戈娜 林韋翰 黃靜婷 古秀芬 吳瑕

摘要 目的：應用網(wǎng)絡(luò)藥理技術(shù)，分析糖尿病腎病進展相關(guān)代謝物及其分子靶標和作用機制。方法：基于前期代謝組學篩選出的與糖尿病腎病進展高度相關(guān)的代謝物，使用京都基因與基因組百科全書（KEGG）、Pubchem數(shù)據(jù)庫，檢索提取與代謝物有關(guān)的有效靶標基因，并進行通路分析;采用Cytoscape3.2.1軟件Cluego進行代謝物基因靶標的通路、生物過程、細胞組分、分子功能進行富集分析，并繪制網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果：本研究共分析了31個與糖尿病腎病進展相關(guān)的代謝物;應用KEGG和Pubchem數(shù)據(jù)庫，共提取了31個代謝物，涉及代謝通路82條，涉及基因靶標252個;代謝物的基因靶標共涉及157條通路。代謝物基因靶標主要集中在谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等代謝物。基于代謝物-基因靶標網(wǎng)絡(luò)圖核心節(jié)點進行解析，提示谷氨酸是連線最多的節(jié)點，其次是酪氨酸、谷氨酰胺、色氪酸等;連線最多的通路包括糖酵解/糖異生，脂肪酸降解、基酸合成等;最集中的基因靶標為NOS2、NOS3、ALDH7A1等?；虬袠说母患治鼋Y(jié)果表明，代謝物基因靶標主要集中在氨基酸代謝、脂肪酸、氪代謝等?；虬袠松婕暗募毎M分分析提示糖尿病腎病進展主要與線粒體、突觸膜、突觸前膜等細胞部位異常有關(guān)。疾病進展涉及的分子功能包括氨基酸、羧酸、維生素拼接等。結(jié)論：通過對代謝物基因靶標進行深入的網(wǎng)絡(luò)分析提示，氨基酸代謝異常在糖尿病腎病進展中至關(guān)重要，是參與機體免疫代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵節(jié)點。

關(guān)鍵詞 糖尿病腎臟病;氨基酸代謝;分子網(wǎng)絡(luò)機制;靶標

中圖分類號：R285

文獻標識碼：A

doi：10.3969/[J].isn.1673-7202.2021.21.009

全球糖尿病及糖尿病腎病的發(fā)病率連年上升加重經(jīng)濟負擔，嚴重威脅人類健康。慢性腎臟?。–hronic Kidney Disease，CKD）是糖尿病的最主要并發(fā)癥之一，隨著糖尿病發(fā)病的不斷增加，CKD在成年糖尿病人群的發(fā)病率，20002007年逐年增加，并且中國糖尿病患者的CKD發(fā)病率（10.9%）顯著高于全球平均發(fā)病率。美國糖尿病協(xié)會（American Diabetes Association，ADA）指出，20%～40%的糖尿病患者將進展為CKD2。中國CKD患者的發(fā)病率從2010年的19.5%攀升至2015年的24.3%。CKD還是心血管疾病及過早死亡的危險因素。而2型糖尿病合并CKD患者的死亡風險是單純2型糖尿病或者單純CKD患者的2倍多。糖尿病是重要的代謝性疾病，疾病進展過程中存在明顯糖、脂、氨基酸、核酸代謝異常。腎臟是機體排泄代謝產(chǎn)物的重要器官，對機體的代謝調(diào)節(jié)有重要作用。機體代謝異常在糖尿病腎臟損傷過程中的作用機制尚不十分清楚。異常變化的代謝物是評估疾病的標志物，抑或是參與疾病進展的致病因素，尚不明確。我們前期應用代謝組學研究發(fā)現(xiàn)，在疾病進展過程中一系列氨基酸、脂肪酸、核酸代謝產(chǎn)物，隨疾病進展顯著異常。網(wǎng)絡(luò)藥理學是隨系統(tǒng)生物學發(fā)展而漸興之技術(shù)，其通過分析現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫的信息資料，結(jié)合實驗中獲取的數(shù)據(jù)，利用算法，系統(tǒng)、整體地揭示疾病疾病、疾病表型靶點蛋白、靶點蛋白-藥物、藥物-藥物之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系，從網(wǎng)絡(luò)層面解析分子靶標在疾病中的作用機制。

