楊志虹 楊孝芳 易瑋 崔瑾 陳波 陳盼碧 張寧

(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)針灸康復(fù)臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006；2貴州中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院)

衰老是許多病理、生理和心理過程綜合作用的必然結(jié)果，是個體生長發(fā)育最后階段的生物學(xué)心理學(xué)過程〔1〕。中國現(xiàn)已成為世界第二大經(jīng)濟體，老齡化是社會經(jīng)濟發(fā)展的必然趨勢，由老齡化所帶來的一系列問題對中國經(jīng)濟社會的發(fā)展有一定的阻礙作用〔2〕。隨著人口老齡化日益加重，衰老性疾病逐漸突出，國內(nèi)外抗衰老的研究一直圍繞著尋求簡單、經(jīng)濟、便捷的抗衰老方法的思路在進(jìn)行。本實驗擬通過觀察艾灸神闕穴對D-半乳糖所致衰老模型小鼠腦組織中B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(bcl-2)、bcl-2相關(guān)的X基因(bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶(caspase)-3、p53的表達(dá)，探索艾灸神闕穴調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用及延緩衰老的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 健康2月齡昆明雄性小鼠18只，體重(30±2)g，重慶騰鑫科技有限公司提供〔SCXK(軍)2012-001〕，將其隨機分為青年組、衰老模型組、艾灸組，每組6只，各組動物在同等條件下常規(guī)喂養(yǎng)，實驗室光照充足，通風(fēng)良好，溫度保持在(22±4)℃，濕度保持在50%～70%。

1.2實驗試劑 組織蛋白抽提試劑盒，BCA蛋白定量試劑盒，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒，電化學(xué)發(fā)光(ECL)高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(康為世紀(jì)公司)；ECL低背景學(xué)發(fā)光檢測試劑盒；bax一抗、bcl-2一抗、caspase-3一抗、p53一抗(蘇州睿瀛生物技術(shù)有限公司)。

1.3造模方法 參考秦紅兵等〔3〕方法，衰老模型組和艾灸組每日頸背部皮下注射D-半乳糖120 mg/kg，連續(xù)注射42 d。

1.4腧穴定位及艾灸方法 定位：神闕穴的定位方法參照文獻(xiàn)〔4〕及擬人比照法，即神闕：臍中央。取小鼠胸腹正中，胸骨柄上緣至外生殖器上3/4與下1/4交點處。

艾灸方法：艾灸組：從模型復(fù)制的第15天起開始施灸，在灸前用小鼠固定板將小鼠固定，用定制動物用艾條(直徑4 mm)點燃后直接置于小鼠神闕穴上方，距離小鼠皮膚2 cm，每次灸15 min，每日1次，每周連續(xù)施灸5 d后休息2 d再灸，連續(xù)4 w。

1.5Western印跡檢測小鼠腦組織bcl-2、bax、caspase-3、p53的蛋白表達(dá) 稱取組織塊，按照1∶99比例向抽提試劑中加入蛋白酶抑制劑，混勻制成工作液，按1∶10(g/ml)比例加入的組織蛋白抽提試劑，冰浴勻漿及超聲破碎；冰上孵育20 min后，10 000 r/min離心20 min，收集上清。使用BCA定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，按1∶5比例加入上樣緩沖液，混勻，沸水浴5 min，4℃保存?zhèn)溆谩DS-PAGE 電泳分離2 h，200 mA恒流，低溫轉(zhuǎn)膜2 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束，加入封閉液中，20 min；取二抗辣根過氧化物酶(HRP)至4 ml離心管中，再取一抗與二抗混勻，室溫孵育5 min，加入一步法抗體稀釋液(將一步法試劑盒中的10×洗液用蒸餾水稀釋成1×洗液)。將完成封閉的聚偏氟乙烯(PVDF)膜用漂洗液洗一次，5 ml×5 min，4℃孵育過夜。傾去抗體混合液，用洗液漂洗3次，5 ml×5 min。在反應(yīng)盒內(nèi)加入高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(康為世紀(jì)CW0049C)A液及B液各1 ml，混勻，放入PVDF膜，使膜表面與試劑充分接觸5 min進(jìn)行顯影。采用Gel-Pro analyzer4圖像分析軟件測定各帶的灰度值做定量分析，結(jié)果以β-actin 為內(nèi)參對照，以目的蛋白/β-actin的積分光密度值的比值作為該目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計分析 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析和非參數(shù)秩和檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組bcl-2、bax蛋白表達(dá)比較 衰老模型組和艾灸組bcl-2蛋白表達(dá)較青年組顯著降低(P<0.001，P<0.01)，艾灸組的bcl-2蛋白表達(dá)較衰老模型組顯著升高(P<0.001)；衰老模型組和艾灸組的bax蛋白表達(dá)較青年組顯著升高(P<0.001，P<0.01)，艾灸組bax蛋白表達(dá)較衰老模型組顯著降低(P<0.01)。見表1、圖1、圖2。

