王振國 黃譯瑩 涂常力 鄭曉濱

(中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 珠海 519000)

多年來，對肺炎球菌感染的控制主要著眼于早期診斷及抗生素治療，這在一定程度上改善了疾病的預(yù)后，但未能減輕疾病造成的整體經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，并使得細(xì)菌耐藥性增高〔1〕。近20年來，醫(yī)學(xué)界認(rèn)識到該病的控制需要一種能對公共衛(wèi)生產(chǎn)生廣泛影響的預(yù)防策略，并為達(dá)到這個目標(biāo)而多方努力地尋找一種有效的抗肺炎鏈球菌疫苗〔2〕。慢性阻塞性肺疾病(COPD)是成年人最常見的慢性疾病之一，與肺部對有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)，致殘率和病死率很高，將成為全球第3次致死病因，并且隨著社會的老齡化及環(huán)境污染的加劇，COPD的患病率還將持續(xù)上升〔3～5〕。目前使用的 23 價肺炎球菌莢膜多糖疫苗(PPV23)是1983年批準(zhǔn)上市的，建議用于高危成人及老年人。PPV23在高齡老年人及COPD病人中的臨床有效性仍有爭議，盡管大多數(shù)的病例對照及非直接隊列研究均提示對侵襲性肺炎球菌病有一定的效果，前瞻性的臨床試驗(yàn)及其 meta 分析均未能證明 PPV23在普通老年人及 COPD 病人中對肺炎球菌肺炎有顯著的保護(hù)作用〔6～10〕。而循證醫(yī)學(xué)協(xié)作組報告，雖 PPV23未能減少老年病人的肺炎發(fā)病率及相關(guān)性死亡，從觀察性研究獲得的證據(jù)表明 PPV23預(yù)防成人及非免疫缺陷老年人(≥65 歲)侵襲性肺炎球菌疾病(IPD)的有效性達(dá) 53%〔11〕。因此，Ochoa-Gondar 等〔9〕認(rèn)為，接種PPV23在老年慢性肺病患者應(yīng)答較差，有效性較低，但鑒于老年慢性肺病患者侵襲性肺炎球菌感染的后果及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，又缺乏更有效的疫苗，仍建議在這個人群中使用。由于 COPD 病人對PPV23免疫應(yīng)答的現(xiàn)有研究結(jié)果不一致，本研究通過觀察不同人群外周血單個核細(xì)胞(PBMC)對肺炎鏈球菌莢膜多糖反應(yīng)，從而評估不同人群對PPV23主動免疫應(yīng)答的真實(shí)情況。

1 資料與方法

1.1一般資料 以65歲為界分為老年及成人兩個亞組。成人COPD組15例，來自中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院呼吸內(nèi)科門診COPD穩(wěn)定期患者，男9例，女6例，年齡35～52歲，平均(44.5±10.7)歲，符合中華醫(yī)學(xué)會呼吸病協(xié)會制定的COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)；老年COPD組15例，來自中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院呼吸內(nèi)科門診COPD穩(wěn)定期患者，男10例，女5例，年齡66～82歲，平均(72.3±6.2)歲，符合中華醫(yī)學(xué)會呼吸病協(xié)會制定的COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)；健康成人組15例，男8例，女7例，年齡23～48歲，平均(28.4±8.6)歲，為中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院體檢為健康者。健康老年組15例，男8例，女7例，年齡66～78歲，平均(68.8±5.6)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有其他肺部疾病，嚴(yán)重的心功能不全，慢性肝、腎疾病，惡性腫瘤，自身免疫性疾病，先天性或獲得性免疫缺陷，接受系統(tǒng)性免疫調(diào)節(jié)或免疫抑制治療(包括口服糖皮質(zhì)激素)。無脾或脾切除術(shù)后。曾經(jīng)注射過肺炎鏈球菌疫苗。近1個月內(nèi)有感染性疾病病史。