本研究擬應用網(wǎng)絡(luò)藥理學技術(shù)，對前期篩選出的與糖尿病腎病進展相關(guān)的代謝物進行基因靶標的提取，并基于京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）Pubchem數(shù)據(jù)庫對基因靶標涉及的通路及生物功能進行富集分析，以期進一步闡釋疾病進展過程中代謝物參與疾病進展的分子機制。

1資料與方法

1.1疾病進展相關(guān)代謝物基因靶標的提取及整理提取基因靶標數(shù)據(jù)庫包括：KEGG Compound Database（https：//www.kegg.jp/kegg/ccompound/）

Pubchem（https：//pubchnem.ncbl.nim.n將篩選出的與疾病進展相關(guān)代謝物以化合物名字和Inchikey為檢索詞，在Pubchem、KEGG數(shù)據(jù)庫中搜集與人類有關(guān)聯(lián)的糖尿病腎病代謝物基因靶標。應用KEGG數(shù)據(jù)庫，檢索與所有代謝產(chǎn)物相關(guān)的靶標基因，在檢索不到代謝產(chǎn)物的記錄時，參考Puchen內(nèi)該代謝產(chǎn)物所有同義詞，并在KEGG Compound Database內(nèi)進行檢索;所有檢索結(jié)果需要校對代謝產(chǎn)物的化學式，以確保代謝產(chǎn)物正確。依據(jù)Pubchem數(shù)據(jù)庫檢索所有疾病代謝產(chǎn)物，并收錄“Bioactivities'”選項下有效結(jié)果的靶標基因;將檢索KEGGCompoundDatabase與Pubchem數(shù)據(jù)庫所得結(jié)果匯總，刪除相同靶標基因。

1.2基于Cytoscape構(gòu)建代謝物、通路、基因靶標網(wǎng)絡(luò)圖將代謝物、基因靶標導入Cytoscape繪制代謝物-基因靶標網(wǎng)絡(luò)圖，分析基因靶標聚集情況。將代謝物輸人KEGG PATHWAY Database（htps：//ww.keg.jp/kegg/pathway.html），獲取代謝物參與通路情況。應用Cytocape繪制代謝物-通路網(wǎng)絡(luò)圖，明確代謝物參與通路情況。將代謝物、涉及通路、基因靶標統(tǒng)一導人Cytoscape，繪制代謝物通路-基因靶標網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3疾病進展相關(guān)代謝物基因靶標網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及富集分析將基因靶標導人Cytosacape3.7.2軟件，應用CLUEGO插件，選擇Homo Sapiens限定范圍，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)。應用基因本體（Gene Ontology，GO）生物過程（Bilogical Process，BP）或KEGG pathway進行通路分析及生物功能分析，獲取通路及生物功能可視化網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)圖中，P值越小，圓圈越大，圓圈節(jié)點代表代謝物相關(guān)的基因靶標，邊代表靶標之間的聯(lián)系。

2結(jié)果

2.1疾病進展相關(guān)代謝物的篩選基于課題組前期代謝組學結(jié)果，選取糖尿病腎病進展過程中與腎小球濾過率（Glomerular FiltrationRate，GFR）緊密相關(guān)的31種代謝物，分別為色氨酸、肉毒堿、葡萄糖、酪氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、硫酸脫氫表雄酮、甜菜堿羥丁酸、尿酸、γ丁酰甜菜堿、膽堿、苯丙氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、辛酰基肉毒堿、鳥氨酸、叫哚乙酸、馬尿酸、瓜氨酸、N.乙酰肌肽、犬尿氨酸、吲哚乳酸、硫酸吲哚酚、犬尿喹啉等。見表1。

