梅艷秋，羅 燕，鐘 斌，林小鳳，鄺 瑩，易小慶，曾衛(wèi)佳，楊 民，黃啟同，6，8，9

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院2020級碩士研究生；2. 贛南醫(yī)學(xué)院科研中心；3. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院；4. 贛南醫(yī)學(xué)院醫(yī)用信息工程學(xué)院；5. 贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；6. 江西省油茶醫(yī)藥保健及功能產(chǎn)品開發(fā)工程研究中心；7. 贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院；8. 江西省醫(yī)用組織工程材料與生物制造重點實驗室；9. 心腦血管疾病防治教育部重點實驗室，江西 贛州 341000）

目前，席卷全球的新型冠狀肺炎（COVID-19）主要由嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）引起的，SARS-CoV-2是β冠狀病毒屬的新成員，其與嚴重急性呼吸綜合征—冠狀病毒（SARS-CoV）等密切相關(guān)，是第七個可感染人類的冠狀病毒［1-3］。圖1為美國首例新冠肺炎患者體內(nèi)分離出SARS-CoV-2 的透射電鏡（TEM）圖，TEM 顯示其結(jié)構(gòu)為直徑在80～220 nm的微球形，具有囊膜和12～24 nm 的棒狀刺突，具有典型的“冠狀”病毒的形態(tài)特征［4］。目前COVID-19 的主要感染源是COVID-19感染者、潛伏期感染者和無癥狀感染者，其主要的傳播途徑包括：飛沫傳播、接觸傳播、氣溶膠傳播以及其他可能的傳播途徑，如糞口傳播等［5-7］。截至2020年12月1日，全球累計確診63 751 110人，累計死亡人數(shù)達到1 477 200。由于COVID-19 具有非常強的傳染性和致死性，目前全球各個國家都在尋求有效的預(yù)防和治療方法，而預(yù)防的關(guān)鍵在于對患者的早診斷、早隔離、早治療。

圖1 SARS-CoV-2的TEM圖［4］

開發(fā)快速、靈敏、簡單、準確地檢測SARS-CoV-2方法對于疫情防控至關(guān)重要。2003年的SARS-CoV、2012 年的中東呼吸綜合征（MERS-CoV）以及現(xiàn)在流行的SARS-CoV-2 均屬人類冠狀病毒（HCoV），只是他們所處的菌株型不同，但是菌株結(jié)構(gòu)大同小異，所以可借鑒之前對其他HCoV 的檢測方法對SARS-CoV-2 進行檢測。目前我國國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）批準了至少11 種基于核酸的方法和8種抗體檢測試劑盒來檢測SARS-CoV-2［8］。隨著對COVID-19研究的不斷深入，新的生物化學(xué)檢測手段也被不斷地開發(fā)出來，目前對SARS-CoV-2 的測定最有效的手段是通過核酸或者抗體檢測（圖2）［9］。本文對目前已有的SARS-CoV-2 的生物化學(xué)檢測方法進行了總結(jié)。

1 SARS-CoV-2核酸檢測

圖2 用于SARS-CoV-2的兩種主要測試方法：核酸和抗體檢測［9］

核酸檢測是作為診斷COVID-19 的主要方法，目前常用的核酸檢測法包括宏基因組學(xué)測序［10-12］、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）［13］、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）［14-16］和核酸生物傳感器［17］等，這些技術(shù)的發(fā)展為COVID-19的臨床診斷和預(yù)防提供了重要的技術(shù)支持。

