尚紅巖，郭藝山，張遠(yuǎn)平，徐日益，李 靜，高亞飛，鄧毛程*

(1廣東省科學(xué)院生物工程研究所，廣東廣州510316；2廣東省綠色制糖工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510316；3廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)學(xué)院，廣東廣州510300)

0 引言

糖蜜是制糖廠的副產(chǎn)物，目前主要用途是發(fā)酵生產(chǎn)酒精或酵母。糖蜜除了含有蔗糖、還原糖、氨基酸等可發(fā)酵性糖和營(yíng)養(yǎng)成分外，還含有無(wú)機(jī)鹽、灰分、膠體和微生物等物質(zhì)，它們會(huì)抑制酵母繁殖和發(fā)酵。糖蜜發(fā)酵酒精相對(duì)粗放，原料和水不可避免攜帶雜菌等微生物，酒精生產(chǎn)主要通過(guò)添加硫酸和殺菌劑，來(lái)抑制雜菌生長(zhǎng)繁殖[1]。近年來(lái)，由于糖蜜純度不斷下降，發(fā)酵生產(chǎn)酒精過(guò)程中染菌更加頻繁，硫酸和殺菌劑的用量有不斷升高的趨勢(shì)。大量使用濃硫酸，不僅對(duì)環(huán)境造成很大的危害，而且容易腐蝕設(shè)備和產(chǎn)生積垢，還會(huì)增加酒精廢液處理的難度和環(huán)保資金的投入。硫酸抑制雜菌的同時(shí)也會(huì)抑制酵母發(fā)酵，影響原料出酒率[2-3]。大量使用以抗生素為主的殺菌劑，會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，失去殺菌作用，嚴(yán)重影響酒精發(fā)酵效果[4]。

高濃度糖蜜發(fā)酵酒精要提高發(fā)酵含酒份，并從根本上抑制雜菌，必須在酒精發(fā)酵中讓酵母形成生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，從生存競(jìng)爭(zhēng)上抑制雜菌，即采取生物抑菌的方法。本研究嘗試一方面對(duì)糖蜜原料快速澄清并滅菌，盡可能排除糖蜜中抑制酵母繁殖和發(fā)酵的膠體和灰分等物質(zhì)[5-6]；另一方面用高密度培養(yǎng)酵母發(fā)酵糖蜜酒精，以高密度酵母細(xì)胞較快的發(fā)酵速度及競(jìng)爭(zhēng)性對(duì)雜菌形成生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，以有效避免雜菌感染，取代硫酸和抗生素抑制雜菌。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

甘蔗糖蜜：廣東翁源縣茂源糖業(yè)有限公司。

酵母菌種：高活性糖蜜酒精干酵母 SIRI 08-11(廣東省科學(xué)院生物工程研究所)。

尿素、濃硫酸、青霉素、過(guò)磷酸鈣、硫酸銨、鹽酸、氫氧化鈉、中性醋酸鉛溶液、磷酸鹽草酸鹽混合溶液(脫鉛劑)、裴林氏甲乙溶液、1%次甲基藍(lán)指示溶液、0.1%酚酞指示液、10%稀硫酸。

1.2 儀器設(shè)備

三角瓶500 mL、三角瓶250 mL、容量瓶250 mL、量筒250 mL、蒸餾燒瓶250 mL、冷凝蛇管、電爐2500 W、溫度計(jì)1～100℃、糖錘度計(jì)、恒溫培養(yǎng)箱、水浴鍋、顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、酒度計(jì)(0～12)，上海精密儀器廠；電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；TDL-5A離心機(jī)，上海菲恰爾分析儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 糖蜜澄清處理實(shí)驗(yàn)

原糖蜜按以下方案處理：

1.3.1.1 熱酸澄清(A處理)

糖蜜稀釋到55°Bx，加硫酸調(diào)整pH到3.5，并加熱到70℃，攪拌自然沉降1 h，離心分離排除沉降物。

1.3.1.2 無(wú)酸澄清(B處理)

糖蜜稀釋到55°Bx，加熱到70℃，加過(guò)磷酸鈣0.2%(w)，硫酸銨0.5%，自然pH值，攪拌自然沉降1 h，離心分離排除沉降物。

1.3.1.3 常溫酸化(C處理)

糖蜜用自來(lái)水稀釋到 55°Bx，加硫酸調(diào)整 pH到3.5，攪拌自然沉降1 h，離心分離排除沉降物。

1.3.1.4 空白實(shí)驗(yàn)(D處理)