2.2疾病進展相關(guān)代謝物基因靶標的提取及整理

31種代謝物中，在KEGG數(shù)據(jù)庫中共提取到269個基因靶標，在Pubchem數(shù)據(jù)庫中共提取69個，去掉代謝物之間重復及數(shù)據(jù)間重復的靶標，共計252個代謝物基因靶標。繪制代謝物與基因靶標相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，提示基因靶標主要集中在谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、膽堿、尿苷、肌苷、甲硫氨酸氨酸等代謝物。見圖1。

2.3疾病進展相關(guān)代謝物涉及的通路將31種代謝物輸人KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫，獲取代謝物涉及通路情況，發(fā)現(xiàn)31種代謝物共參與82條通路。繪制代謝物與通路間關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，提示谷氨酸涉及的通路最豐富，色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺次之。見圖2。

2.4疾病進展相關(guān)代謝物、基因靶標及靶標通路情況將31種代謝物的252種基因靶標輸入KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫，獲取代謝物基因靶標涉及通路情況，共獲取基因靶標通路157條。應用Cytoscape軟件構(gòu)建代謝物-基因靶標-通路圖?；诰W(wǎng)絡(luò)圖的連線Degree對圖中的核心節(jié)點解析提示，谷氨酸是連線最多的節(jié)點，其次是酪氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸;連線最大的通路為糖酵解/糖異生脂肪酸降解、氨基酸合成、煙酰胺代謝、視黃醇代謝tRNA生物合成、丙酮酸代謝;最集中的基因靶標為NOS2、NOS3、ALDH7A1、PLD1、GOT2、ALDH9A1等。

見圖3。

2.5疾病進展相關(guān)代謝物基因靶標富集分析

2.5.1基因靶標涉及通路富集分析使用Cytoscape的插件Cluego對基因靶標進行富集分析，通路的富集結(jié)果表明，與腎病進展相關(guān)代謝物的基因靶標主要集中在氨基酸代謝、脂肪酸、氮代謝、核酸代謝方面，其中色氨酸代謝、脂肪酸降解、嘧啶代謝、酪氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝靶標最為豐富。見圖4。

2.5.2基因靶標涉及BP富集分析BP富集結(jié)果

表明，與腎病進展相關(guān)的代謝物基因靶標主要集中在細胞的氨基酸代謝、小分子代謝、有機酸代謝、有機氮復合物代謝等。見表2，圖5。

2.5.3基因靶標涉及細胞組分富集分析細胞組分（Cellular Component，CC）的富集結(jié)果表明，疾病進展代謝物基因靶標涉及的細胞部位包括：線粒體突觸膜、突觸前膜、突觸、軸突末端、終扣、樹突胞質(zhì)、過氧化物酶體、質(zhì)膜、外側(cè)瞄蛋白成分等細胞部位。見圖6，表3。

2.5.4基因靶標涉及分子功能富集分析分子功能（Molecular Function，MF）富集分析結(jié)果提示氨基酸、羧酸、維生素拼接，轉(zhuǎn)移酶活性、配體活性、谷氨酸受體活性、NAD活性、氧化還原酶活性、肉毒堿乙?；D(zhuǎn)移酶活性變化均與糖尿病腎病進展過程相關(guān)。見表4，圖7。

3討論

本研究在前期研究基礎(chǔ)上，篩選出31種與糖尿病腎病患者GFR下降密切相關(guān)的代謝物，基于KEGG、Pubchem數(shù)據(jù)庫，提取代謝物的活性基因靶標。采用KEGG通路分析及Cytoscape插件CLUEGO進行基因靶標的分析。

本研究發(fā)現(xiàn)，提取的糖尿病腎病進展相關(guān)代謝物基因靶標主要集中在谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、膽堿、尿苷、肌苷、甲硫氨酸氨酸等代謝物。基于代謝物-基因靶標-網(wǎng)絡(luò)圖的關(guān)聯(lián)度對圖中的核心節(jié)點進行解析，提示谷氨酸是連線最多的節(jié)點，其次是酪氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸;連線最多的通路為糖酵解/糖異生，脂肪酸降解、氨基酸合成、煙酰胺代謝、視黃醇代謝、RNA生物合成、丙酮酸代謝;最集中的基因靶標為NOS2、NOS3、ALDH7A1、PLD1、GOT2、ALDH9A1等。

