王茜 李明澤 張晗 張琳 章瑩 程峣 袁燕 李思成 趙宇 廖鑫 高琳

(遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563003)

研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病的癥狀是由于骨骼肌和脂肪細胞在最早階段胰島素信號傳導減弱使葡萄糖攝取減少導致攝取葡萄糖的能力受損所引起的〔1,2〕，而磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路是胰島素在葡萄糖代謝過程中最主要信號通路。新型飽食分子蛋白(nesfatin-1)作為一種新型的代謝調控因子，參與調節(jié)胰島素分泌，是一種葡萄糖反應性的胰島素抵抗肽，可以通過外周的潛在作用調控葡萄糖穩(wěn)態(tài)和全身能量平衡在糖脂代謝和糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)展中起關鍵調節(jié)作用〔3,4〕。nesfatin-1同胰島素可能存在協(xié)同作用，并具有類胰島素樣作用〔5〕。nesfatin-1的表達、分泌和(或)作用的功能障礙在與胰島素抵抗及胰島素信號通路相關的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用，但其是否是通過 PI3K/AKT 信號通路調節(jié)外周組織骨骼肌糖代謝及胰島素抵抗的研究未見報道。本研究通過前期構建的骨骼肌細胞胰島素抵抗模型，體外給予腺病毒空載體、nesfatin-1過表達腺病毒載體，分析nesfatin-1表達變化對骨骼肌胰島素抵抗及對PI3K/AKT信號通路中下游指標糖原合成酶激酶(GSK)-3β、 葡萄糖轉運蛋白(GLUT)-4的影響，初步探討nesfatin-1在胰島素抵抗骨骼肌PI3K/AKT信號通路中可能的分子機制，旨在為防治糖尿病及胰島素抵抗相關的代謝性疾病提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1細胞與主要試劑 棕櫚酸(PA)溶于0.1 mol/L氫氧化鈉(NaOH)中，加入小牛血清白蛋白(BSA)，配制成10%BSA，5 mmol/L PA終濃度的母液，-20℃保存，以備后用。L6大鼠成肌細胞購自中國科學院細胞庫；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、含乙二胺四乙酸(EDTA)的0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗購自Gibco公司；PA購自Aladdin試劑(上海)有限公司；重組人胰島素(Insulin)購自Solarbio公司；含nesfatin-1基因的重組腺相關病毒載體及空載對照(PC)腺相關病毒載體由南京申基生物科技有限公司設計構建；葡萄糖檢測試劑盒購自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；PI3K的催化亞基p110、磷酸化(p)-AKT(S473)、GSK-3β、GLUT4及內參甘油醛-3磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購自中國Proteintech公司。

1.2細胞分化及誘導 將復蘇后的 L6 細胞放入DMEM 培養(yǎng)基中，在適當條件下進行培養(yǎng)，細胞密度達到80%后更換為2%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基，待細胞逐漸行程規(guī)律性向同一邊生長的狀態(tài)，梭形為主，呈現(xiàn)肌形結構，誘導分化6～8 d，每2 d更換培養(yǎng)基，當細胞融合至80%～90%時，加入含 EDTA 的胰蛋白酶進行消化傳代。

1.3建立胰島素抵抗模型 本研究團隊前期將誘導分化后的細胞分為4組，正常對照組(control組)內加入不含胰島素的PA的緩沖液；PA 組加入250 μmol/L PA；Insulin 組加入100 nmol/L Insulin、 PA+Insulin 組加入250 μmol/L PA+100 nmol/L Insulin，待處理0 h、6 h、12 h、24 h后收集培養(yǎng)基上清，采用葡萄糖過氧化物酶方法測定上清液中葡萄糖含量，由于細胞上清液中葡萄糖含量越高代表胰島素抵抗越明顯，Insulin組與PA+Insulin組上清液葡萄糖含量在24 h時差值最大，提示胰島素抵抗效果逐漸明顯，故后續(xù)實驗處理時間選為24 h〔6〕。以此建立胰島素抵抗模型。

1.4細胞上清液葡萄糖含量檢測 將細胞通過離心、取沉淀、清洗、再離心、其沉淀、勻漿、孵育等過程，用分光光度計測定505 nm波長處吸光度，每組3個樣本，實驗重復3次，以此用葡萄糖過氧化物酶方法測定上清液中葡萄糖含量。

