徐祖清 王詩洋 王梟 劉悅 金華

(1深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院，廣東 深圳 518000；2延邊大學(xué)附屬醫(yī)院)

橄欖苦苷(oleuropein)為環(huán)烯醚類葡萄糖苷，廣泛存在于木犀科植物中，在油橄欖葉中含量尤為豐富，具有器官保護(hù)、降血脂、降血壓、降血糖、解毒、抗氧化、抗炎及抗腫瘤等多種藥理作用〔1～3〕。近年來，橄欖苦苷對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用逐漸引起了人們的關(guān)注。橄欖苦苷對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，該作用與抑制炎性反應(yīng)有關(guān)〔4〕。此外，橄欖苦苷對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與減少自由基損傷及抗氧化作用有關(guān)〔5〕。本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)一步驗(yàn)證橄欖苦苷在保護(hù)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷作用的基礎(chǔ)上，著重研究該作用與神經(jīng)元凋亡及c-Jun氨基末端激酶(JNK)/促分裂素原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信號(hào)通路的關(guān)系，初步闡明作用機(jī)制，從而為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 清潔級(jí)Sprague Dawley(SD)大鼠70只，雄性，體重200～220 g，購自上海西普爾必凱公司。

1.2試劑 橄欖苦苷購于上海滬震公司，純度>95%；尼莫地平片為德國拜耳公司產(chǎn)品，規(guī)格為30 mg/片；2，5，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)由美國Sigma公司提供；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)測定試劑盒，大連寶生物公司。JNK、磷酸化(p)-JNK、p38及p-p38多克隆抗體，美國 Santa Cruz公司。

1.3儀器 MS-TS型分析天平，梅特勒-托利多(上海)公司；600-BS-Ⅱ型電熱恒溫干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；QuantstudioTMDX型定量PCR儀，美國ABI公司；Mini-3型垂直式蛋白電泳儀，美國 Bio-Rad公司。

1.4方法

1.4.1分組、給藥及腦缺血再灌注損傷大鼠模型建立 SD大鼠按體重隨機(jī)分為5組，即假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組(0.5 mg/kg)及橄欖苦苷高、低劑量組(40、20 mg/kg)，每組14只。連續(xù)灌胃給藥14 d，1次/d；末次給藥結(jié)束后1 h，將麻醉后的大鼠固定于手術(shù)臺(tái)。在頸部正中位置處切口，暴露頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，將ECA結(jié)扎使ECA主干一段游離。將CCA遠(yuǎn)心端結(jié)扎，近心端用動(dòng)脈夾夾閉。剪一小口于ECA上，通過ECA將尼龍線栓插入ICA，緩慢推進(jìn)約1 cm到達(dá)腦前動(dòng)脈(ACA)處。進(jìn)行2 h腦缺血后，將線栓抽出行再灌注24 h。假手術(shù)組無須插入尼龍線，其余步驟同上。

1.4.2神經(jīng)癥狀評分測定 參照Bederson法〔6〕開展神經(jīng)癥狀評分的測定。意識(shí)喪失或不能自發(fā)行走為3分；行走時(shí)向右側(cè)傾倒或向右側(cè)旋轉(zhuǎn)為2分；不能完全伸直右前肢為1分；神經(jīng)癥狀正常為0分。

1.4.3腦梗死面積測定 各組均取SD大鼠7只，在冰上迅速斷頭取腦，去除低位腦干、小腦和嗅球，由前向后行連續(xù)冠狀切片，在37℃下用2%TTC溶液避光染色30 min。染色后腦梗死組織呈白色，正常組織呈玫瑰紅色，利用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件測定腦梗死面積。

1.4.4大腦組織含水量測定 各組剩余SD大鼠，在冰上迅速斷頭取腦，將大鼠兩側(cè)大腦半球切開，左右各取兩側(cè)基底節(jié)區(qū)和皮層區(qū)兩個(gè)部位的腦組織200 mg，精密稱量濕質(zhì)量。在100℃烘箱中放置72 h，精密稱量干質(zhì)量，計(jì)算腦組織含水量。

