黃宇旻 李菊明 韋永中

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，江蘇 南京 210000)

骨肉瘤發(fā)病率較高且預(yù)后較差；骨肉瘤常以股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端為起始侵襲部位，此后易發(fā)生以肺部為主的廣泛性轉(zhuǎn)移〔1〕。人肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(MALAT)1是長鏈非編碼RNA(lncRNA)家族的重要成員，既往研究已表明其與肺癌的侵襲能力有關(guān)，且參與多種腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲過程〔2〕。MALAT1可作為骨肉瘤預(yù)后的預(yù)測(cè)因子及治療的潛在靶點(diǎn)，但其調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞侵襲能力的機(jī)制尚未明確〔3〕。miR-205是具有抑癌作用的一類微小RNA(miRNA)可在多種惡性腫瘤中存在異常表達(dá)，影響腫瘤的侵襲過程〔4〕。本研究重點(diǎn)研究在骨肉瘤侵襲中，MALAT1與miR-205對(duì)于調(diào)控的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要材料及試劑 骨肉瘤細(xì)胞(MG63細(xì)胞、Sao-2細(xì)胞)、正常成骨細(xì)胞(hFOB細(xì)胞)均來源于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。胎牛血清、Transwell室來源于北京優(yōu)尼康生物科技有限公司，MALAT1干擾物(si-MALAT1)及其陰性對(duì)照(NC)、MALAT1、Lipofectamine3000來源于美國Amgen公司，miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒來源于美國Gene Copoeia公司，Roche熒光定量試劑盒來源于北京綠源伯德生物科技有限公司，miR-205模擬物及其NC來源于美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(QPCR) 采用含15%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)MG63、Sao-2及hFOB細(xì)胞，培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5% CO2，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞備用。提取各組細(xì)胞中的RNA，依據(jù)試劑盒說明書的要求將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)條件：預(yù)變性90℃ 45 s、95℃ 10 s、60℃ 60 s為一個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每組依據(jù)重復(fù)原則進(jìn)行3次。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 獲取si-MALAT1與NC，利用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑對(duì)MG63、Sao-2細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，依據(jù)說明書進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為48 h。獲取miR-205模擬物與NC，利用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑對(duì)MG63、Sao-2細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，依據(jù)說明書進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為48 h。

1.2.3熒光素酶基因檢測(cè) 利用生物信息學(xué)方法測(cè)定MALAT1與miR-205的結(jié)合位點(diǎn)。推測(cè)MALAT1 3′-UTR的靶序列，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體，作為MALAT1野生型3′-UTR?；谝吧偷慕Y(jié)果，利用核苷酸替代的方式構(gòu)建MALAT1突變型3′-UTR。接種MG63、Sao-2細(xì)胞，將miR-205模擬物及NC各自與野生型載體、突變型載體共轉(zhuǎn)染，利用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑完成轉(zhuǎn)染過程，依據(jù)說明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染后利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)試劑盒(Promega)對(duì)熒光素酶活性進(jìn)行測(cè)定，每組依據(jù)重復(fù)原則進(jìn)行3次。

1.2.4細(xì)胞遷移侵襲試驗(yàn)(Transwell實(shí)驗(yàn)) Transwell實(shí)驗(yàn)分為A組(空白對(duì)照組)、B組(si-MALAT1 NC組)、C組(miR-205模擬物組)、D組(miR-205模擬物+MALAT1組)四組轉(zhuǎn)染組，MG63細(xì)胞與四組轉(zhuǎn)染組各自轉(zhuǎn)染后，加入胰酶消化并制備細(xì)胞混懸液。將混懸液加入上室，隨后植入含胎牛血清的24孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)相同的環(huán)境中培養(yǎng)48 h，取出小室，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗、固定、染色，于顯微鏡下隨機(jī)選取視野，計(jì)算過膜的細(xì)胞數(shù)量，每組依據(jù)重復(fù)原則進(jìn)行3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1MALAT1、miR-205在兩組細(xì)胞中的表達(dá)比較 MG63、Sao-2細(xì)胞的MALAT1的表達(dá)水平(2.35±0.06、2.06±0.04)明顯高于hFOB細(xì)胞(0.87±0.01，P<0.05)，而MG63、Sao-2細(xì)胞的miR-205的表達(dá)水平(0.52±0.03、0.46±0.03)明顯低于hFOB細(xì)胞(0.81±0.03，P<0.05)。

2.2MALAT1、miR-205的表達(dá)關(guān)系分析 MG63、Sao-2細(xì)胞在轉(zhuǎn)染si-MALAT1后的miR-205表達(dá)水平(3.36±0.65、3.72±0.58)均明顯高于對(duì)應(yīng)NC組(1.36±0.43、0.97±0.1，P<0.05)。MG63、Sao-2細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-205模擬物后的MALAT1表達(dá)水平(0.50±0.04、0.41±0.02)均明顯低于對(duì)應(yīng)NC組(1.47±0.62、1.25±0.34，P<0.05)。

