、7.5 和8.5 的條件下的狀態(tài)分別是:形成了棒簇狀晶體;數(shù)個(gè)小麥?zhǔn)鵂罹w,且尾部表面出現(xiàn)殘缺不平整;多個(gè)大小不一的針狀晶體,處于聚集狀態(tài);多個(gè)針狀晶體,均勻分散;單個(gè)雙頭的小麥?zhǔn)鵂罹w;形成了不透明沉淀,未出現(xiàn)晶體。一般情況下,蛋白質(zhì)的溶解度在等電點(diǎn)處是最低的,此時(shí)蛋白質(zhì)表面的凈電荷幾乎為零,當(dāng) pH 值高于或低于等電點(diǎn)時(shí),蛋白質(zhì)所帶的凈電荷為正電荷或負(fù)電荷,溶解度增大,從而對(duì)晶體的大小和晶型產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)中3 種物種溶菌酶的最適結(jié)晶pH 均不在溶菌酶的等電點(diǎn)(11.1)附近,在5.5 附近的pH 值更適合雞蛋清以及芽孢桿菌溶菌酶結(jié)晶,在6.5附近的pH 值更適合人源溶菌酶進(jìn)行結(jié)晶。由此說(shuō)明pH 對(duì)晶體生長(zhǎng)的影響也十分明顯。
3.2.4 沉淀劑對(duì)晶體生長(zhǎng)的影響
圖 6 中示出了在不同沉淀劑下 3 種溶菌酶的晶型存在差異,表示了沉淀劑對(duì)晶體生長(zhǎng)的影響程度。如圖6(a)所示,雞蛋清溶菌酶在濃度為 0.1 mol?L-1醋酸鈉,2.0 mol?L-1甲酸鈉的沉淀劑下形成了最理想的晶型,四方塊狀晶體;圖 6(b)所示,在0.1 mol?L-1檸檬酸,3 mol?L-1氯化鈉下形成六面體晶型;圖6(c),在 1 mol?L-1琥珀酸,0.1 mol?L-1HEPES , 在 ρ=0.01 kg?L-1MPEG-2000 下產(chǎn)生的不規(guī)則方塊狀晶體表面存在大量裂紋;圖6(d)所示,芽孢桿菌溶菌酶在0.1 mol?L-1醋酸鈉,2.0 mol?L-1甲酸鈉沉淀劑形成了最理想的晶型,板塊狀晶體;圖 6(e),在 0.1 mol?L-1HEPES Na,0.8 mol?L-1酒石酸鉀鈉下形成棒簇狀晶型;圖 6(f),在φ=5% Tacsimate,0.1 mol?L-1HEPES,ρ=0.1 kg?L-1MPEG-5000 下形成了大量重疊的板塊狀晶體。圖 6(g)所示,人源溶菌酶在 0.1 mol?L-1BIS-TRIS,2 mol?L-1硫酸銨沉淀劑下形成了最理想晶型,針狀晶體;圖6(h)和圖6(i),人源溶菌酶分別在φ=60% Tacsimate 以及1.26 mol?L-1磷酸二氫鈉,0.14 mol?L-1磷酸氫二鉀的沉淀劑下形成了小麥?zhǔn)鵂罹汀2煌N類(lèi)的沉淀劑,與蛋白質(zhì)結(jié)晶的相互作用力不同,最終形成的晶體晶型也各不相同。雞蛋清溶菌酶以及芽孢桿菌溶菌酶的最適結(jié)晶沉淀劑為0.1 mol?L-1乙酸鈉,2.0 mol?L-1甲酸鈉;人源溶菌酶的最適結(jié)晶沉淀劑為 0.1 mol?L-1BIS-TRIS,2 mol?L-1硫酸銨。
圖6 3 種物種來(lái)源的溶菌酶在不同沉淀劑條件下的結(jié)晶狀態(tài)Fig.6 Crystallization of lysozyme from three species under different precipitant conditions
通過(guò)Bradford 法測(cè)定上清液蛋白濃度,計(jì)算得到3 種不同物種來(lái)源的溶菌酶在不同溫度和pH 值下的溶解度,發(fā)現(xiàn)人源溶菌酶在不同溫度和pH 值下的溶解度均為其余2 種溶菌酶的5~7 倍;雞蛋清與芽孢桿菌溶菌酶在不同溫度和pH 值下的溶解度變化規(guī)律一致,與人源溶菌酶溶解度在不同pH 值下的變化規(guī)律一致,但在不同溫度下的變化趨勢(shì)存在較大差異。通過(guò)氣相擴(kuò)散座滴法培養(yǎng)3 種溶菌酶的晶體,結(jié)果表明不同物種的溶菌酶的結(jié)晶條件和形成的晶型也不同。雞蛋清溶菌酶、芽孢桿菌溶菌酶和人源溶菌酶形成的晶型分別是四方塊狀、板塊狀和針狀。雞蛋清溶菌酶通常是在150 mg?mL-1的高蛋白質(zhì)初始質(zhì)量濃度,25 ℃,pH 4.5,0.3 mol?L-1NaCl 作為沉淀劑,0.1 mol?L-1乙酸鈉作為緩沖液的條件下形成晶體。
本文對(duì)不同物種的溶菌酶的溶解度、結(jié)晶條件和形成的不同晶型進(jìn)行探究,發(fā)現(xiàn)3 種溶菌酶的結(jié)晶條件中,溫度和 pH 值與以往報(bào)道的差距不大,但沉淀劑和蛋白質(zhì)初始濃度存在較大差異;對(duì)不同晶型的研究,將有利于探究蛋白質(zhì)的多態(tài)行為。
本文總結(jié)的結(jié)晶條件將不僅為球形蛋白質(zhì)、也對(duì)常規(guī)的蛋白質(zhì)結(jié)晶條件優(yōu)化具有參考價(jià)值,從而為解析更多蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)提供基礎(chǔ)。