1.1 宏基因組學(xué)測序技術(shù)用于檢測SARS-CoV-2宏基因組學(xué)測序技術(shù)無須對病毒微生物進行分離培養(yǎng)即可實現(xiàn)對病毒微生物的鑒定與臨床診斷，基于宏基因組學(xué)測序得到SARS-CoV-2 病毒全基因組序列，為SARS-CoV-2列為β冠狀病毒屬的新成員提供了依據(jù)。因此，在疫情暴發(fā)早期階段，SARS-CoV-2病毒的宏基因組測序作為確定COVID-19 患者的主要手段。張永振教授團隊率先完成第一個SARS-CoV-2 基因組的測序工作，并系統(tǒng)比對了SARS-CoV-2基因與其他類冠狀病毒基因的差異性，其與SARS 病毒基因組的相似度達到了89.1%，為SARS-CoV-2 的演化來源提供了依據(jù)［10］。隨后，LU等［11］對獲得了8個完整的SARS-CoV-2 基因組序列，并與其他冠狀病毒的基因組序列進行了詳細比對，系統(tǒng)分析了其與其他病毒基因的相似片段與差異性片段。目前，國家衛(wèi)健委已將基因組測序中得到與已知的SARS-CoV-2 高度同源的結(jié)果，作為COVID-19 臨床確診的依據(jù)之一［12］。雖然宏基因組學(xué)測序成本較高，但是宏基因組學(xué)測序不僅為SARS-CoV-2的來源、發(fā)病機制的分析提供了技術(shù)支撐，還為新型SARS-CoV-2 檢測方法的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1.2 RT-PCR 用于檢測SARS-CoV-2RT-PCR 是使用呼吸道樣本（鼻咽拭子、口咽拭子、鼻咽洗液、鼻腔抽吸物、痰液、灌洗液以及氣管吸出物等）診斷COVID-19 的 最 主 要 方 法［14-16］。 RT-PCR 將SARS-CoV-2 RNA 反轉(zhuǎn)錄為互補DNA（cDNA）鏈，然后擴增cDNA 的特定區(qū)域。設(shè)計過程通常包括兩個主要步驟，一為序列比對和引物設(shè)計；二為分析條件的優(yōu)化和測試。CORMAN 等［14］在與SARS 相關(guān)的病毒基因組分析中設(shè)計了雙“引物—探針”體系。第一個引物組可以普遍檢測許多冠狀病毒，而第二個引物組只能檢測SARS-CoV-2。之后優(yōu)化測定條件（試劑條件、孵育時間和溫度），隨后進行PCR 測試，以此實現(xiàn)對SARS-CoV-2 RNA 測定。RT-PCR 可分為一步法或兩步法進行測定。在一步測定中，反轉(zhuǎn)錄和PCR 擴增被整合為一個反應(yīng)，這種測定方法為高通量分析提供了快速且可重復(fù)的結(jié)果。缺點在于逆轉(zhuǎn)錄和擴增步驟同時進行，優(yōu)化過程很難實現(xiàn)，從而導(dǎo)致靶標擴增子的產(chǎn)量降低。在兩步測定中，反應(yīng)在單獨的試管中依次進行，這種形式的分析法比單步分析法更敏感，但需要更多的時間去進行其他參數(shù)的優(yōu)化。

RT-PCR 可用來診斷COVID-19，但是實際測試的敏感性和特異性相差很大，缺乏一致性，AI 等［15］研究表明其準確率僅為66%～80%，與此同時，AREVALO-RODRIGUEZ 等［16］也得出其檢測結(jié)果假陰性率在2%～29%之間，其準確性低大致是因為檢測時病毒載量低于最低檢測值、專業(yè)人士操作不佳、所用核酸提取方法不適當(dāng)、靶向DNA 序列未檢測、探針和引物設(shè)計不良等諸多因素導(dǎo)致。

1.3 核酸生物傳感器用于檢測SARS-CoV-2生物傳感器在病毒檢測等領(lǐng)域已得到了廣泛的應(yīng)用，其是一種能產(chǎn)生與被分析物濃度成比例的可量化信號的分析裝置。它們由換能器和生物活性元件或材料組成，如核酸、酶和抗體等，它們可通過特異性的相互作用實現(xiàn)對目標物的檢測與分析［17-19］。目前，生物傳感器主要包括熒光、光散射、表面增強拉曼散射、電化學(xué)和表面等離子體共振等技術(shù)［17-21］。由于生物傳感器廉價、簡單、靈敏、經(jīng)濟、快速等優(yōu)點，可為非專業(yè)人員和公眾提供切實可行的分析技術(shù)，因此，其受到了研究學(xué)者的廣泛青睞。

JIAO 等［22］制備了基于DNA 納米支架雜交鏈反應(yīng)的新型DNA 熒光傳感器，并成功地應(yīng)用于SARS-CoV-2 RNA 的測定。首先DNA 納米支架由長DNA 單鏈（RCA）和一些H1 探針（由立足點序列F1、發(fā)夾結(jié)構(gòu)S'C1S 和尾部T1 組成）通過雜交組成。然后用5-羧基熒光素（FAM）染料和其猝滅劑（BHQ1）分子標記以形成自淬滅探針，發(fā)夾打開時熒光將恢復(fù)。當(dāng)目標SARS-CoV-2 RNA 存在時，它會觸發(fā)沿DNA 納米支架的級聯(lián)反應(yīng)。在不添加目標的情況下，其具有弱的熒光信號，當(dāng)存在SARS-CoV-2 RNA的情況下，游離的H1 和H2 能夠相互雜交以觸發(fā)雜交鏈式反應(yīng)（HCR），從而導(dǎo)致熒光的恢復(fù)。由此構(gòu)建出新型的熒光DNA 生物傳感器，實現(xiàn)對SARS-CoV-2 RNA 的靈敏檢測，檢測限（LOD）達到了0.96 pM（圖3）。該方法具有高信號增益、反應(yīng)時間短、特異性高、室溫響應(yīng)、方便檢測等優(yōu)點。