表1 各組bcl-2、bax蛋白表達(dá)比較

圖1 Western印跡檢測bcl-2蛋白表達(dá)

2.2各組caspase-3、p53蛋白表達(dá)比較 衰老模型組和艾灸組的caspase-3和p53蛋白表達(dá)較青年組顯著升高(P<0.001，P<0.01，P<0.05)，艾灸組caspase-3和p53蛋白表達(dá)較衰老模型組顯著降低(P<0.01，P<0.05)。見表2、圖3、圖4。

圖2 Western印跡檢測Bax蛋白表達(dá)

表2 各組caspase-3、p53蛋白表達(dá)

圖3 Western印跡法檢測caspase-3蛋白表達(dá)

圖4 Western印跡檢測p53蛋白表達(dá)

3 討 論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為臍為先天之結(jié)蒂、后天之氣舍，神闕穴對衰老的常見癥狀有明顯的改善作用，并能通過改善微循環(huán)、清除自由基、調(diào)節(jié)紅細(xì)胞免疫功能、調(diào)整性激素比例等方面延緩衰老的進(jìn)程〔5〕。

腦衰老是人體衰老的重要標(biāo)志，大腦是人體各器官中對氧需求最大的器官，腦的重量雖然只占了體重的2%～3%，而耗氧量卻占人體總耗氧量的20%～30%，心臟輸出血量的15%都供給了腦〔6〕，若腦的供血不足，可造成腦組織凋亡細(xì)胞增多，加速衰老進(jìn)程，所以抗衰老可從延緩腦的衰老開始。建立衰老模型是研究衰老機制的前提，D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型小鼠可產(chǎn)生類似自然衰老的特征，廣泛應(yīng)用于衰老相關(guān)研究〔7〕，本課題通過查閱文獻(xiàn)借鑒成功建立了D-半乳糖所致衰老模型小鼠。

在衰老過程中細(xì)胞凋亡的發(fā)生也十分關(guān)鍵，bcl-2家族中最有代表性的抗凋亡蛋白bcl-2和促凋亡蛋白bax可共同激活促凋亡因子caspase-3和其家族的其他因子，引起衰老的發(fā)生〔8，9〕。bcl-2是重要的凋亡抑制基因，能阻遏多種刺激和損傷引起的細(xì)胞凋亡的發(fā)生，細(xì)胞存活；bax過量表達(dá)時，可自身結(jié)合成同源二聚體，促進(jìn)凋亡的發(fā)生〔10〕。轉(zhuǎn)錄因子p53是基因毒性應(yīng)激激活因子，它可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、凋亡和DNA修復(fù)〔11，12〕。研究發(fā)現(xiàn)，p53的功能已經(jīng)超出了觸發(fā)細(xì)胞周期阻滯和程序化細(xì)胞死亡的能力和新的活動，如調(diào)節(jié)新陳代謝、自噬和細(xì)胞的氧化狀態(tài)〔13〕。有研究表明，何首烏飲可通過上調(diào)衰老生精細(xì)胞bcl-2的表達(dá)、下調(diào)p53和bax的表達(dá)抑制生精細(xì)胞凋亡，發(fā)揮延緩生精細(xì)胞衰老的作用〔14〕；鼠尾草酸可顯著降低過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的衰老相關(guān)分子p53、p21和p16蛋白水平〔15〕，白藜蘆醇可通過抑制p53/p21及p16 (INK4a)/pRb信號通路拮抗H2O2所致細(xì)胞衰老，對氧化應(yīng)激環(huán)境中的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)細(xì)胞具有保護作用〔16〕。本實驗發(fā)現(xiàn)，對D-半乳糖所致衰老模型小鼠的神闕穴進(jìn)行艾灸后，其腦組織中bcl-2蛋白升高，而bax、caspase-3、p53的蛋白均降低，說明艾灸神闕穴可調(diào)控凋亡相關(guān)因子，這可能是艾灸神闕穴延緩衰老的途徑之一，也為中醫(yī)臨床延緩衰老提供了實驗依據(jù)。