1.2主要試劑及儀器 PPV23(紐莫法)(美國默沙東公司)；小牛血清(杭州四季清公司)；RPMI-1640(Gibco公司)；4-(2-羥乙基)-1哌嗪乙磺酸(HEPES)(MD公司)；淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司)；電熱恒溫干燥箱(寧波市鄞州邱隘佳諾自動化儀表廠)；環(huán)氧乙烷滅菌鍋(泉暉貿(mào)易國際有限公司)；XK97-2型雙向恒溫攪拌器(姜堰市新康醫(yī)療器械公司)；24孔培養(yǎng)板(美國Corning公司)；HERA Cell CO2培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1PBMC的分離 ①所有受試者取外周靜脈血10 ml，生理鹽水10 ml稀釋。②標(biāo)記各離心管，向10 ml離心管中加入3 ml 淋巴細(xì)胞分離液，加入稀釋后的靜脈血。1 700 r/min離心20 min以分離細(xì)胞。③吸出PBMC及部分血清，置另一潔凈離心管中。向離心管中加入6 ml NS液，混勻。1 000 r/min離心10 min 洗滌1次。倒置離心管，甩干上清，加入完全培養(yǎng)基1 ml吹打管底細(xì)胞混勻。

1.3.2PBMC的干預(yù)培養(yǎng) ①PBMC加入24孔板。設(shè)干預(yù)組及對照組，各培養(yǎng)組均設(shè)3個復(fù)孔，每孔細(xì)胞懸液PBMC數(shù)為1.5×106個，體積為800 μl。②在含5%CO237℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，取上清液測抗肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性免疫球蛋白(Ig)G、IgM抗體。并于抗原刺激孔添加稀釋疫苗溶液200 μl(PPV23終濃度為0.115 μg/ml)，對照孔添加生理鹽水200 μl，總體積均為1 ml，吹打混勻細(xì)胞懸液。在含5%CO237℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，再取上清液測抗肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性IgG、IgM抗體。

1.3.3間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測步驟〔12,13〕①包被：將11.5 μg/ml PPV23包被于聚苯乙烯ELISA板中，2孔加入不含疫苗的抗原稀釋液作為背景孔(無抗原孔)，加蓋封板膜，4℃冰箱過夜。②加實(shí)驗(yàn)室參考血清和待測樣本：加入PBMC培養(yǎng)上清液及倍比稀釋的實(shí)驗(yàn)室參考血清(8個濃度)，每孔50 μl，均設(shè)復(fù)孔,留2孔加入抗體稀釋液(無血清孔)。于溫育箱中37℃溫育60 min。③加酶標(biāo)工作液：加入稀釋至工作濃度辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗人IgG或IgM或IgA，每孔100 μl，留2孔加入抗體稀釋液(無二抗孔)。于37℃溫育箱中溫育60 min。④洗板：每次加洗滌液充分洗滌5次并充分拍板。⑤顯色：每孔先加入顯色劑 A 液(TMB) 50 μl，再加入顯色劑 B 液(H2O2)50 μl，溫育箱中溫育30 min。⑥終止：取出酶標(biāo)板，每孔加終止液50 μl，終止反應(yīng)(顏色由藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。⑦酶標(biāo)儀讀值：終止反應(yīng)后15 min在450和630 nm處的酶標(biāo)儀雙波長上讀出反應(yīng)孔的吸光度值。⑧計算：測定OD值=復(fù)孔算術(shù)平均值-最高空白對照值，最高空白對照值應(yīng)控制在0.01以下。根據(jù)倍比稀釋的實(shí)驗(yàn)室參考血清的濃度及對應(yīng)的 OD 值，使用CURVEEXPERT軟件來計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，再根據(jù)樣本的 OD 值(取復(fù)孔平均值)，在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品血清濃度與實(shí)驗(yàn)室參考血清抗體濃度的比值。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。