糖蜜用自來(lái)水稀釋到55°Bx，攪拌自然沉降1h，自然pH值，離心分離排除沉降物。

取經(jīng)以上方案處理過(guò)的糖蜜100 g，添加0.2%的尿素，分別稀釋到25°Bx置于250 mL的三角瓶中，接種1%干酵母，30℃條件下振蕩恒溫發(fā)酵48 h。發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定發(fā)酵醪液錘度、殘?zhí)欠?、酒精濃?V%)和揮發(fā)酸。

1.3.2 不同酵母密度發(fā)酵酒精實(shí)驗(yàn)

酵母培養(yǎng)液：用無(wú)酸澄清B處理糖蜜，用自來(lái)水稀釋至糖蜜濃度15°Bx，添加0.3%的尿素。

發(fā)酵培養(yǎng)液：原糖蜜稀釋至糖蜜濃度45°Bx。

實(shí)驗(yàn)步驟：取酵母培養(yǎng)液150 mL于500 mL三角瓶中，分別接種0.5%、1%、1.5%、2%和2.5%的活性干酵母，并分別培養(yǎng)至酵母密度0.5、1.0、1.5、2.0、2.5億/mL，分別標(biāo)記為 F1、F2、F3、F4和 F5，然后分別緩慢加入1:1的發(fā)酵培養(yǎng)液150 mL，恒溫31℃發(fā)酵48 h，化驗(yàn)分析發(fā)酵醪液錘度、殘?zhí)欠?、酒精濃度和揮發(fā)酸。

1.4 分析方法

酒精濃度(V%)：用平底燒瓶蒸餾發(fā)酵醪液，并安裝冷凝管收集鎦出液，用酒度計(jì)(上海精密儀器廠)測(cè)定鎦出液酒精濃度[7]。

用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定酵母培養(yǎng)液中的酵母菌數(shù)量。

用蘭因-艾農(nóng)(Lane-Eynon)恒容法[7]測(cè)定發(fā)酵液殘?zhí)欠?殘還原物)。

用堿液滴定法測(cè)定發(fā)酵蒸餾酒液的揮發(fā)酸[7]。

2 結(jié)果與討論

2.1 高濃度糖蜜澄清發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

高濃度糖蜜(55°Bx)經(jīng)過(guò)熱酸快速澄清、無(wú)酸澄清、常溫酸化和單純稀釋(空白實(shí)驗(yàn))等處理后，分別稀釋到25°Bx接種干酵母發(fā)酵(分別標(biāo)記為A熱酸、B無(wú)酸、C酸化、D空白)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1，發(fā)酵后錘度、酒份、殘?zhí)欠莺蛽]發(fā)酸等數(shù)據(jù)對(duì)比見(jiàn)圖 1～圖 4。

表1 25 °Bx糖蜜澄清發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表1和圖1、圖2、圖3可以看出高濃度糖蜜4種處理方案發(fā)酵后的錘度依次增加，即發(fā)酵不完全程度依次升高，發(fā)酵含酒份依次降低，殘?zhí)欠菀来紊?。綜合發(fā)酵后錘度、含酒份和殘?zhí)欠莸戎笜?biāo)，糖蜜4種處理方案中熱酸處理方案發(fā)酵效果相對(duì)最好，發(fā)酵后錘度最低，發(fā)酵酒份最高，殘?zhí)欠葑畹?，發(fā)酵最徹底；其次是無(wú)酸處理方案，發(fā)酵后錘度、酒份與殘?zhí)欠莸戎笜?biāo)和熱酸處理方案差別不大，此方案的優(yōu)勢(shì)是無(wú)需添加硫酸；接著是常溫酸化處理，發(fā)酵后錘度較高，酒份較低，殘?zhí)欠葺^高；處理效果最差的是單純稀釋（空白實(shí)驗(yàn)）方案，發(fā)酵后錘度高，酒份低，殘?zhí)欠莞?，發(fā)酵不完全。

圖1 4種糖蜜處理方案發(fā)酵后錘度

圖2 4種糖蜜處理方案發(fā)酵后酒份

圖3 4種糖蜜處理方案發(fā)酵后殘?zhí)欠?

