謝淵 李抄 張曉怡 陳定宇 趙艷 王琴容 周建獎(jiǎng)

(貴州醫(yī)科大學(xué)地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004)

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是上皮細(xì)胞在某些特定的生理或病理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)化成為具有間質(zhì)樣表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，是已知的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的核心生物學(xué)進(jìn)程之一〔1〕。在此過程中上皮細(xì)胞的極性消失、遷移和運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，同時(shí)伴有上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白(cadherin)的丟失、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、Snail的表達(dá)、細(xì)胞骨架重排，使上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性和細(xì)胞黏附，從而獲得遷移和侵襲性使上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性和細(xì)胞黏附，從而獲得遷移和侵襲性〔2，3〕。

胃泌素(gastrin)是一種胃腸肽激素，由胃竇部G細(xì)胞產(chǎn)生，刺激胃酸分泌，其作為胃腸道的營(yíng)養(yǎng)因子，參與胃腸黏膜的生長(zhǎng)和修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，gastrin可由胃腸腫瘤細(xì)胞異位產(chǎn)生，作為促生長(zhǎng)因子，刺激腫瘤細(xì)胞的增殖和分化〔4〕。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中g(shù)astrin基因的表達(dá)量是原發(fā)胃癌組織的35倍〔5〕，gastrin可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和血管生成擬態(tài)的形成，同時(shí)還增強(qiáng)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)，提示gastrin在促進(jìn)胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用〔6，7〕。目前，胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT并獲得侵襲潛能的分子基礎(chǔ)和作用機(jī)制并不十分清楚，胃癌細(xì)胞自分泌gastrin促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移是否與誘導(dǎo)EMT發(fā)生有關(guān)還有待進(jìn)一步研究。本研究用過表達(dá)gastrin真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系構(gòu)建高表達(dá)gastrin細(xì)胞模型，采用Western印跡觀察gastrin對(duì)胃癌細(xì)胞EMT的影響，并檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)變化，初步探索gastrin對(duì)胃癌EMT的影響。

1 材料和方法

1.1材料 人胃癌細(xì)胞 SGC-7901、MKN45購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，gastrin過表達(dá)載體pcDNA3.1-gastrin由本課題組前期構(gòu)建，由本實(shí)驗(yàn)室保存。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；雙抗、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；LipofectamineTM2000購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；質(zhì)粒提取試劑盒、Western印跡配膠試劑盒、蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；羊抗兔E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、Snail、gastrin、wnt3α、羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)proteintech公司，c-myc購(gòu)自abcam公司，gastrin PCR擴(kuò)增引物序列(上游5′-GCTCTAG ACCATGCAGCGACTATGTGTGTAT-3′，下游5′-GCCCTAGGTCAGTTTTTCA GGGGACAG-3′)由上海生工合成。

1.2胃癌細(xì)胞株SGC-7901、MKN45的培養(yǎng) 胃癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)80%以上融合度時(shí)進(jìn)行傳代，備用。

1.3pcDNA3.1-gastrin質(zhì)粒提取及鑒定 取實(shí)驗(yàn)室液氮保存含pcDNA3.1-gastrin質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α菌株，在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 h，挑取一個(gè)單菌落在含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，220 r/min，37℃搖菌16 h。收集細(xì)菌細(xì)胞并按照質(zhì)粒提取試劑盒操作步驟進(jìn)行提取，定量及PCR擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)gastrin基因。

1.4pcDNA3.1-gastrin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞 轉(zhuǎn)染前24 h，將生長(zhǎng)良好的胃癌細(xì)胞SGC-7901、MKN45消化后，加入無抗生素培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后以5.0×105/孔的密度接種至6孔板，再加入2 ml/孔無抗生素培養(yǎng)液，過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞融合率達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)實(shí)際說明書建議及前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，采用轉(zhuǎn)染試劑∶質(zhì)粒為5∶3進(jìn)行轉(zhuǎn)染，設(shè)置空白對(duì)照(control)組(空載體轉(zhuǎn)染)、空載質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染(pcDNA3.1)組和pcDNA3.1-gastrin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(pcDNA3.1-gastrin)組。轉(zhuǎn)染6 h后更換不含雙抗的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞備檢。

1.5蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)測(cè)定EMT、Wnt/β-catenin信號(hào)通路標(biāo)志蛋白 取各組細(xì)胞，用RIPA裂解液充分裂解，提取總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒定量。取50 μg總蛋白上樣，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)3 h，轉(zhuǎn)膜2.5 h，封閉液封閉1 h；磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，10 min/次；各組分別加入羊抗兔一抗(E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、Snail、gastrin、wnt3α)4 ℃孵育過夜，用含0.05%Tween20的TBS(TBST)漂洗3 次，10 min/次；加入辣根過氧化物酶(HRP)二抗，37℃孵育1 h，同上漂洗后加入化學(xué)發(fā)光液顯色，試驗(yàn)以GAPDH為內(nèi)參。處理并讀取灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶的平均灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1pcDNA3.1-gastrin質(zhì)粒PCR鑒定 取從大腸桿菌DH5α中提取的質(zhì)粒pcDNA3.1-gastrin，用gastrin特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳后可見大小為375 bp的目的片段，如圖1所示。

2.2Western印跡檢測(cè)SGC-7901、MKN45細(xì)胞中g(shù)astrin表達(dá) 在SGC-7901、MKN45兩種細(xì)胞的各處理組中均檢測(cè)到gastrin蛋白表達(dá)，pcDNA3.1-gastrin組較pcDNA3.1組gastrin表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2，表1。