圖3 基于DNA納米支架雜交鏈反應(yīng)的新型DNA熒光傳感器用于測定SARS-CoV-2 RNA［22］

QIU 等［23］構(gòu)建了等離子體光熱效應(yīng)（PPT）和局部表面等離子體共振（LSPR）傳感轉(zhuǎn)導(dǎo)相結(jié)合的雙功能等離子體生物傳感器。該傳感器主要是基于二維金納米粒子（AuNIs），并通過DNA 互補雜交技術(shù)，實現(xiàn)對SARS-CoV-2 中的選定序列進行敏感檢測，其LOD 達到0.22 pM，并允許在多基因混合物中精確檢測特定靶點。該項研究為PPT-LSPR 生物傳感器在SARS-CoV-2檢測方面提供了新的思路。

ZHU 等［24］開發(fā)了一種多重逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增（mRT-LAMP）與基于納米顆粒的側(cè)流式生物傳感器（mRT-LAMP-LFB）相結(jié)合，用于診斷COVID-19，能在1 小時內(nèi)快速檢測出病毒中的ORF1ab 和核蛋白基因（N）。BROUGHTON 等［25］針對SARS-CoV-2開發(fā)了一種基于CRISPR/Cas12的LFB 生物傳感器，比mRT-LAMP-LFB 傳感器的檢驗時間縮短了半小時。

ZHAO 等［26］使用杯芳烴官能化的氧化石墨烯與靶向SARS-CoV-2 RNA 的合成了一個超三明治型電化學(xué)傳感器（圖4），該傳感器用于臨床標本SARS-CoV-2 RNA檢測時的LOD低至200 copies·mL-1?；诖藗鞲衅饕查_發(fā)了一種即插即用的方法，甚至可用在智能手機上，實現(xiàn)無須RNA 擴增即可靈敏、準確、快速地檢測各種臨床中的SARS-CoV-2 樣品，從而提供了一種簡單、低成本檢測方法。TRIPATHY等［27］利用無標簽電化學(xué)檢測DNA 雜交合成了一種微型電化學(xué)生物傳感器，可作為一種潛在的方法用于COVID-19 的診斷。這個方法簡單且便攜，可以擺脫笨重的檢測設(shè)備，能在現(xiàn)場即時操作，基于這個優(yōu)點，為開發(fā)出快速診斷和即時診斷檢測設(shè)備提供了參考。

CHAIBUN 等［28］開發(fā)了一種結(jié)合等溫滾圈放大（RCA）的電化學(xué)生物傳感器，用于對SARS-CoV-2進行高靈敏度和特異性的檢測。利用RCA 的高擴增能力和高靈敏性的電化學(xué)檢測方法，使我們能在合成的線性靶標和/或臨床標本中檢測到病毒的N和S基因，整個實驗耗時不到2小時，該方法對臨床樣本的檢驗性能可與RT-PCR 相比較。該傳感器可用于COVID-19的現(xiàn)場實時診斷。

總之，隨著核酸檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的檢測技術(shù)被開發(fā)用于SARS-CoV-2 的測定，表1顯示了截至目前為止部分SARS-CoV-2 核酸測定的方法，通過不同方法的對比，希望后續(xù)研究學(xué)者能夠開發(fā)出更加靈敏、快速、經(jīng)濟以及準確的COVID-19核酸測定方法。

圖4 三明治型電化學(xué)傳感器檢測SARS-CoV-2 RNA 的示意圖［26］

表1 SARS-CoV-2核酸測定的方法對比

2 SARS-CoV-2蛋白檢測

雖然SARS-CoV-2 核酸測定已得到了廣泛的研究，但從SARS-CoV-2 的蛋白結(jié)構(gòu)圖（圖5）可以看出，將整個病毒顆?；蚱湎鄳?yīng)的表面抗原表位作為傳感器檢測標志物也可有效地實現(xiàn)對SARS-CoV-2的測定［39］。許多研究表明，IgM 抗體在癥狀發(fā)作后約5～10天開始可檢測到并迅速升高，然后緊接著是IgG 抗體反應(yīng)，這些血清轉(zhuǎn)化通常發(fā)生在總抗體癥狀發(fā)作后的前3 周內(nèi)，平均時間為9～11 天（IgM 為10～12 天，IgG 為12～14 天）［40］，這些病毒感染后的免疫反應(yīng)為SARS-CoV-2 的蛋白檢測提供了可能，所以可利用病毒自帶的蛋白質(zhì)（例如S蛋白）或者患者樣品中的抗體（例如IgM和IgG）進行檢測。