圖4 4種糖蜜處理方案發(fā)酵后揮發(fā)酸

揮發(fā)酸是由產(chǎn)酸細(xì)菌產(chǎn)生的，揮發(fā)酸越高表明污染細(xì)菌越多，在糖蜜酒精生產(chǎn)中揮發(fā)酸一般控制在0.02 g/100 mL以內(nèi)。從表1和圖4可以看出，高濃度糖蜜4種處理方案發(fā)酵后，熱酸處理的揮發(fā)酸最低，表明染菌程度最低；無(wú)酸處理、酸化處理和單純稀釋的揮發(fā)酸依次增高；無(wú)酸處理、酸化處理方案的揮發(fā)酸也在可控范圍之內(nèi)；單純稀釋的揮發(fā)酸最高，已經(jīng)到染菌較嚴(yán)重的地步，導(dǎo)致糖蜜發(fā)酵含酒份低，殘?zhí)欠莞撸l(fā)酵不徹底。

2.2 不同酵母密度發(fā)酵酒精實(shí)驗(yàn)結(jié)果

接種不同量干酵母并分別培養(yǎng)至不同酵母密度發(fā)酵高濃度糖蜜，發(fā)酵后發(fā)酵液錘度、含酒份、殘?zhí)欠莺蛽]發(fā)酸的分析數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，其變化趨勢(shì)見(jiàn)圖5、圖6、圖7和圖8。

表2 不同酵母密度發(fā)酵酒精實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表2和圖5、圖6和圖7可以看出酵母數(shù)在0.5～2.0億/mL之間，隨著酵母培養(yǎng)密度增大，發(fā)酵后度降低，發(fā)酵含酒份升高，殘?zhí)欠萁档?；酵母密度大，發(fā)酵更徹底。從表2和圖8可以看出隨著酵母培養(yǎng)密度增大，發(fā)酵酒液揮發(fā)酸降低。主要原因是高密度酵母發(fā)酵速度快，并且在與細(xì)菌的生存競(jìng)爭(zhēng)中取得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)從而抑制細(xì)菌，使糖蜜中更多的糖發(fā)酵轉(zhuǎn)化成酒精。酵母培養(yǎng)細(xì)胞數(shù) 2.0億/mL和2.5億/mL，發(fā)酵后發(fā)酵液錘度、發(fā)酵含酒份、殘?zhí)欠莺蛽]發(fā)酸變化不大。一般糖蜜酒精生產(chǎn)培養(yǎng)酵母數(shù)控制為2.0億/mL比較合適，既能抑制雜菌，又不會(huì)消耗太多糖蜜培養(yǎng)酵母。

圖5 不同酵母密度發(fā)酵液錘度

圖6 不同酵母密度發(fā)酵含酒份

圖7 不同酵母密度發(fā)酵液殘?zhí)欠?

圖8 不同酵母密度發(fā)酵酒液揮發(fā)酸

3 結(jié)論與展望

高濃度糖蜜分別用熱酸澄清、無(wú)酸澄清、常溫酸化和單純稀釋(空白實(shí)驗(yàn))等 4種方法處理后，發(fā)酵含酒份(V/V%)分別為8.38%、8.32%、8.05%、7.82%；殘?zhí)欠莘謩e為1.45%、1.52%、1.87%、2.26%；熱酸澄清處理糖蜜發(fā)酵酒份最高，殘?zhí)欠莸茸畹?，發(fā)酵效果相對(duì)最好；無(wú)酸澄清糖蜜發(fā)酵效果也較好。將酵母培養(yǎng)至0.5、1.0、1.5、2.0和2.5億/mL等5種密度后發(fā)酵，含酒份分別為：9.38%、9.72%、10.16%、10.45%、10.46%；殘?zhí)欠莘謩e為 2.93%、2.38%、1.87%、1.54%、1.54%；揮發(fā)酸分別為：0.0264、0.018、0.012、0.0096、0.0096 g/100 mL。酵母培養(yǎng)密度在0.5～2.0億/mL之間，隨著酵母密度增加，發(fā)酵含酒份升高，殘?zhí)欠莺蛽]發(fā)酸等降低；酵母培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)到 2.5億/mL，發(fā)酵含酒份、殘?zhí)欠莸戎笜?biāo)和酵母密度2.0億/mL相比變化不大，一般糖蜜酒精生產(chǎn)培養(yǎng)酵母數(shù)控制2.0億/mL較合適。

用高密度培養(yǎng)酵母發(fā)酵高濃度糖蜜，可以有效避免細(xì)菌感染，發(fā)酵酒份高，發(fā)酵更徹底，提高酒精原料出酒率，為企業(yè)創(chuàng)造較好的經(jīng)濟(jì)效益；該技術(shù)還可以減少酒精廢液中殘?zhí)欠莸扔袡C(jī)物殘留，并減少用于抑菌的硫酸與抗生素的殘留，有利于酒精廢液處理和資源化利用，能產(chǎn)生顯著的社會(huì)效益。