2.3MALAT1、miR-205的靶向調(diào)控關(guān)系分析 MG63、Sao-2細(xì)胞在共轉(zhuǎn)染miR-205模擬物+MALAT1野生型載體后的熒光值(0.27±0.01、0.61±0.02)明顯低于對(duì)應(yīng)NC組(0.55±0.01、0.98±0.04，P<0.05)。MG63、Sao-2細(xì)胞在共轉(zhuǎn)染miR-205模擬物+MALAT1突變型載體后的熒光值(0.54±0.01、0.87±0.04)與對(duì)應(yīng)NG組(0.56±0.01、0.88±0.03)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MALAT1與miR-205的結(jié)合位點(diǎn)為hsa-miR-205-5p，mirAccession為MIMAT0000266。見圖1。

圖1 MALAT1、miR-205的靶向調(diào)控

2.4MALAT1調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞侵襲能力 A組、B組細(xì)胞侵襲數(shù)分別為(70.24±6.24)個(gè)、(72.35±6.85)個(gè)。D組細(xì)胞侵襲數(shù)〔(42.63±5.67)個(gè)〕明顯高于C組〔(28.52±3.68)個(gè)，P<0.05〕。見圖2。

圖2 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MG63細(xì)胞的侵襲能力(×100)

3 討 論

3.1骨肉瘤的發(fā)病特點(diǎn)及分子機(jī)制 骨肉瘤是男性人群中發(fā)病率較高的一種間葉惡性腫瘤，常并發(fā)膝關(guān)節(jié)疼痛與腫脹〔5〕。骨肉瘤的起病癥狀輕微且具有非特異性，因此絕大部分患者未能早期重視，往往出現(xiàn)明顯癥狀時(shí)再就診，此時(shí)易合并以肺部轉(zhuǎn)移為主的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移〔6〕。當(dāng)前骨肉瘤的糾治方法以化療及手術(shù)為主，但目前骨肉瘤預(yù)后較差，其診治值得引發(fā)充分重視〔7〕。

既往對(duì)于骨肉瘤發(fā)病的分子機(jī)制了解較少；近年來，研究人員嘗試從骨肉瘤的分子機(jī)制入手進(jìn)行治療手段的突破〔8〕。lncRNA是一類長度在200 nt以上、無編碼蛋白能力的RNA，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在〔9〕。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為lncRNA僅是基因轉(zhuǎn)錄過程中的無用產(chǎn)物，不參與重要的生物學(xué)過程〔10〕。但近年來研究表明，lncRNA可與對(duì)應(yīng)的靶向蛋白結(jié)合，進(jìn)而影響基因表達(dá)中關(guān)鍵基因或蛋白的含量，參與基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等多重水平的調(diào)控，通過影響細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移與凋亡過程而影響腫瘤的產(chǎn)生與進(jìn)展〔11〕。

3.2MALAT1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞侵襲能力的影響 MALAT1是lncRNA家族的重要成員之一，具有序列豐富、功能多樣的優(yōu)勢(shì)，可能與腫瘤的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)移、侵襲等各生理過程密切相關(guān)〔12〕。既往已有關(guān)于MALAT1與各類腫瘤關(guān)系的研究，結(jié)果表明MALAT1在肺癌、胃癌、肝癌、膀胱癌等多種腫瘤中均存在表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象，抑制MALAT1表達(dá)有利于阻礙腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲過程，促進(jìn)細(xì)胞凋亡進(jìn)程，最終達(dá)到有效控制腫瘤細(xì)胞的目的〔13〕。因此，MALAT1是預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移性腫瘤的標(biāo)志物，對(duì)于治療亦具有重要的指向意義〔14〕。

本研究結(jié)果表明，MALAT1在骨肉瘤中存在高表達(dá)，因此MALAT1對(duì)于骨肉瘤細(xì)胞的進(jìn)展具有重要影響，骨肉瘤具有早期轉(zhuǎn)移的特性，因此研究MALAT1對(duì)于骨肉瘤侵襲的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。部分lncRNA需要以miRNA作為作用靶點(diǎn)，可逆轉(zhuǎn)miRNA對(duì)效應(yīng)mRNA的抑制作用，進(jìn)而發(fā)揮其作用〔15〕。研究表明MALAT1可通過逆轉(zhuǎn)miR-125b的效應(yīng)調(diào)控膀胱癌的進(jìn)展，而miR-125b同樣對(duì)于MALAT1的表達(dá)具有下調(diào)作用〔16〕。因此，lncRNA、miRNA可靶向結(jié)合并互相作用，共同調(diào)控惡性腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展。本研究的重點(diǎn)在于研究MALAT1與miR-205的關(guān)系，探究其調(diào)控骨肉瘤侵襲的機(jī)制。

3.3MALAT1與miR-205表達(dá)水平的關(guān)系 本研究骨肉瘤組織中MALAT1與miR-205的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；MALAT1可抑制骨肉瘤細(xì)胞中miR-205的表達(dá)，而miR-205亦可抑制骨肉瘤細(xì)胞中MALAT1的表達(dá)，即MALAT1、miR-205兩者間的表達(dá)存在相互抑制關(guān)系。

3.4MALAT1通過miR-205調(diào)控侵襲的機(jī)制 本研究結(jié)果表明MALAT1與miR-205存在靶向調(diào)控效應(yīng)；miR-205可抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲能力，且MALAT1存在時(shí)可有效逆轉(zhuǎn)此抑制效應(yīng)、促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的侵襲能力。