2 結(jié) 果

2.1PBMC體外培養(yǎng)上清液抗肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性抗體濃度(相對參考血清的抗體濃度比值×10-3) 4組PMBC在體外培養(yǎng)24 h后，疫苗干預(yù)前各組間抗肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性抗體IgG、IgM的產(chǎn)生無顯著差異(P>0.05)，見表1。

表1 疫苗刺激前各組抗體濃度的比較

2.2PPV23干預(yù)培養(yǎng)48 h后各組抗肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性抗體濃度的比較(相對參考血清的抗體濃度比值×10-3) 加PPV23培養(yǎng)48 h后，對比疫苗刺激前，對照組及干預(yù)組各組的抗肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性抗體均較前有下降。與對照組相比，疫苗刺激后4個干預(yù)組的抗肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性抗體濃度均明顯升高(P<0.05)。但是疫苗刺激后各分組間抗肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性抗體IgG、IgM的產(chǎn)生無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 疫苗刺激后各組抗體濃度的比較

3 討 論

肺炎鏈球菌感染是一個世界性問題，大于65 歲的老年人是罹病風(fēng)險最高的人群之一，尤其是當(dāng)患者合并有高危因素時。COPD 也是肺炎鏈球菌感染的常見高危因素。肺炎球菌莢膜多糖疫苗被建議用在老年人及COPD 病人，但其有效性一直存在爭議。有關(guān)老年人及COPD 病人對疫苗應(yīng)答差的原因，可能與免疫老化有關(guān)，并可能與機(jī)體老化過程中出現(xiàn)的免疫系統(tǒng)改變有關(guān)。臨床上對COPD患者的常規(guī)治療主要包括抗感染及解痙平喘氧療等對癥處理，隨著肺炎鏈球菌耐藥率的不斷提高，COPD患者抗感染治療的效果也不盡理想。為了減少COPD的急性發(fā)作，推薦對COPD患者進(jìn)行常規(guī)PPV23接種〔14〕。國外報道指出，接種PPV23 COPD患者的死亡率、并發(fā)癥、住院天數(shù)、發(fā)生呼吸衰竭的危險較低均較未接種者有下降〔15〕。

COPD患者多在40 歲以后出現(xiàn)癥狀。COPD 病人的主要呼吸生理改變也見于老年人，如小氣道阻塞、肺彈性下降及動態(tài)過度膨脹，且COPD 的發(fā)病率隨年紀(jì)而增加，提示機(jī)體老化可能是COPD 促進(jìn)因素，或COPD 是機(jī)體加速老化的表現(xiàn)，與機(jī)體老化相關(guān)的免疫系統(tǒng)重塑在慢性炎癥性疾病的發(fā)病中起重要的作用。有學(xué)者認(rèn)為COPD 不過是外界毒性刺激物觸發(fā)的加速的機(jī)體老化的一種表型〔16,17〕。有研究表明。隨著年齡增長，老年人免疫反應(yīng)有所下降。對比健康成年人，老年人對疫苗的免疫反應(yīng)有一定程度的降低〔18〕。

抗體的產(chǎn)生需要許多的信號和最適的認(rèn)知的相互作用，例如抗原提呈細(xì)胞、T細(xì)胞和B 細(xì)胞的受體參與。從外周血分離的PBMC是包含了這些細(xì)胞的。本研究結(jié)果顯示，PPV23干預(yù)培養(yǎng)48 h后各組抗肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性抗體濃度均較前有下降，考慮是隨著體外培養(yǎng)的時間增加抗體代謝消耗所致。而經(jīng)過PPV23刺激后，結(jié)果表明，人的PBMC仍有活力，可以繼續(xù)分泌抗體。

血清的抗體水平并不能準(zhǔn)確地代表最近免疫應(yīng)答，由于以前對抗原的暴露，可產(chǎn)生可溶的抗體，血清的抗體水平包括這些累積的可溶的抗體。我們的方法取PBMC,檢測其上清液分泌的抗體，更好地代表了宿主對疫苗的免疫應(yīng)答。