M 標(biāo)準(zhǔn)分子量參照;1 pcDNA3.1-gastrin質(zhì)粒PCR產(chǎn)物圖1 pcDNA3.1-gastrin質(zhì)粒PCR 鑒定

1～3：Control組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-gastrin組，下圖同圖2 胃泌素在SGC-7901和MKN45細(xì)胞中的表達(dá)

表1 gastrin在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)

2.3gastrin對(duì)EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響 上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin在pcDNA3.1-gastrin組表達(dá)水平低于pcDNA3.1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；間質(zhì)標(biāo)志蛋白N-cadherin和相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子sail1在pcDNA3.1-gastrin組表達(dá)水平高于pcDNA3.1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示表明高表達(dá)gastrin可促進(jìn)EMT的發(fā)生，見表2，圖3。

2.4gastrin對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響 wnt3α、β-catenin 及其下游基因c-myc在pcDNA3.1-gastrin組表達(dá)上調(diào)，與pcDNA3.1組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示表明高表達(dá)gastrin可激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，見圖4，表3。

圖3 gastrin對(duì)EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響

表2 gastrin對(duì)EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白E-cadherin、N-cadherin和Snail表達(dá)的影響

圖4 gastrin對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響

表3 gastrin對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路標(biāo)志蛋白wnt3α、β-catenin 和c-myc表達(dá)的影響

3 討 論

胃癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率分別占全部腫瘤的第5位和第3位，其中，超過 70%的新發(fā)病例數(shù)發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，且以東亞地區(qū)為主〔8〕。中國(guó)屬于胃癌高發(fā)國(guó)家，每年的胃癌新發(fā)病例數(shù)約占世界的40%〔9〕。通常原發(fā)腫瘤所導(dǎo)致的死亡僅占腫瘤死亡的10%，大部分患者是死于腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移〔10〕。侵襲轉(zhuǎn)移是胃癌重要的病理學(xué)特征，也是其治療困難，預(yù)后不佳的主要原因之一，因此對(duì)胃癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移的研究極為重要。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，幽門螺桿菌感染、長(zhǎng)期使用質(zhì)子泵抑制劑導(dǎo)致的內(nèi)源性高胃泌素血癥及外源性gastrin在促進(jìn)胃腸道惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用〔11,12〕，已有研究證實(shí)gastrin能促進(jìn)胃腸腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移〔13〕，臨床上也已將血清gastrin作為胃癌及癌前疾病早期診斷的標(biāo)志〔14〕。對(duì)于大多數(shù)腫瘤來說，在其向惡性發(fā)展的過程中總伴隨著細(xì)胞向上皮分化能力的喪失，繼而向間質(zhì)樣表型轉(zhuǎn)化，發(fā)生EMT的細(xì)胞更容易遷移和侵襲，EMT通常被認(rèn)為是誘發(fā)腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的早期關(guān)鍵事件〔15〕。gastrin促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移是否與誘導(dǎo)EMT發(fā)生有關(guān)值得一步研究，因此本研究采用gastrin過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-gastrin轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株SGC-7901、MKN45，檢測(cè)過表達(dá)gastrin對(duì)EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)量的變化，在兩株細(xì)胞中一致發(fā)現(xiàn)gastrin可以引起E-cadherin表達(dá)下調(diào)，N-cadherin及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail表達(dá)上調(diào)。E-cadherin是上皮細(xì)胞間的連接結(jié)構(gòu)，負(fù)責(zé)將相鄰細(xì)胞相互錨定并形成黏附連接，其表達(dá)下調(diào)或功能異?？梢鹕掀ぜ?xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞間黏附減弱，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，從而發(fā)生EMT〔16〕。 Snail 是鋅指轉(zhuǎn)錄抑制因子家族中的一員，能強(qiáng)烈抑制E-cadherin mRNA 表達(dá)，通過促進(jìn)EMT 來影響生物胚胎發(fā)育和腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔17〕。N-cadherin是間質(zhì)細(xì)胞間的連接結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是間質(zhì)表型的標(biāo)志物，是細(xì)胞遷移的關(guān)鍵。E-cadherin的下調(diào)N-cadherin和Snail的上調(diào)可以認(rèn)為是EMT發(fā)生的標(biāo)志，因此，推測(cè)gastrin可能通過促進(jìn)EMT的發(fā)生來使胃癌細(xì)胞獲得遷移、侵襲的能力。

Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑是一類傳導(dǎo)生長(zhǎng)刺激信號(hào)的通路，由細(xì)胞外的Wnt蛋白、膜受體Frizzled、胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin 及下游的轉(zhuǎn)錄因子組成〔18〕。Wnt基因被異常激活，可抑制糖原合成激酶/結(jié)直腸腺瘤性息肉/軸蛋白(GSK3p/APC/Axin)復(fù)合物對(duì)β-catenin 的磷酸化，減少β-catenin的降解，使β-catenin在細(xì)胞內(nèi)聚積并向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF相互作用，調(diào)節(jié)眾多EMT相關(guān)蛋白如E-cadherin、Fibronectin、MMP7、Snail、Twist 等的表達(dá)誘導(dǎo)EMT發(fā)生〔19〕。β-catenin可與E-cadherin胞內(nèi)區(qū)結(jié)合形成P-catenin/E-cadherin復(fù)合體，再與肌動(dòng)蛋白骨架相連，減弱細(xì)胞間黏附，誘導(dǎo)腫瘤的EMT過程從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力〔20〕。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)高表達(dá)gastrin對(duì)wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因wnt3α、β-catenin、c-myc表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)胃泌素可使wnt3α、β-catenin 及其下游基因c-Myc表達(dá)上調(diào)，表明gastrin對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路有一定的活化作用，而胃泌素引起上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化可能與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活有關(guān)。