1.5L6細胞相關腺病毒感染及分組 取L6骨骼肌細胞均勻種植于12孔板，將過表達nesfatin-1和PC腺相關病毒原液1 μl加入細胞中，感染病毒約48 h后，將感染成功細胞分為空載對照腺相關病毒組(PC 組) 、PC+PA 組 、過表達nesfatin-1(OE)組和nesfatin-1+PA 組，各組均加入100 nmol/L Insulin，PC+PA 組和nesfatin-1+PA 組再加入250 μmol/L PA 處理24 h后收集培養(yǎng)基上清，采用葡萄糖過氧化物酶方法測定上清液中葡萄糖含量，用Western印跡檢測PI3K/AKT通路及其下游信號分子GSK-3β、GLUT-4的表達。

1.6Western印跡檢測細胞中相關分子的表達 將采用相關腺病毒感染處理后的L6 細胞加入RIPA 裂解液裂解細胞，提取細胞全蛋白，檢測蛋白濃度。各組蛋白樣品經(jīng)10% 聚丙烯凝膠電泳后轉膜封閉，一抗(1∶2 000)4℃過夜，二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h后，經(jīng)過TBST 洗4次，最后用電化學發(fā)光(ECL)系統(tǒng)進行曝光檢件檢測蛋白條帶的灰度值，以目的條帶和內參GAPDH條帶的比值作為蛋白表達水平。

1.7統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1nesfatin-1過表達腺病毒的驗證 OE組中nesfatin-1蛋白表達水平明顯高于PC組(2.67±0.31 vs 1.00±0.00，P<0.01)，nesfatin-1過表達腺病毒構建成功。見圖1。

2.2過表達nesfatin-1對葡萄糖的影響 PC+PA組上清液中葡萄糖含量〔(140.05±2.37)mmol/L〕明顯高于PC組〔(122.40±2.93)mmol/L,P<0.05〕；OE組上清液中葡萄糖含量〔(100.00±3.02)mmol/L〕明顯低于PC 組(P<0.05)；nesfatin-1+PA組上清液中葡萄糖含量〔(132.26±2.37)mmol/L〕明顯低于PC+PA組(P<0.05)，nesfatin-1+PA組上清液中葡萄糖含量明顯高于OE組(P<0.05)。

圖1 Western印跡法檢測nesfatin-1蛋白表達水平

2.3過表達nesfatin對PI3K、p-AKT、GSK-3β、GLUT-4的影響 各組PI3K蛋白表達水平均無明顯區(qū)別(P>0.05)； 與PC組比較，PC+PA組p-AKT、GSK-3β、GLUT-4蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)；與PC組比較，OE組p-AKT、GSK-3β、GLUT-4蛋白表達水平明顯增高(P<0.05)；與PC+PA組相比，nesfatin-1+PA組p-AKT、GSK-3β、GLUT-4蛋白表達水平明顯增高(P<0.05)；與OE組相比，nesfatin-1+PA組p-AKT、GSK-3β、GLUT-4蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)。見圖2、表3。

圖2 過表達nesfatin對PI3K、pAKT、GSK-3β、GLUT-4的影響

表3 過表達nesfatin-1對PI3K、p-AKT、GSK3β、GLUT-4的影響

3 討 論

骨骼肌是機體攝取葡萄糖最主要的組織，研究表明，葡萄糖在骨骼肌中轉運受損包括葡萄糖的傳遞、運輸和磷酸化，這些過程所導致的細胞損傷過程是引起外周胰島素抵抗的重要原因〔7〕，因此，骨骼肌是肥胖和胰島素抵抗的重要部位〔8〕。葡萄糖轉運到骨骼肌和脂肪細胞中的調節(jié)對于維持葡萄糖代謝和體內平衡是至關重要的〔9〕，所以推測改善骨骼肌胰島素的敏感性可能是治療2型糖尿病的有效方法。

nesfatin-1是由下丘腦室旁核、視上核、弓狀核、下丘腦外側區(qū)和脊髓神經(jīng)元及外周組織(胰腺、肝臟、皮下和內臟脂肪組織、褐色脂肪組織)和骨骼肌分泌，被認為能影響體內許多功能。nesfatin-1通過抑制食物攝入，對能量代謝產(chǎn)生調節(jié)作用，此外，它可作為一個神經(jīng)內分泌調節(jié)劑，調節(jié)心臟功能，降低血糖水平，并導致體重減輕，同時減少能量攝入〔10〕。2型糖尿病患者胰腺細胞中的nesfatin-1 mRNA的表達減少，妊娠糖尿病患者nesfatin-1也降低，在肥胖和糖尿病患者的中nesfatin-1的水平也明顯下降〔11～13〕，可以推測nesfatin-1與肥胖和胰島素抵抗可能存在一定的關系。Su等〔4〕通過外源注射nesfatin-1治療高血糖小鼠，結果顯示高血糖小鼠的血糖出現(xiàn)下降，證明nesfatin-1有降低血糖水平的作用。此外，Dore等〔14〕提出Nesfatin-1的降血糖作用是通過增加細胞對葡萄糖的攝取和通過提高胰島素敏感性抑制肝臟的葡萄糖異生作用介導的〔14〕，推測nesfatin-1是通過提高胰島素敏感性來改善2型糖尿病。證實nesfatin-1可增加骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取，減輕胰島素抵抗。