1.4.5半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2及Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bax) mRNA表達(dá)測定 分離缺血側(cè)頂葉大腦皮質(zhì)約100 mg，Trizol法提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時(shí)定量qPCR所需引物由南京金斯瑞生物公司合成。Caspase-3引物序列為上游：5′-AGCTTCTTCAGAGGCGACTA-3′，下 游：5′-GGACACAATACACGGGATCT-3′；Bcl-2引物序列為上游：5′-GGTACCGGAGAGCGTTCAGT-3′，下 游：5′-CTGCTGCATTGTTCCCGTAG-3′；Bax引物序列為上游：5′-CGAGTGGTCTCCGGCGAATTG-3′，下 游：5′-ATGGTGAGCGAGGCGGTGAG-3′；內(nèi)參β-actin 引物序列為上游：5′-CACCCTGTGCTGCTCACCGAGGCC-3′，下 游：5′-CCACACAGATGACTTGCGCTCAGG-3′。實(shí)時(shí)定量qPCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，通過2-ΔΔCt值計(jì)算各組mRNA相對表達(dá)水平。

1.4.6JNK/p38 MAPK信號(hào)通路蛋白表達(dá)測定 分離缺血側(cè)頂葉大腦皮質(zhì)約100 mg，液氮中研磨后加預(yù)冷的組織裂解液，裂解30 min，離心(12 000 r/min，10 min)，保留上清液。BCA法對蛋白含量進(jìn)行測定，煮沸變性后，加上樣緩沖液。經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上；脫脂奶粉封閉后，分別加入JNK、p-JNK、p38及p-p38多克隆抗體，結(jié)合后再加入相應(yīng)的二抗。顯色、曝光后，拍照，分析各條帶光密度值，計(jì)算各組目的蛋白相對表達(dá)量。

1.5數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì) 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1橄欖苦苷對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)癥狀評分的影響 假手術(shù)組大鼠神經(jīng)癥狀正常，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)癥狀評分顯著增加〔(0.00±0.00)分 vs (2.55±0.34)分；P<0.05〕，表明大鼠腦缺血再灌注損傷模型建立成功。與模型組比較，尼莫地平及橄欖苦苷高、低劑量組大鼠神經(jīng)癥狀評分均顯著降低〔(1.32±0.17)分、(1.56±0.21)分、(1.81±0.18)分；P<0.05〕。

2.2橄欖苦苷對腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死面積的影響 假手術(shù)組大鼠未出現(xiàn)腦梗死，而模型組大鼠有明顯的腦梗死發(fā)生，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死面積顯著增加(P<0.05)，進(jìn)一步提示大鼠腦缺血再灌注損傷模型建立成功。與模型組比較，尼莫地平及橄欖苦苷高、低劑量組腦梗死面積均顯著降低(P<0.05)。見圖1及表1。

圖1 橄欖苦苷對腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死面積的影響

2.3橄欖苦苷對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織含水量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組腦組織含水量顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，尼莫地平及橄欖苦苷高、低劑量組腦組織含水量均有不同程度的降低，其中尼莫地平及橄欖苦苷高劑量組降低幅度顯著(P<0.05)。見表1。

表1 各組腦梗死面積及腦組織含水量比較

2.4橄欖苦苷對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織Caspase-3、Bcl-2及Bax mRNA表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組腦組織Caspase-3及Bax mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05)，而Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，尼莫地平及橄欖苦苷高、低劑量組腦組織Caspase-3及Bax mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)，而Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)。見表2。

表2 橄欖苦苷對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織Caspase-3、Bax及Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

2.5橄欖苦苷對腦缺血再灌注損傷大鼠JNK/p38 MAPK信號(hào)通路的影響 假手術(shù)組p-JNK及p-p38蛋白低水平表達(dá)，與假手術(shù)組比較，模型組p-JNK及p-p38蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)，提示模型組大鼠JNK/p38 MAPK信號(hào)通路處于活化狀態(tài)；與模型組比較，尼莫地平及橄欖苦苷高、低劑量組p-JNK及p-p38蛋白均顯著降低(P<0.05)，見圖2、表3。