基因靶標的富集分析結(jié)果表明，與腎病進展相關(guān)代謝物的基因靶標主要集中在氨基酸代謝、脂肪酸、氮代謝、核酸代謝方面，其中色氨酸代謝、脂肪酸降解、嘧啶代謝、酪氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝靶標最為豐富。BP方面，與腎病進展相關(guān)的代謝物基因靶標主要集中在細胞的氨基酸代謝小分子代謝、有機酸代謝、有機氮復合物代謝等?；虬袠松婕暗腃C分析提示糖尿病腎病進展主要與線粒體、突觸膜、突觸前膜、突觸、軸突末端、終扣、樹突胞質(zhì)、過氧化物酶體、質(zhì)膜、外側(cè)瞄蛋白成分等細胞部位異常有關(guān)。疾病進展涉及的MF包括氨基酸、羧酸、維生素拼接，轉(zhuǎn)移酶活性、配體活性、谷氨酸受體活性、NAD活性、氧化還原酶活性、肉毒堿乙?；D(zhuǎn)移酶活性變化均與糖尿病腎病進展過程相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)異常的氨基酸代謝參與糖尿病腎病的進展過程，該結(jié)果與近年來報道的氨基酸具有調(diào)節(jié)中樞能量代謝、氧化還原平衡、表觀遺傳修飾的作用相一致。研究發(fā)現(xiàn)，機體循環(huán)氨基酸可以作為2型糖尿病患者大血管、微血管、全因死亡的危險因素。低濃度的酪氨酸是獨立于腎功能損傷以外的預測2型糖尿病患者微血管并發(fā)癥的標志物。氨基酸參與機體細胞功能的發(fā)揮，促進機體ATP生成核苷酸合成及氧化還原平衡的維持。氨基酸同時參與機體免疫細胞功能的調(diào)節(jié)，參與癌癥、感染以及代謝性疾病的發(fā)生。氨基酸代謝促進糖酵解和TCA循環(huán)，以及線粒體脂肪酸氧化（FAO），進一步推動線粒體代謝和ATP的產(chǎn)生，谷氨酰胺支持代謝重構(gòu)，參與Th1和Th17細胞的分化調(diào)節(jié)”。此外，支鏈氨基酸可通過刺激葡萄糖攝取促進糖酵解以支持免疫細胞的代謝重編程）。絲氨酸也促進線粒體代謝。氨基酸調(diào)控機體氧化還原代謝，對維持氧化還原平衡至關(guān)重要。代謝物基因靶標CC分析的結(jié)果提示線粒體、突觸、軸突、終扣、樹突等細胞部位富集顯著，提示糖尿病腎病進展過程中，突觸傳遞、樹突、軸突等神經(jīng)遞質(zhì)信號傳遞起重要作用。近年發(fā)現(xiàn)，氨基酸及其代謝物除了參與機體免疫代謝調(diào)節(jié)，其下游代謝物多為神經(jīng)遞質(zhì)，參與神經(jīng)傳導，是免疫介導的重要物質(zhì)，參與機體的免疫代謝。諸如色氨酸下游的血清素、褪黑素、犬尿氨酸、犬尿喹啉酸、喹啉酸，酪氨酸下游的多巴胺、去甲腎上腺素、腎上腺素，組氨酸下游的組胺，谷氨酸下游的GABA等均可由免疫細胞分泌，調(diào)節(jié)機體的炎癥狀態(tài)，參與免疫相關(guān)疾病的發(fā)生綜上所述，通過對代謝物基因靶標進行深入的網(wǎng)絡(luò)分析提示，氨基酸代謝異常在糖尿病腎病進展中至關(guān)重要，是參與機體免疫代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵節(jié)點。

參考文獻

[1]CarracherAM，MarathePH，CloseKL.InternationalDiabetesFederation2017[J].JDiabetes，2018，10（5）：353-356

[2]AmericanDiabetesAssociation.10.MicrovascularComplicationsandFootCare：StandardsofMedicalCareinDiabetes-2018j1DiabetesCare，2018，41（Suppl1）：Sl05-S118