胰島素抵抗在2型糖尿病的發(fā)病和進展中起著至關重要的作用，這種作用通常是由于胰島素信號通路減弱所引起〔15,16〕，而PI3K/AKT信號通路是胰島素作用的最主要信號通路。針對nesfatin-1對PI3K/AKT信號通路的作用，Khalili等〔15〕證實，nesfatin-1可通過直接作用Ⅰ型鈣離子通道從而促進葡萄糖刺激的細胞分泌胰島素。在相關的動物實驗中發(fā)現(xiàn)，nesfatin-1可引起AKT磷酸化水平的增加，從而參與促進肌肉細胞葡萄糖攝取和葡萄糖轉運〔16〕。在喂食正常飼料的小鼠中，nesfatin-1可改善葡萄糖耐量，提高了AKT mRNA水平及骨骼肌中的磷酸化水平，在喂食高脂肪飲食小鼠中，nesfatin-1不僅能產(chǎn)生在喂食正常飼料小鼠中相同的作用，而且還抑制了食欲，提高了肝組織中的AKT水平〔17〕。中樞nesfatin-1可能通過激活胰島素受體(InsR)→InSr底物(IRS-1)→Akt信號通路級聯(lián)，促進肌肉葡萄糖攝取，從而增加胰島素敏感性〔18〕。中樞nesfatin-1表達下調能夠明顯抑制普食喂養(yǎng)或高脂喂養(yǎng)的大鼠肝臟AKT 磷酸化水平，推測中樞nesfatin-1的抑制可能是通過抑制InsR/IRS-1/AKT 胰島素信號作用通路從而促進機體胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展〔19〕。本實驗結果證實了上調nesfatin-1不僅能改善骨骼肌胰島素抵抗，而且這種作用可能是通過上調AKT磷酸化水平而完成。

GLUT-4是AKT的重要底物，是一種胰島素調節(jié)的葡萄糖轉運蛋白，主要存在于脂肪、骨骼或心臟組織中〔20〕。在骨骼肌中，發(fā)展胰島素抵抗和2型糖尿病的早期步驟是GLUT-4表達和易位的減少〔21〕，而PI3K/AKT信號通路在胰島素刺激的GLUT-4易位中起關鍵作用，并且該級聯(lián)的損傷導致胰島素誘導的葡萄糖轉運至肌細胞的數(shù)量減少，進而導致胰島素抵抗和2型糖尿病〔22〕。GLUT-4的表達失調或功能受損可引起胰島素抵抗，所以GLUT-4被認為是2型糖尿病的潛在治療靶點。本實驗結果表明，在存在胰島素抵抗的骨骼肌細胞中，通過過表達nesfatin-1，發(fā)現(xiàn)不僅AKT磷酸化水平增高，而且AKT底物GLUT-4亦出現(xiàn)增高，推測nesfatin-1對胰島素抵抗及血糖的調節(jié)可能是通過上調AKT的磷酸化及GLUT-4的表達來實現(xiàn)的。有學者認為nesfatin-1對葡萄糖代謝的影響與AKT和GLUT-4有關〔19〕，本實驗結果與之相一致。在PI3K/AKT信號通路下游的GSK-3β是調節(jié)糖原合成的重要底物，本實驗結果亦證實，過表達nesfatin-1均可上調p-AKT及下游的GSK-3β的表達，由此可以推測，GSK-3β可能是nesfatin-1改善骨骼肌細胞胰島素抵抗作用的一個靶點。

但是本實驗對PI3K蛋白的檢測各組間均無明顯差異，考慮nesfatin-1可能對PI3K/AKT通路的影響是直接激活Akt及下游底物GLUT4和GSK-3β，對上游的PI3K無作用。而且本實驗只采用了nesfatin-1過表達腺病毒載體，未使用nesfatin-1表達抑制腺病毒載體，存在部分缺陷，所以本研究團隊接下來將進一步通過轉染nesfatin-1表達抑制腺病毒載體，并使用該通路的激動劑及抑制劑，更全面的研究其與該通路的關系。

綜上所述，過表達nesfatin-1可顯著增加細胞對葡萄糖的攝取，減輕胰島素抵抗，同時能夠刺激Akt磷酸化，上調下游糖代謝相關的GSK-3β、GLUT-4的表達。