1～5:假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、橄欖苦苷高劑量組、橄欖苦苷低劑量組圖2 橄欖苦苷對腦缺血再灌注損傷大鼠JNK/p38 MAPK信號(hào)通路的影響

表3 橄欖苦苷對腦缺血再灌注損傷大鼠JNK/p38 MAPK信號(hào)通路的影響

3 討 論

腦血管疾病以高發(fā)病率、 高死亡率、高致殘率及高復(fù)發(fā)率為特點(diǎn)，為中老年人的常見疾病，是導(dǎo)致人類死亡的三大疾病之一〔7〕。腦血管疾病以腦卒中為主，其中80%患者為缺血性腦卒中，且該病近年來呈顯著上升趨勢，嚴(yán)重影響著人們的生活水平和生活質(zhì)量〔8〕。腦缺血再灌注損傷是指血流再灌注后，進(jìn)一步加重缺血性損傷的現(xiàn)象，而緩解此過程具有重要意義〔9〕。本研究結(jié)果表明橄欖苦苷具有保護(hù)腦缺血再灌注損傷的作用。

腦缺血再灌注損傷機(jī)制涉及細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、能量代謝障礙、興奮性氨基酸毒性等，是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，其中腦組織內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致再灌注損傷的重要機(jī)制之一〔10〕。研究發(fā)現(xiàn)〔11〕，發(fā)生腦缺血再灌注損傷時(shí)，凋亡細(xì)胞大量出現(xiàn)并伴隨著損傷的加重呈逐漸增多趨勢。Caspase家族與Bcl-2家族基因共同參與了由線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞 “內(nèi)源性途徑”凋亡過程。Caspase家族是細(xì)胞凋亡過程中重要的蛋白酶，其中Caspase-3在凋亡進(jìn)行中扮演核心角色，抑制Caspase-3的表達(dá)對改善腦神經(jīng)功能及降低腦血再灌注損傷具有積極的意義〔12〕。Bcl-2家族包括抗凋亡基因和促凋亡基因兩大類，在腦缺血再灌注損傷中，抗凋亡基因Bcl-2被抑制，促凋亡基因Bax被活化，均有利于誘導(dǎo)缺血性神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡〔13，14〕。本研究結(jié)果表明橄欖苦苷具有抑制腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)元凋亡作用。相關(guān)研究表明〔15〕，在腦缺血再灌注損傷中，MAPK信號(hào)通路尤為關(guān)鍵。近年來的研究也證實(shí)〔16〕，MAPK信號(hào)通路的相關(guān)蛋白JNK和 p38幾乎參與了缺血性腦損傷的全部生理、病理過程，因而JNK/P38 MAPK信號(hào)通路在腦缺血再灌注損傷中的作用至關(guān)重要。JNK/p38 MAPK信號(hào)通路的活化，有助于神經(jīng)元凋亡的發(fā)生，而阻斷該信號(hào)通路，對緩解腦缺血再灌注損傷具有重要意義〔17〕。研究發(fā)現(xiàn)〔18〕，抑制JNK/p38 MAPK信號(hào)通路中JNK 和p38的磷酸化并降低p-JNK、p-p38蛋白含量，是全反式維A酸保護(hù)大鼠腦缺血再灌注損傷作用的主要機(jī)制。沒食子酸丙酯對腦缺血再灌注模型大鼠神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用也與抑制JNK/p38 MAPK信號(hào)通路的激活有關(guān)〔19〕。本研究結(jié)果表明橄欖苦苷具有抑制腦缺血再灌注損傷大鼠JNK/p38 MAPK信號(hào)通路活化的作用。

綜上所述，橄欖苦苷對大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，該作用與抑制JNK/p38 MAPK信號(hào)通路的活化進(jìn)而減少神經(jīng)元凋亡有關(guān)。