圖5 SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)示意圖［39］

ZHANG 等［41］針對SARS-CoV-2 核衣殼蛋白（N蛋白）制備了DNA 適體。N 蛋白是最豐富的結(jié)構(gòu)蛋白之一，它可作為準確、靈敏地檢測SARS-CoV-2 的診斷標記。他們通過使用四個DNA 序列（親和力低于5 nM）分別生成了四對適體，而且這四對適體由于三明治型相互作用，可以先后與N 蛋白結(jié)合，在ELISA 和膠體金免疫色譜條中使用這些夾心的適體，能夠?qū)崿F(xiàn)超靈敏地（1 ng·mL-1）檢測N蛋白。

MAVRIKOU 等［42］制備了一種基于便攜式無標簽細胞的生物測定方法，可檢測SARS-CoV-2的突觸蛋白抗原S1。該生物傳感器以超快速的方式（3 min）提供結(jié)果，檢測極限為1 fg·mL-1，此外，沒有觀察到與N 蛋白的交叉反應(yīng)性。無須事先對樣品進行處理，就能大規(guī)模篩選SARS-CoV-2 表面抗原，為及時監(jiān)測冠狀病毒提供了依據(jù)。

FABIANI 等［43］建立了一種快速、智能檢測唾液中SARS-CoV-2 的電化學(xué)免疫分析方法（圖6）。以磁珠為免疫鏈載體，以堿性磷酸酶為免疫標記物的二級抗體為免疫標記物，建立了檢測棘突蛋白（S 蛋白）或核衣殼蛋白（N蛋白）的電化學(xué)方法。用炭黑納米材料修飾的絲網(wǎng)印刷電極檢測酶副產(chǎn)物萘酚。該方法對S 蛋白和N 蛋白的檢出限分別為19 ng·mL-1和8 ng·mL-1，將該方法用于唾液樣本中SARS-CoV-2的直接檢測，其檢測結(jié)果與實時PCR 的檢測結(jié)果一致。該方法具有檢測限低，分析快速（30 min），儀器小型化，便攜性好，使用方便，無創(chuàng)采樣，且可用于檢測未經(jīng)處理的唾液中的SARS-CoV-2，該分析工具具有很高的市場準入潛力。

圖6 磁珠為免疫鏈載體，以堿性磷酸酶為免疫標記物的二級抗體為免疫標記物，建立了檢測S 蛋白或N 殼蛋白的電化學(xué)方法［43］

SEO 等［44］合成了一種基于場效應(yīng)晶體管（FET）的生物傳感設(shè)備，能檢測臨床樣品中的SARS-CoV-2。它是通過S蛋白的特異性抗體覆蓋在FET 的石墨烯片制成的。該傳感器具有良好的靈敏度：培養(yǎng)基中的SARS-CoV-2（LOD：1.6×101pfu·mL-1）和臨床樣品（LOD：2.42×102pfu·mL-1）都被成功檢測出，說明該FET生物傳感器具有非常優(yōu)異的潛在使用性。

目前，蛋白的檢測雖然已取得了可觀的進展（表2），我國國家藥品監(jiān)督管理局目前也已經(jīng)批準了8 種用于SARS-CoV-2 抗體檢測的試劑盒，但目前仍有假陰性或者假陽性的情況出現(xiàn)，因此，結(jié)合核酸檢測和CT檢測，將彌補蛋白檢測的這一缺點。

表2 SARS-CoV-2蛋白測定的方法對比

3 結(jié)論與展望

迅速、靈敏、準確地實現(xiàn)SARS-CoV-2 檢測對疫情的控制與監(jiān)測非常重要。目前，無論是核酸檢測還是蛋白檢測仍存在不足，因此，通過兩種目標物的測定，結(jié)合CT 檢測，將有效地預(yù)防假陽性或者假陰性的產(chǎn)生。本次疫情的嚴重性也提醒我們有必要為未來任何病毒或其他致病性微生物暴發(fā)做好準備。其中，快速檢測方法的不斷開發(fā)是預(yù)防和管理未來可能發(fā)生的流行病的關(guān)鍵。因此，開發(fā)出廉價、快速、高通量和便攜式篩查技術(shù)顯得尤為重要?；诠δ懿牧稀⒓{米技術(shù)的新型傳感器具有靈敏度高和成本低的優(yōu)勢，此類傳感器在未來的應(yīng)用前景將會得到不斷重視。同時，新的智能傳感方法將生物傳感器的超高靈敏度與人工智能和物聯(lián)網(wǎng)相結(jié)合，有助于更好地發(fā)現(xiàn)和預(yù)防潛在的傳染性疾病?？傊?，隨著檢測技術(shù)的不斷完善和疫苗的即將問世，COVID-19在不久的將來必將得到有效控制。